Wir danken Dr. Shirin Bonni für die Bereitstellung der PSIL-GFP-Konstrukt, Dr. Alper Uzun für die Darstellung von 1, und die Leduc Bioimaging Anlage für die konfokale Mikroskopie. EMM wird durch den Career Award für die medizinische Wissenschaft von der Burroughs Wellcome Fund, ein NARSAD Young Investigators Award und NIH NCRR Cobre RR018728 P20-01 unterstützt. SBL wird durch NIH P20 NCRR Cobre RR018728-01 unterstützt wird, und erhielt Unterstützung von PHS NRSA 5T32MH019118-20.

1. Vorbereiten Kultur-Lösungen und Medien (nicht im Video) <ol><li> Planen 1 Liter physiologischer Kochsalzlösung vollständiger Hanks-Lösung (HBSS) mit 1x HBSS, 2,5 mM Hepes (pH 7,4), 30 mM D-Glucose, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4 und 4 mM NaHCO 3. Fügen Sie doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O). Filter mit einem 0,2-um-Filter und Speicher bei 4 ° C sterilisieren </li><li> Slice Kulturmedium unter Verwendung von 35 ml Basal Medium Eagle Medium, 12,9 ml vollständigem HBSS, 20 mM D-Glucose (1,35 ml 1 M Lösung), 1 mM Glutamax (0,25 ml einer 200 mM Lösung), 0,5 ml Penicillin Streptomycin-100x Lager. Filter sterilisiert mit einer 0,2-um-Filter, fügen hitzeinaktiviertem Pferdeserum bis zu einer Endkonzentration von 5%. </li><li> Planen Laminin Arbeitslösung durch Herstellung einer 1 mg / ml Stammlösung Laminin mit sterilem destilliertem entionisiertem Wasser. Es werden 100 ul Aliquots in 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen und bei -80 ° C einfrieren </li><li> Planen Poly-L-Lysin arbeiten, sosung durch Zugabe von 5 ml sterilem H 2 O bis 5 mg Poly-L-Lysin zu einer 1 mg / ml Stammlösung zu machen. Bereiten Sie 1 mL Aliquots und bei -20 ° C. </li><li> Planen Beschichtungslösung durch Verdünnen von 1 ml Poly-L-Lysin und 100 ul Laminin auf ein Endvolumen von 12 ml mit sterilem Wasser. Machen Sie diese Lösung jedes Mal frisch. </li></ol> 2. Vorbereiten organotypischen Inserts (nicht im Video) <ol><li> Bereiten Sie zwei Sechs-Well-Platten mit einem Kultur-Einsatz pro Loch mit einer sterilen Pinzette. Geben Sie 2 ml steriles ddH 2 O unter den Kultur-Einsätze. </li><li> 1 ml der Beschichtungslösung auf der Oberseite der Membran dabei nicht Punktion der Membran. Inkubieren über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Entfernen Beschichtung Medien und Waschen Sie die Membran mit sterilem H 2 0 dreimal. Lassen Einsätze vor Gebrauch trocknen. In 1,8 ml Slice Kulturmedium und in 37 ° C-Inkubator. Wickeln Sie die nicht verwendeten Platten mit Parafilmund lagern bei 4 ° C für bis zu 4 Wochen. </li></ol> 3. Vorbereitung für die Elektroporation (nicht im Video) <ol><li> Bereiten Sie RNAi-Konstrukten für die Elektroporation. Doppel-Strang-RNA-Haarnadel-Einsätze wurden in ein pSilencer kloniert. Das Plasmid enthält: 1) eine U6-Promotor, der die Doppelstrang-RNA-Generation antreibt; und 2) eine GFP-Expression Kassette durch den CMV-Promotor 8,9 angetrieben. Dieses Plasmid wurde zuvor von Konishi et al 9 und andere 7,8 beschrieben. Plasmide werden unter Verwendung eines Qiagen Maxi-Prep-Kit, und bei einer Konzentration von 1 mg / ml. </li><li> Um DNA sichtbar während der Injektion ist, bereiten Sie einen 0,5% schnell grünen Farbstoff-Lösung und nutzen es um 1:20 mit der DNA, die injiziert (in der Regel 20 uL von DNA mit 1 ul schnell grün) werden. Links über DNA-grünen Farbstoff schnell Mischung kann bei -20 ° C bis zu einer Woche aufbewahrt werden. </li><li> Saubere Dissektion Bereich, dissecting Werkzeuge und Vibratom Gefäß mit 70% Ethanol. Entspannen komplette HBSS, so dass es eiskalt ist. Gefühlt Vibratom Schiff durch die Verpackung Eis um es im Inneren des Vibratom mit etwas Wasser zum raschen Abkühlen. Bereiten Sie 3% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt mit kompletten HBSS. Mikrowelle für 1 min. Vermeiden Sie zu kochen. An einem 42 ° C im Wasserbad bis zum Gebrauch. </li><li> Die Elektroporation Parameter sind wie folgt festgelegt. Für einen Einsatz E15 Embryo 35 V, 5 Impulse, Länge 100 ms, 900 ms Intervall zwischen den Impulsen. Für ältere Tiere, die Elektroporation gewährleisten, verwenden Sie eine höhere Spannung bis 50 V oder erhöhen Sie die Anzahl der Impulse bis zu 8 Impulse. Um eine Beschädigung des Gewebes bei jüngeren Tieren, verwenden Sie entweder weniger Impulse oder bis zu 2 Pulse und niedrigere Spannung bis zu 25 V. Diese Parameter können variiert werden und empirisch ermittelt abhängig von dem Alter des Tieres. </li></ol> 4. Dissection und Elektroporation (im Video) <ol><li> Nach Tötung einer schwangeren Frau, sezieren Embryonen aus in eiskaltes komplette HBSS. Keep jeder Embryo in ihrer individuellen Plazenta-Säcke. </li><li> Sezieren Embryo aus und schnitt den Kopf nach dem ersten Wirbel. Halten Sie in eiskaltem HBSS komplette. </li><li> Für die Injektion setzen Sie den Kopf auf einem Stück Parafilm auf einer Petrischale. Mit maßgeschneiderten Hamilton-Spritze (siehe Tabelle I) injizieren etwa 6 bis 8 &amp;mgr; l DNA: schnell grünen Farbstoff-Mix durch den dritten Ventrikel, um in beiden Seitenventrikel in den kortikalen Vesikel zu füllen. Alternativ kann eine Injektion direkt in jedes lateralen Ventrikel durchgeführt werden. </li><li> Für die Ex-vivo-Elektroporation, verwenden BTX-Pinzette Platinelektroden. Legen Sie die positive Elektrode auf der Seite des Kortex Sie wollen also oben auf dem Kopf für die dorsale Kortikalis elektroporieren. </li><li> Nach der Elektroporation, bebrüten die Köpfe auf Eis für mindestens 5 Minuten vor dem Sezieren. </li><li> Gehirne sezieren in eiskaltem HBSSby er einen kleinen Schnitt an der Seite des Kopfes und Peeling die Haut von den Seiten des Kopfes. Als nächstes wird mitfeinen Pinzette vorsichtig ablösen, der pia aus dem Gehirn. Entfernen Sie das intakte Gehirn aus dem Schädel, dabei nicht auf den Kortex beschädigt werden. </li></ol> 5. Einbetten und Schneiden von elektroporiertem Rinden (im Video) <ol><li> Übertragen Sie 3% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in eine große Form auf Eis gestellt. Der Boden der Form beginnt, wird schneller, die Gehirne von versinkt bis auf den Boden der Form verhindern zu verfestigen. Sanft, übertragen Gehirn mit feinen Pinzetten eins nach dem anderen nach dem Entfernen der überschüssigen Puffer mit einem Kimwipe oder Filterpapier. Verwenden Sie eine 10 ul Pipettenspitze zu wirbeln die Gehirne im Inneren der Form, um maximale Schnittstelle zwischen der Agarose und Hirngewebe zu gewährleisten. </li><li> Orient die Gehirne aller Gehirne zu gewährleisten sind in der gleichen Ausrichtung und bei etwa dem gleichen Niveau in der Agarose. Lassen Sie die Agarose für ca. 5 min zu verfestigen. Verwenden Sie Bindekleber (Crazy Glue), um die Agarose-Blöcke, so dass die Riechkolben werden im Stehen zu befestigen. Sobald die Blöcke angebracht sind, sofort hinzuzufügen ice kaltem HBSS und schneiden Sie die Agarose zu machen, dass einzelne Segmente werden für jedes Gehirn erhalten. </li><li> Um die Blöcke in Scheiben schneiden, legen Sie die Vibratom die Geschwindigkeit auf eine niedrige Geschwindigkeit (etwa die Hälfte des Maximums) und stellen Sie die Klinge Schwingungsfrequenz bei der höchsten Einstellung. Generieren Sie 250-um dicke koronare Scheiben schneiden. Abrufen Scheiben mit einem gebogenen feinen Spatel und übertragen Sie sie auf Gewebe Brunnen mit einem feinen Pinsel oder einer Pinzette. </li><li> In Gewebekulturen Haube, übertragen Scheiben in beschichteten Einsätze. Fügen Sie 500 ul der Scheibe Kulturmedien zu jedem Einsatz, um die Übertragung einfach. Bis zu 5 Scheiben können pro Einsatz gebracht werden. Entfernen Sie überschüssige Medien aus der Oberseite der Scheiben und Inkubation bei 37 ° C in befeuchteten Inkubator. </li></ol> 6. Kultur und Analyse der organotypischen Slices (im Video) <ol><li> Um gesund Scheiben zu erhalten, sollte frisches Medium hinzugefügt mindestens jeden zweiten Tag unter der Membran durch den Ersatz der Hälfte der Medien jedes Mal sein. </li><li> Um Scheiben nach dem d analysierenesired Tagen in Kultur, fixieren Scheiben in der Membran. Waschen mit 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 37 ° C dreimal für jeweils 10 Minuten Zeit. Als nächstes wird mit 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht beheben bei 4 ° C oder für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Scheiben können mit verschiedenen zellulären Marker analysiert werden oder gefärbt mit Hoechst allein zu elektroporierte und nicht-elektroporierten Zellen sichtbar zu machen. Permeabilisieren und blockieren Scheiben für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 10% Ziegenserum, 0,1% Triton in 1 × PBS unter leichtem Schütteln. </li><li> Färbung mit Hoechst für 1 Stunde bei Raumtemperatur, Waschen insgesamt 3 Mal mit 1 × PBS 10 min jeweils unter leichtem Schütteln. </li><li> Für die Montage von Scheiben schneiden die Membran mit einem Skalpell und einer feinen Pinzette verwenden, um die Membran mit Scheiben auf ein Milchglas zu übertragen Folien in einer Wasserkammer. Bis zu 5 Scheiben können pro Objektträger aus Glas gelegt werden. Entfernen Sie überschüssiges Wasser und einen Tropfen Flourmount Lösung in jedes Gehirn in Scheiben schneiden. Vorsichtig einen Deckglas oben auf den Hirnschnitten und entfernen Sie einy Luftblasen. Analysieren Scheiben mit einem konfokalen Mikroskop. </li></ol> 7. Alternative Paraffineinbettung von organotypischen Slices (nicht im Video) <ol><li> Organotypische Scheiben auch für Paraffin für eine feinere morphologische Analyse eingebettet werden, zu diesem Zweck die Membran mit den organotypischen Scheiben können in 4% PFA, wie oben beschrieben befestigt werden. </li><li> Die festen Scheiben werden in 1% Agarose (auf 37 ° C vorgewärmt) eingebettet ist, und verfestigt Eis für 30 min. Die Agarose-Blöcke können dann nach in 4% PFA bei 4 ° C für 30 min. </li><li> Die Agarose-Block mit dem organotypischen wird dann in Paraffin eingebettet und verarbeitet werden, wie zuvor für Immunfluoreszenz 10 beschrieben. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Eine schematische Darstellung der Elektroporation von murinen Cortex und Kultur von organotypischen Schnitten in 1 gezeigt. Diese Methode ist eine nützliche Strategie für rapid Bewertung der Funktion von Genen in der neuronalen Entwicklung 11 verwickelt. Je nach der Menge an DNA elektroporiert und der embryonalen Phase bei Elektroporation, wird die Transfektionseffizienz zu variieren. Scheiben beginnen, die GFP mindestens 8 Stunden nach der Elektroporation und Zellen wird die normale Abfolge der Ereignisse neurogenen (Proliferation, Migration, und Anfang der neuronalen Differenzierung) in Kultur zu unterziehen. Abbildung 2 zeigt ein elektroporierte Hirnschnitt, die Ausdruck einer Kontrolle wird pSilencer-GFP Vektor und kann man beobachten, neuronale Vorläuferzellen, die Migration Neuronen und differenzierten Neuronen in der Scheibe. Organotypische Slices ihrer Morphologie solange behalten, wie sie in einem guten Medien-Luft-Grenzfläche auf den Membranen erhalten werden und auch bis zu mindestens 5 Tagen in Kultur verwendet werden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3621/3621fig1.jpg" /> Abbildung 1. Illustration von Ex-vivo-Elektroporation und organotypischenKultur Assay. E14.5 Embryonen sind, präpariert und einzeln mit DNA mit schnellen grünen Farbstoff gemischt injiziert, um die Injektionsstelle zu visualisieren. DNA kann in beiden der lateralen Ventrikel injiziert werden, wie in der Abbildung oder im dritten Ventrikel dargestellt, um der lateralen Ventrikel zu füllen. Nach der Injektion werden Gehirne mit einer Rechteckwelle Elektroporator elektroporiert, indem die positive Elektrode auf der gewünschten Seite des Gehirns. Gehirne werden in 3% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und geschnitten unter Verwendung eines Vibratom eingebettet. 250 um Hirnschnitten auf 0,4 um Einsätze platziert und bis zu einer Woche kultiviert. GFP nach 8 Stunden nach der Transfektion beobachtet werden. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3621/3621fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Analyse der elektroporierte Hirnschnitten. Elektroporiertem Hirnschnitten wurden für Hoechst gefärbt. Dorsale Kortikalis zeigt neuronale Vorläuferzellen elektroporiert bei der ventrikulären Zone (VZ). Neuronen im CortiCAL-Platte (cp) werden begrenzt durch die Randzone (mz). Weiße Pfeile zeigen die Migration Neuronen. In diesem Fall wurden Gehirne von E15.5 injiziert und Elektroporation mit einem GFP-Kontroll-Vektor pSilencer. Die Abschnitte repräsentieren kortikalen Explantate 4 Tage nach der Elektroporation. Maßstabsbalken 100 um. Fehlerbehebung: <ol><li> Niedrige Transfektionseffizienz: Passen Sie die Konzentration von DNA verwendet werden, um mindestens 1 ug / ul. Verwenden Sie immer sehr sauber DNA aus einer Maxi Prep gegebenenfalls Gebrauch eine Endo-free-Kit Quiagen die DNA zu reinigen. </li><li> Zellen in einer anderen Bereich des Gehirns als die gewünschte transfiziert: Sicherstellen, dass die Elektroden korrekt mit der positiven Elektrode in Richtung auf die Seite des Gehirns zu elektroporiert positioniert werden. </li><li> Organotypische Scheiben verlieren Morphologie: Change Medien jeden Tag und sorgen für die Scheiben nicht schwebend in Medien </li><li> Scheiben kommen aus der Agarose, wie sie in der vi geschnitten werdenbratome: Stellen Sie sicher, dass eine gute Schnittstelle gemacht wird, wenn die Einbettung der Gehirne in der Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt. </li></ol>

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	<li>Angevine, J. B., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+cell+migration+during+histogenesis+of+cerebral+cortex+in+the+mouse.">Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse.</a> Nature. 192, 766-766 (1961).</li><li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex.">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).</li><li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons.">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).</li><li>Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+for+analysis+of+proliferation,+cell+death,+and+migration+in+the+embryonic+neocortex.">Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).</li><li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+overlay+assay:+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal.">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal.</a> Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).</li><li>Guerrier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-BAR+domain+of+srGAP2+induces+membrane+protrusions+required+for+neuronal+migration+and+morphogenesis.">The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis.</a> Cell. 138, 990-990 (2009).</li><li>Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+regulation+of+axonal+morphogenesis+by+the+Cdh1-APC+target+SnoN.">Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN.</a> Neuron. 50, 389-389 (2006).</li><li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi.">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li><li>Konishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdh1-APC+controls+axonal+growth+and+patterning+in+the+mammalian+brain.">Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain.</a> Science. 303, 1026-1026 (2004).</li><li>Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+paraffin-embedding+of+mouse+tissues+for+GFP+visualization.">Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).</li><li>Hand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-45 (2005).</li><li>Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Electroporation+as+a+Tool+for+Genetic+Manipulation+in+Vivo+to+Study+Psychiatric+Disorders:+From+Genes+to+Circuits+and+Behaviors.">In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors.</a> Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Diese Verfahren, die die Ex-vivo-Elektroporation von Plasmiden, die doppelsträngige RNA-Haarnadeln 8 und Kultur der organotypischen Slices 4 bieten mehrere deutliche Vorteile. Erstens erlauben diese Methoden für eine schnelle Beurteilung der RNAi-derived Phänotypen. Die Einbeziehung einer Expressionskassette GFP-codierende in der gleichen pSilencer Vektor, der die U6-Promotor, der die doppelsträngige RNA-Haarnadel treibt enthält ermöglicht eine schnelle Identifizierung und Charakteri...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Hamilton-Spritze </td><td> HAMILTON </td><td> 80008 </td><td> 31 Gauge, 0,5 cm lang, PT-4 (Ebene der Punkt Abschrägung), 10 &amp;mgr; l Volumen </td></tr><tr><td> Platinum Tweezertrodes </td><td> BTX </td><td> 45-0489 </td><td> 5mm Größe </td></tr><tr><td> ECM830 Elektroporator </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td></td></tr><tr><td> BTX-Fußschalter </td><td> BTX </td><td> 45-0208 </td><td> Für den Einsatz mit ECM830 Elektroporator </td></tr><tr><td> Vibrierender Klinge Mikrotom </td><td> LEICA </td><td> VT1000 S </td><td></td></tr><tr><td> 6 - gut zu Gericht mit Beilagen verwenden </td><td> FALCON </td><td> 353502 </td><td> Enthält Kerben auf Einsätze passen </td></tr><tr><td> Zellkultureinsätze </td><td> FALCON </td><td> 353090 </td><td> 0,4 Mikrometer </td&gt; </tr><tr><td> Fast Green </td><td> SIGMA </td><td> F7252 </td><td></td></tr><tr><td> Niedrig schmelzender Agarose </td><td> FISHER </td><td> BP165-25 </td><td> DNA-Klasse </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5899 </td><td></td></tr><tr><td> Basal Medium Eagle </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B-1522 </td><td></td></tr><tr><td> 10x HBSS ohne Ca und Mg </td><td> GIBCO </td><td> 14180-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-freier Säure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4034 </td><td></td></tr></tbody></table>

methods for study of neuronal morphogenesis: ex vivo rnai electroporation in embryonic murine cerebral cortex

Die Großhirnrinde leitet höheren kognitiven Funktionen. Diese sechs Schichtstruktur in einer Innenseite-Zuerst-, Außen-letzten Weise, in der die ersten geboren Neuronen bleiben näher an den Ventrikel während die letzten geboren Neuronen an den ersten geboren Neuronen in Richtung der Oberfläche des Gehirns 1 durchwandern erzeugt. Neben der neuronalen Migration 2, ist ein wichtiger Prozess für die normale Funktion der kortikalen Regulation der neuronalen Morphogenese 3. Während die neuronalen Morphogenese in vitro in primären Kulturen untersucht werden können, gibt es viel zu aus, wie diese Prozesse werden im Gewebe reguliert Umgebungen gelernt werden. Wir beschreiben Techniken, um neuronale Migration und / oder Morphogenese in organotypischen Schnitten der Großhirnrinde 4,6 analysieren. Ein pSilencer modifizierte Vektor verwendet wird, die sowohl eine U6-Promotor, der die doppelsträngige Haarnadel-RNA antreibt und einen separaten Expressionskassette, die GFP-Protein codiert, b angetriebenya CMV-Promotor 7-9. Unser Ansatz ermöglicht die schnelle Beurteilung von Defekten in Neuritenwachstum auf spezifischen Knockdown von Kandidatengenen und wurde erfolgreich in einem Screen für Regulatoren der Neuritenwachstum 8 verwendet. Da nur ein Teil der Zellen die RNAi-Konstrukte zum Ausdruck bringen wird, erlauben die organotypischen Slices für ein Mosaik Analyse der potenziellen Phänotypen. Darüberhinaus ist der Analyse in einem in der Nähe Angleichung der in vivo-Umgebung durchgeführt wird, bietet es eine kostengünstige und schnelle Alternative zur Erzeugung von transgenen oder Knockout-Tieren für Gene unbekannter Kortex. Schließlich, im Vergleich zu in vivo Elektroporation Technologie, ist der Erfolg der Ex-vivo-Elektroporation Experimente nicht auf die Entwicklung von Fähigkeiten beherrschen Operation abhängig und kann mit einer kürzeren Ausbildung Zeit und Geschick durchgeführt werden.

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Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Um eine rasche Beurteilung der Funktion von Genen in der Entwicklung der Hirnrinde führen, beschreiben wir Verfahren, die die<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elektroporation von Plasmiden co-exprimieren, inhibitorische RNA (RNAi) und GFP in murinen embryonalen Kortex. Dieses Protokoll ist offen für das Studium der verschiedenen Aspekte der Entwicklung des Nervensystems, wie zB Neurogenese, neuronale Migration und neuronalen Morphogenese einschließlich Dendriten und Axonen Auswuchs.

Methoden zur Untersuchung der neuronalen Morphogenese:<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; RNAi Elektroporation in embryonale Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

11.7K Aufrufe.  Brown University. Um eine rasche Beurteilung der Funktion von Genen in der Entwicklung der Hirnrinde führen, beschreiben wir Verfahren, die die Ex vivo Elektroporation von Plasmiden co-exprimieren, inhibitorische RNA (RNAi) und GFP in murinen embryonalen Kortex. Dieses Protokoll ist offen für das Studium der verschiedenen Aspekte der Entwicklung des Nervensystems, wie zB Neurogenese, neuronale Migration und neuronalen Morphogenese einschließlich Dendriten und Axonen Auswu...

Serie: Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Gleichzeitige Elektroenzephalographie, Real-time Messung der Laktat-Konzentration und optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität in der Nagetier Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Induktion Cre Lox Rekombination in Maus Großhirnrinde durch Elektroporation In Utero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...