우리는 pSil-GFP 만들어낸 그림 1의 그림에 대한 박사 Alper Uzun 및 공촛점 현미경을위한 Leduc Bioimaging 시설을 제공하는 박사 Shirin Bonni 감사드립니다. EMM은 버로우즈 Wellcome 기금, NARSAD 젊은 수사관 수상, 그리고 NIH NCRR 코브레 P20 RR018728-01에서 의학을위한 경력 수상에 의해 지원됩니다. SBL은 NIH NCRR 코브레 P20 RR018728-01에 의해 지원되며, PHS NRSA 5T32MH019118-20의 지원을 받았습니다.

1. (아니라 비디오) 문화 솔루션 및 미디어 준비하기 <ol><li> 1X HBSS, 2.5 MM Hepes (pH7.4), 30 MM D-글루코오스, 1 ㎜ CaCl 2, 1 ㎜ MgSO 4와 4 MM NaHCO 3을 포함하는 완전한 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) 1 리터를 준비합니다. 이중 증류수 (ddH 2 O)를 추가합니다. 4에 0.2-μm의 필터 및 매장 ° C.로 소독을 필터링 </li><li> 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 이글 매체의 35 ML을 사용하여 슬라이스 문화 매체, 전체 HBSS의 12.9 ML, 20 MM D-글루코오스 (1 M 솔루션의 1.35 ML), 1 ㎜ Glutamax (200 MM 솔루션의 0.25 ML), 페니실린 0.5 ML 준비 - 스트렙토 마이신 100x 주식. 0.2-μm의 필터로 멸균을 필터링한 후 5 % 최종 농도로 혈청 열 inactivated 목마를 추가합니다. </li><li> 1 MG / 멸균 증류수 탈이온수와 ML Laminin 주식 솔루션을 만들어 Laminin 작업 솔루션을 준비합니다. -80에서 0.5 ML eppendorf 튜브에서 100 μL aliquots을 준비하고 동결 ° C. </li><li> 그래서 폴리-L-라이신 작업 준비1 MG / ML 주식 솔루션을 만들기 위해 폴리-L-라이신의 5 MG로 멸균 H 2 O 5 ML를 추가하여 lution. -20 ° C.에서 1 ML aliquots과 프리즈를 준비 </li><li> 멸균 물 12 ML의 최종 볼륨 폴리-L-라이신 1 ML과 laminin의 100 μL를 diluting하여 코팅 용액을 준비한다. 매번 신선이 솔루션을 확인하십시오. </li></ol> 2. Organotypic 슬라이스 삽입을합니다 (동영상) 준비 <ol><li> 한 문화 삽입마다 잘 멸균 포셉을 이용하여 2 백 6 - 웰 플레이트를 준비합니다. 문화 삽입 아래 무균 ddH 2 O 2 ML을 추가합니다. </li><li> 찔린에 멤브레인 처리하지 복용 막 위에 코팅 용액 1 ML을 추가합니다. 37 humidified 배양기에서 하룻밤 품어 ° C에서 5 % CO 2. </li><li> 코팅 미디어를 제거하고 살균 H 2 0 세 번으로 멤브레인 씻는다. 사용하기 전에 건조 삽입하자. ° C 배양기에서 37 슬라이스 문화 매체와 장소의 1.8 ML을 추가합니다. Parafilm과 함께 사용하지 않는 접시 감싸주세요그리고 최대 4 주까지 4 ° C에서 저장합니다. </li></ol> 3. (아니라 비디오) Electroporation 준비하기 <ol><li> electroporation을 위해 RNAi의 구조를 준비합니다. 더블 스트랜드 RNA의 머리 핀의 자형 삽입은 pSilencer 벡터로 복제되었다. 플라스미드가 포함되어 있습니다 : 1) 이중 가닥 RNA 생성하게 만들수있는 U6업자, 그리고 2) GFP 발현 카세트가 CMV 프로 모터에 의해 구동 8,9. 이 플라스미드는 이전 코니시 및 동료 9, 다른 7,8에 의해 설명되었다. Plasmids는 Qiagen 맥시 간이 키트를 사용하여 정제, 1 밀리그램 / ML의 농도로 사용됩니다. </li><li> 그것을 주입하는 동안 DNA를 시각화하기 위해서는 0.5 % 빠른 녹색 염료 솔루션을 준비하고 (일반적으로 빠른 그린의 1 μL와 DNA 20 μL) 주입되는 DNA로 1시 20분에서 사용합니다. 남은 DNA가 빠른 녹색 염료 혼합물은 최대 일주일 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 깨끗한 절개 지역 dissectiNG 도구와 70 %의 에탄올과 v​​ibratome 들어왔습니다. 그것이 얼음 춥다 있도록 완벽한 HBSS를 풀어. 급속한 냉각을위한 물 vibratome에서나 주위 얼음을 포장하여 칠이 vibratome 용기. 전체 HBSS를 사용 3% 낮은 용융 점 아가로 오스를 준비합니다. 1 분 용 마이크로 웨이브. 끓는 동안 피한다. 사용할 때까지 42 ° C ~ waterbath에 두십시오. </li><li> Electroporation 매개 변수는 다음과 같이 설정됩니다. E15 배아 사용에 35 V의 경우, 5 펄스, 100 MS 길이, 펄스 사이의 900 MS 간격. 오래된 동물의 경우 electroporation을 위해, 50 V에 높은 전압을 사용 또는 8 펄스로 펄스의 개수를 증가시킬 수 있습니다. 어린 동물에서 조직 손상을 방지하기 위해 25 중 적은 펄스 또는 최대 2 펄스와 낮은 전압을 사용하여 V. 이러한 매개 변수는 다양하고 경험적으로 동물의 나이에 따라 결정됩니다. </li></ol> 4. 해부 및 Electroporation (동영상) <ol><li> 임신 여성 euthanizing 후, 얼음 추위 전체 HBSS로 배아를 해부. 별처럼그들의 개인 placental 주머 니나 각 배아를 EP. </li><li> 배아를 해부하고 첫 번째 척추 후 머리를 잘라. 얼음 추위 전체 HBSS에 두십시오. </li><li> 주사의 경우 배양 접시 위에 Parafilm의 조각에 머리를 놓습니다. 피질 vesicles의 두 측면 심실을 작성하기 위해 세 번째 뇌실을 통해 빠른 녹색 염료 믹스 : 사용자 정의를 사용하면 해밀턴 주사기 DNA의 8-6에 대한 μL를 주입 (제가 표 참조)했다. 또는 주사는 각 측면 뇌실에 직접 수행할 수 있습니다. </li><li> 전직 생체내 electroporation의 경우, BTX-트위터의 백금 전극을 사용합니다. 당신 지느러미 피질을 위해 머리 즉, 상단을 electroporate하려는 피질의 편으로의 긍정적인 전극을 배치합니다. </li><li> electroporation 후 해부하기 전에 적어도 5 분 동안 얼음에 머리를 품어. </li><li> 얼음 추위 HBSSby은 머리의 측면에 작은 절개를 만들고 머리의 측면 떨어져 피부를 필링으로 뇌를 해부. 와 다음부드럽게 벗겨 버릴 미세 포셉 두뇌에서 PIA. 피질을 손상하지 않도록 돌보는 두개골에서 그대로 두뇌를 제거합니다. </li></ol> 5. (비디오) 삽입 및 Electroporated Cortices의 Sectioning <ol><li> 빙판에 놓여 대형 금형에 3퍼센트 낮은 용융 점 아가로 오스를 전송합니다. 금형의 하단보다 빠르게 금형의 하단 아래로 가라앉고에서 머리를 방지할 수있는 응고하기 시작합니다. 부드럽게, 알았어 포셉 Kimwipe 또는 여과지로 여분의 버퍼를 제거 후 하나씩 함께 머리를 전송합니다. 아가로 오스와 뇌 조직 사이의 최대 인터페이스를 보장하기 위해 금형 내부의 소용돌이 머리에 10 μL pipet 팁을 사용합니다. </li><li> 모든 머리를 보장하는 동양 두뇌가 같은 방향으로하고 아가로 오스에 대해 동일한 수준입니다. 아가로 오스는 약 5 분 동안 응고하자. 후각 전구가 서되도록 아가로 오스 블록을 부착하는 본딩 접착제 (미친 접착제)를 사용합니다. 블록이 첨부되면, 즉시 전 추가CE 감기의 HBSS와 반드시 개별 조각을 만드는 아가로 오스 잘라 각 뇌를 얻을 수 있습니다. </li><li> , 블록을 썰어 저속 (반 최대 약)에 vibratome의 속도를 설정하고 가장 높은 설정에 날개 진동 주파수를 설정합니다. 250 μm의 두께 코로나 슬라이스를 생성합니다. 구부러진 미세 주걱을 사용하여 조각을 검색하고 벌금 브러시 또는 집게로 조직 우물로 전송할 수 있습니다. </li><li> 조직 문화 후드에 코팅된 인서트로 조각을 전송. 전송이 용이하도록 각 인서트로 슬라이스 문화 미디어 500 μL를 추가합니다. 최대 5 조각까지가 삽입마다 배치될 수 있습니다. 조각의 위로부터 초과 미디어를 제거하고 37 ° C에서 humidified 인큐베이터에서 부화. </li></ol> 6. 문화 Organotypic 조각의 분석 (동영상) <ol><li> 건강한 조각을 유지하기 위해서는 신선한 미디어는 미디어 매번의 절반을 대체하여 멤브레인 밑에 적어도 매일 추가됩니다. </li><li> D 이후 조각을 분석하기 위해서는문화 esired 일, 멤브레인에서 슬라이스를 수정. ° C에서 세 번 10 분, 각 시간을 37 1X 인산염 완충액 식염수 (PBS)으로 씻는다. 다음, 4 ° C에 또는 상온에서 1 시간을위한 야간 4 % Paraformaldehyde (PFA)로 수정 프로그램입니다. </li><li> 조각이 다른 세포 마커로 분석하거나 electroporated 및 비 electroporated 세포를 시각화하는 혼자 Hoechst 물들일 수있다. Permeabilize와 10 % 염소 혈청, 부드러운 진동과 1X PBS에 0.​​1 %의 트리톤과 함께 실온에서 2 시간을위한 조각을 차단합니다. </li><li> 상온에서 1 시간 동안 Hoechst와 청바지, 때마다 부드러운 진동과 함께 1X PBS로 10 분들과 3 회 씻는다. </li><li> 조각은 메스와 멤브레인를 잘라 마운트하고, 서리 낀 유리 조각을 포함 멤브레인를 전송하는 멋진 집게를 사용하는 것은 물 챔버에서 슬라이드. 최대 5 조각은 유리 슬라이드마다 배치될 수 있습니다. 여분의 물을 제거하고, 각 뇌 슬라이스에 Flourmount 용액 한 방울을 추가합니다. 부드럽게 뇌 조각 위에 coverslip을 배치하고를 제거Y 공기 거품이. 공촛점 현미경을 사용하여 슬라이스를 분석합니다. </li></ol> 7. Organotypic 조각의 대체 파라핀의 임베딩합니다 (동영상) <ol><li> Organotypic 조각도이를 위해 세밀한 형태학의 분석을 위해 파라핀을 위해 임베디드 수 organotypic 조각이 들어있는 막은 PFA는 위에서 설명한 것처럼 4%에서 수정하실 수 있습니다. </li><li> 고정 조각은 1퍼센트 아가로 오스 (37 ° C로 미리 예열)에 임베디드, 그리고 30 분 동안 얼음에서 확정됩니다. 아가로 오스 블록 그런 다음 30 분 동안 4 ° C에서 4퍼센트 PFA에서 사후 해결할 수 있습니다. </li><li> organotypic 슬라이스를 포함하는 아가로 오스 블록 후 파라핀에 포함된하고 이전 10 설명된대로 immunofluorescence을위한 처리됩니다. </li></ol> 8. 대표 결과 organotypic 조각의 murine 피질과 문화 electroporation의 도표 표현은 그림 1에 표시됩니다. 이 방법은 rapi를위한 유용한 전략입니다의 연결을 개발 11에 관련된 유전자의 기능의 D 평가. DNA electroporated의 양과 electroporation에서 배아 단계에 따라 transfection 효율이 달라집니다. 조각은 적어도 8시간 포스트 electroporation과 세포 문화 neurogenic 이벤트 (증식, 이주, 그리고 초기의 연결을 분화)의 정상적인 순서를 받게 될 것이다 GFP를 표현하기 시작합니다. 그림 2는 pSilencer-GFP 컨트롤을 표출하는 electroporated 뇌의 슬라이스를 보여줍니다 벡터와 하나의 연결을 progenitors, 마이 그 레이션 뉴런과 슬라이스의 차별화된 뉴런을 관찰하실 수 있습니다. 그들이 세포막에 좋은 미디어 에어 인터페이스에 유지하고 있으며 문화에 적어도 5 일 이내에 사용할 수있는 Organotypic 조각은 긴 것처럼 그들의 형태를 유지합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3621/3621fig1.jpg" /> 1 그림. 전직 생체내의 electroporation과 organotypic 슬라이스의 삽화문화 분석. E14.5 배아 밖을 해부하고, 개별적으로 사출 사이트를 시각화하기 위해 빠른 녹색 색소가 섞인 DNA에 주입하고 있습니다. 측면 심실을 채우기 위해 그림에 또는 제 3 뇌실에 묘사된대로 DNA가 측면 심실 모두에서 주입 수 있습니다. 주사 후, 두뇌는 두뇌의 원하는 측면에 긍정적인 전극을 배치 평방 파도 electroporator로 electroporated있다. 두뇌는 3퍼센트 낮은 용융 점 아가로 오스와 vibratome를 사용 sectioned에 포함됩니다. 250 μm의 뇌 조각은 0.4 μm의 삽입에 위치하고 주일까지 배양해 있습니다. GFP는 8 시간 포스트 transfection 후 볼 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3621/3621fig2.jpg" /> 그림 2. electroporated 뇌 슬라이스의 분석. Electroporated 뇌 조각이 Hoescht 위해 물들어 있었다. 등 부분의 피질 심실 구역 (VZ)에서 electroporated의 연결을 progenitors를 보여줍니다. corti의 뉴런칼 플레이트 (CP)는 한계 구역 (MZ)로 구분된 있습니다. 흰색 화살표가 이주 뉴런을 보여줍니다. 이 경우, 두뇌는 E15.5에 주입되었고 pSilencer GFP 제어 벡터와 electroporated. 섹션 4 일 electroporation 후 피질 explants를 나타냅니다. 스케일 바 100 μm의. 문제 해결 : <ol><li> 낮은 transfection 효율 : 최소 1 μg / μL에 사용된 DNA의 농도를 조정합니다. 필요한 사용 엔도 무료 Quiagen 키트는 DNA를 정화하는 경우에는 항상 맥시의 초등학교에서 매우 깨끗한 DNA를 사용합니다. </li><li> 한 원하는 아닌 다른 뇌 영역에 transfected 세포가 : 전극이 electroporated되는 두뇌의 측면에 대한 긍정적인 전극의 위치에 정확하게 위치하고 있는지 확인합니다. </li><li> 매일 변경 매체와 조각 미디어에 떠되지 않도록 : Organotypic 조각은 형태를 잃게 </li><li> 그들이 바이올렛에 절단되는대로 조각은 아가로 오스 그만 좀bratome : 낮은 용융 점 아가로 오스에 머리를 삽입하면 좋은 인터페이스가 만들어되었는지 확인하십시오. </li></ol>

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	<li>Angevine, J. B., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+cell+migration+during+histogenesis+of+cerebral+cortex+in+the+mouse.">Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse.</a> Nature. 192, 766-766 (1961).</li><li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex.">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).</li><li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons.">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).</li><li>Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+for+analysis+of+proliferation,+cell+death,+and+migration+in+the+embryonic+neocortex.">Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).</li><li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+overlay+assay:+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal.">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal.</a> Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).</li><li>Guerrier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-BAR+domain+of+srGAP2+induces+membrane+protrusions+required+for+neuronal+migration+and+morphogenesis.">The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis.</a> Cell. 138, 990-990 (2009).</li><li>Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+regulation+of+axonal+morphogenesis+by+the+Cdh1-APC+target+SnoN.">Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN.</a> Neuron. 50, 389-389 (2006).</li><li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi.">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li><li>Konishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdh1-APC+controls+axonal+growth+and+patterning+in+the+mammalian+brain.">Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain.</a> Science. 303, 1026-1026 (2004).</li><li>Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+paraffin-embedding+of+mouse+tissues+for+GFP+visualization.">Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).</li><li>Hand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-45 (2005).</li><li>Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Electroporation+as+a+Tool+for+Genetic+Manipulation+in+Vivo+to+Study+Psychiatric+Disorders:+From+Genes+to+Circuits+and+Behaviors.">In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors.</a> Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).</li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

이중 좌초된 RNA 헤어핀 8과 4는 몇 가지 뚜렷한 장점을 제공 organotypic 조각 문화 인코딩 plasmids의 전직 생체내의 electroporation을 포함한 이러한 방법. 첫째, 이러한 방법은 RNAi 파생 phenotypes의 신속한 평가를 위해 수 있습니다. 이중 좌초된 RNA의 머리핀을 운전 U6 프로 모터를 포함하는 동일한 pSilencer 벡터의 표현 카세트 인코딩 GFP의 포함은 RNAi 벡터와 electroporated 세포의 신속한 식별 및 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 해밀턴 주사기 </td><td> 해밀턴 </td><td> 80,008 </td><td> 0.5 인치 길이 31 게이지, PT-4 (포인트 beveling 수준), 10μl 부피 </td></tr><tr><td> 플래티넘 tweezertrodes </td><td> BTX </td><td> 45-0489 </td><td> 5mm 크기 </td></tr><tr><td> ECM830 electroporator </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td></td></tr><tr><td> BTX Footswitch </td><td> BTX </td><td> 45-0208 </td><td> ECM830 electroporator 함께 사용하기위한 </td></tr><tr><td> 블레이드 마이크로톰 진동 </td><td> LEICA </td><td> VT1000 S </td><td></td></tr><tr><td> 6 - 삽입과 함께 사용하기 위해 잘 요​​리 </td><td> 매 </td><td> 353,502 </td><td> 삽입에 맞게 노치를 포함 </td></tr><tr><td> 조직 문화에 삽입 </td><td> 매 </td><td> 353,090 </td><td> 0.4 마이크로 미터 </TD&gt; </tr><tr><td> 빠른 그린 </td><td> 시그마 </td><td> F7252 </td><td></td></tr><tr><td> 낮은 녹는 아가로 오스 </td><td> 어부 </td><td> BP165-25 </td><td> DNA 학년 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리-L-라이신 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P5899 </td><td></td></tr><tr><td> 기저 중간 이글 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> B-1522 </td><td></td></tr><tr><td> 칼슘과 MG없이 10X HBSS </td><td> GIBCO </td><td> 14180-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES없는 산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H4034 </td><td></td></tr></tbody></table>

methods for study of neuronal morphogenesis: ex vivo rnai electroporation in embryonic murine cerebral cortex

대뇌 피질은 고등인지 기능을 연결해줍니다. 이 여섯 계층 구조는 마지막으로 태어난 뉴런은 뇌의 1의 표면을 향해 첫 번째 태어난 뉴런 지났 마이 그 레이션하는 동안 첫 번째 태어난 뉴런은 뇌실에 가깝게 유지하는 내부 - 먼저, 외부 - 지난 방식에 생성됩니다. 의 연결을 마이 그 레이션이 이외에, 정상적인 대뇌 피질의 기능을위한 핵심 프로세스의 연결을 morphogenesis 3의 규정입니다. 의 연결을 morphogenesis는 기본 문화권의 체외에서 공부 할 수 있지만,이 프로세스가 조직 환경에서 규제하는 방식으로부터 배울 것이 많이 있습니다. 우리는 대뇌 피질 4,6의 organotypic 조각에의 연결을 마이 그 레이션 및 / 또는 morphogenesis을 분석하는 기법을 설명합니다. pSilencer 수정된 벡터는 이중 좌초된 머리 핀의 자형으로 RNA를 몰고 U6업자와 B를 구동 GFP 단백질을 암호화 별도의 표현 카세트를 모두 포함하는 데 사용됩니다또 CMV 프로 모터 7-9. 우리의 접근법은 후보 유전자의 특정 최저시 neurite 가지 결함의 신속한 평가를 허용하고 성공적으로 neurite의 파생물 8 규제에 대한 화면에 사용되었습니다. 세포만을 집합은 RNAi 구조를 표현하므로, organotypic 조각은 잠재 phenotypes의 모자이크 분석을 위해 수 있습니다. 이 분석은 생체내 환경의 가까운 근사치에 완료되기 때문에 더구나, 그것은 미지의 대뇌 피질 기능의 유전자에 대한 낮은 비용과 유전자 변형 또는 녹아웃 동물의 생성에 대한 빠른 대안을 제공합니다. 마지막으로 생체내의 electroporation 기술에 비해, 전직 생체내의 electroporation 실험의 성공 여부는 능숙하게 수술 기술 개발에 의존 아니므로 짧은 훈련 시간과 기술이 함께 수행할 수 있습니다.

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Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

대뇌 피질의 발달에서 유전자의 기능의 신속한 평가를 실시하기 위해, 우리는 관련된 방법을 설명<em&gt; 예 생체내</emplasmids의&gt; electroporation 억제 RNA (RNAi)와 murine 배아 피질에서 GFP를 공동 표현. 이 프로토콜은 neurogenesis,의 연결을 마이 그 레이션 및 dendrite와 축삭의 파생물을 포함하여의 연결을 morphogenesis 등 neurodevelopment의 다양한 측면의 연구를 의무이다.

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

11.7K 조회수.  Brown University. 대뇌 피질의 발달에서 유전자의 기능의 신속한 평가를 실시하기 위해, 우리는 관련된 방법을 설명 예 생체내 electroporation 억제 RNA (RNAi)와 murine 배아 피질에서 GFP를 공동 표현. 이 프로토콜은 neurogenesis,의 연결을 마이 그 레이션 및 dendrite와 축삭의 파생물을 포함하여의 연결을 morphogenesis 등 neurodevelopment의 다양한 측면의 연구를 의무이다.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

연구

신경과학

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

동시 Electroencephalography, 설치류 대뇌 피질의 젖산 농도와 Neuronal 활동 Optogenetic 조작의 실시간 측정

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

하이 필드의 fMRI를 사용하여 성인 고양이의 청각 피질의 기능적 이미징

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

동시<em&gt; 생체</em두 망막의&gt; 기능 테스트로<em&gt; 생체</em&gt; 전위도 시스템

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...