Diese Arbeit wurde durch Grant R01NS062842 vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health (VVD) und durch Zuschüsse R21 NS064403 vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health durch ARRA (VVD) und R21 unterstützt EB006301 National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health (VVD).

Die Abschnitte für die molekulare Maschine-basierte Erkennung sollten zunächst vorbereitet werden, weil ihre Vorbereitung nimmt mehr Zeit als die Montage der molekularen Gerät. Das Konstrukt funktioniert gut mit 5-6μm dicke Abschnitte aus Paraformaldehyd-fixierte, in Paraffin eingebettetes Gewebe Blöcke geschnitten. Verwenden Sie schieben Marken, die Abschnitte zu halten und, wie ProbeOn Plus-geladen und vorgereinigte Objektträger (Fisher Scientific) oder ähnliches. Wir empfehlen zunächst mit einem Gewebe mit einem bekannten Muster von DNA-Schäden, die sowohl DNase I-und DNase II-Typ Pausen enthält, wie zB Dexamethason behandelten apoptotischen Ratte Thymus 13,14. 1. Vorbereitung von Abschnitten <ol><li> Setzen Sie die Teile in einen Objektträger-Rack und Entwachsen in Xylol für 15 min, ein frisches Xylol Bad für weitere 5 Minuten übertragen. </li><li> Rehydrieren, indem sie durch abgestufte Ethanolkonzentrationen: 96% Ethanol-2x5min, 80% Ethanol - 5min, Wasser - 2x5 min. </li><li> Digest Abschnitt mit Proteinase K. Mit 100 &amp;mgr; eines 50μg/mL Lösung pro Abschnitt. Inkubieren 15 &#39;bei Raumtemperatur (23 ° C) in einer feuchten Kammer. Die Zeit muss möglicherweise angepasst werden je nach Gewebetyp. Hartgewebe erfordert möglicherweise mehr Aufschluss. Times of 15-25 min sind in der Regel verwendet. Unzureichende Verdauung kann das schwächere Signal führen. Overdigestion auf der anderen Seite ergibt Signal Verschwinden und Abschnitt Störung. </li><li> Spülen in destilliertem Wasser für 2x10 min. </li><li> Apply 100 ul pro Abschnitt 2% BSA für Vorblockierung. Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur (23 ° C). Während dieser Zeit versammeln die molekulare Maschine. </li></ol> 2. Molekulare Maschinen Montage Alle Reagenzien sind für 25 ul Gesamtvolumen, das reicht für einen einzigen Nachweis in einer durchschnittlichen Größe Gewebeschnitt (10x10mm) skaliert wird. Die Lautstärke kann skaliert werden, wie gebraucht. <ol><li> Kombinieren Sie in einem kleinen Plastikschlauch in dieser Reihenfolge: </li></ol><table border="1"><tbody> &lt;tr&gt; <td><ol><li> Bidestilliertem Wasser; </li><li> 15% Polyethylenglykol-8000; </li><li> Lösung von 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 0,1 mM Dithioerythrit, 1 mM ATP, (dh für regelmäßige T4 DNA-Ligase-Puffer); </li><li> 70 pmol Oligonukleotid 1, </li><li> 215 pmol (1,76 bis 7,1 ug) VACC TOPO </li><li> 10 Einheiten T4 DNA-Ligase (500 U / mL) </li></ol></td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Vorsichtig mischen. Die molekulare fast sofort selbst montiert Konstrukt in diese Lösung und kann sofort bei Raumtemperatur (23 ° C) verwendet werden. Eine Erhöhung der Temperatur auf 37 ° C blockiert die T4 DNA-Ligase-basierte Komponente der Etikettierung. </li></ol> 3. Mit molekularen Maschinen in Gewebeschnitten zu dual label 5&#39;OH und 5&#39;PO4 DNA-Brüche <ol><li> Saugen Sie das Vorblockierung Lösung und gelten 25 &amp;mgr; l des gesamten Reaktionsmischung mit 70 pmol Oligonukleotid 1, 53 bis 215 pmol (1,76 bis 7,1 ug) VACCTOPO und 10 Einheiten T4 DNA-Ligase (500 U / ml) in einer Lösung von 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 0,1 mM Dithioerythrit, 1 mM ATP und 15% Polyethylenglykol-8000. Die gleiche Sequenz Oligonukleotid Durchführung einer FITC-Label, Oligonukleotid-2, kann stattdessen für den Nachweis von einer einzigen Art von DNA-Brüchen verwendet werden. In einem solchen Fall auslassen Ligase von der Kennzeichnungspflicht Reaktion. Auch in dieser Situation eine Lösung von 50 mM Tris-HCL, pH 7,4, 15% PEG-8000 kann anstelle von T4 DNA-Ligase-Puffer verwendet werden. </li><li> Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur (23 ° C) in einer feuchten Kammer mit einem Kunststoff-Deckglas. Vor Licht schützen. Die Absenkung der Temperatur auf 16 ° C reduziert die Ligase-basierte Signal, die Temperatur zu erhöhen, um 37 ° C vollständig eliminiert die Ligase-basierte Signal. Eine partielle Hemmung der Ligase tritt manchmal in der Reaktionsmischung, die möglicherweise durch Verunreinigungen mit Topoisomerase Präparate eingeführt. Daher könnte längere Inkubationszeit (2-4 Stunden) benötigt werden, besonders wenn significant Zahl der Ligase-markierten Pausen vorhanden sind. Obwohl beide Ligase und topo-Signale in dieser Phase beobachtet werden kann, in vielen Fällen die Ligase-Signal weiter verbessert werden kann durch wiederholtes Auftragen des Reaktionsgemisches ohne VACC TOPO-und Dual-Oligonukleotid, aber mit einer Haarnadel geformt Oligonukleotid (Oligonukleotid 3) (35 mg / mL) und T4 DNA-Ligase (250 U / mL). Zur Verbesserung der Signal mit Schritt 3 fortfahren, um die Reaktion ohne Vergrößerung zu sehen fahren Sie mit Schritt 5 fort. </li><li> Entfernen Deckgläser durch leichtes Eintauchen der Objektträger vertikal in einer Coplin Gefäß mit Wasser bei Raumtemperatur. Saugen Sie überschüssiges Wasser. </li><li> Enhance-Ligase-Signal, indem 25 ul Reaktionsansatz ohne VACC TOPO und Oligonukleotid-1, aber mit Oligonukleotid-3: 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 0,1 mM Dithioerythrit, 1 mM ATP und 15% Polyethylenglykol- 8000, 5 Einheiten T4 DNA-Ligase, 35 mg / ml Oligonukleotid 3 (mit stumpfen Enden Haarnadel). Das Gesamtvolumen der Kennzeichnung Lösung can skaliert werden, um die größeren Abschnitte aufzunehmen. Inkubieren für 18 h (über Nacht) bei Raumtemperatur (23 ° C) in einer feuchten Kammer mit einem Kunststoff-Deckglas. </li><li> Entfernen Deckgläser durch leichtes Eintauchen der Objektträger vertikal in Coplin Gefäß mit Wasser bei Raumtemperatur. Dann waschen Abschnitt 3x10 min in destilliertem Wasser. </li><li> Spülen mit Natrium-Bicarbonat-Puffer. Alkalischer Lösung spülen verbessert FITC Fluoreszenz, die pH-sensitiv ist und liegt deutlich unter pH 7 reduziert. </li><li> Abdeckprofil mit einem Antifading Lösung (Vectashield mit DAPI), Deckglas und zu analysieren, das Signal mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroskops. Doppelstrang-DNA bricht mit 5&#39;OH fluoreszieren grün, 5&#39;PO 4 Pausen - fluoreszieren rot (Abbildung 2). </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig2.jpg" /> Abbildung 1. Semi-künstliche molekulare Maschine erkennt zwei Arten vonDNA-Schäden in situ. Die fluoreszierenden Maschine selbst montiert, wenn VACC TOPO bindet sich an die Doppel-Haarnadel 32-mer. Die Maschine beginnt den Betrieb durch die Spaltung von selbst in zwei Detektor-Einheiten über Topoisomerase-made Schnitt am 3 &#39;Ende der Erkennungssequenz. Daraus ergibt sich ein zyklischer Prozess, bei dem FITC-markierten Einheit trennt kontinuierlich und religates zurück zu den Rhodamin-markierten Einheit. Dieser bleibt bestehen, bis eine nachweisbare DNA-Bruch aufgetreten ist. Wenn eine solche Alternative Akzeptor (5&#39;OH stumpfen Ende DNA Pause) im Gewebeschnitt wird, wird die FITC Teil, um es zu unterbinden. Die restlichen Rhodamin Teil wird 5 &#39;PO 4 DNA stumpfen Ende bricht mit Hilfe der T4 DNA-Ligase zu befestigen. Folglich sind beide Arten von DNA-Brüchen gleichzeitig detektiert. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig1.jpg" /> Abbildung 2. Molekulare Maschine Dual-Etiketten zwei Arten von DNA-Brüchenin einem Gewebe Abschnitt Dexamethason behandelten Thymus. Blunt-ended DNA-Brüche von DNase I-und DNase II-Typs sind in der Thymus-kortikalen Arealen Apoptose nachgewiesen werden. Grüne zytoplasmatischen Fluoreszenz (5&#39;OH DNA-Brüche) markiert kortikalen Makrophagen verdauen Kernmaterial von apoptotischen Thymozyten. Dieses Signal wird von VACC TOPO produziert, und lokalisiert zu Phagolysosomen mit DNA enthält 5&#39;OH Doppelstrang-Brüche 11,12. Red-Fluoreszenz (5&#39;PO 4 Pausen) Etiketten Kerne von apoptotischen Thymozyten nicht durch Makrophagen verschlungen. Massive Zahl von Thymozyten gleichzeitig Apoptose durch Erzeugung von 5&#39;PO 4 Doppel-Strangbrüchen begleitet, visualisiert durch Ligase-basierte Kennzeichnung. Diese Brüche sind an der nuklearen Peripherie gelegen, bildet ringförmige Muster. Alle Zellkerne werden visualisiert durch Gegenfärbung mit DAPI (blaue Fluoreszenz).

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M., Sacchi, D., Zema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+molecular+machines:+pH-induced+intramolecular+motions+in+a+fluorescent+nickel(II)+scorpionate+complex.">Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex.</a> Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).</li><li>Drexler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , (1992).</li><li>Freitas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanomedicine: basic capabilities. , (1999).</li><li>Didenko, V. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-artificial+fluorescent+molecular+machine+for+DNA+damage+detection.">Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection.</a> Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).</li><li>Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+double-strand+breaks+with+single-base+3'+overhangs+in+cells+undergoing+apoptosis+but+not+necrosis.">Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis.</a> J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).</li><li>Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells.">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li><li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft Machines: Nanotechnology and life. , (2007).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Video zeigen wir, wie zu montieren und ein Dual-Kennzeichnung DNA-Schäden Sensor. Der Sensor ist eine molekulare Maschine durch bio-molekularen Motor, ein Virus-kodierte Protein VACC TOPO mit künstlichen Komponenten verbunden angetrieben. Die vorgestellte Entwicklung beispielhaft für eine bio-fähigen Ansatz, der die Anpassung biologischer Strukturen, Architekturen und tatsächlichen Teile und Komponenten von Zellen Fürsprecher der Gestaltung von ungiftigen molekularen Skala Geräte 12,15. Diese...

<ol><li> Xylol </li><li> 80 und 96% Ethanol. </li><li> 2% ige Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) in destilliertem Wasser. </li><li> Oligonukleotid 1: Doppel-Haarnadel, dual mit Fluorescein und Tetramethylrhodamin gekennzeichnet: </li></ol> 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT R AT GCG TT-3 &#39;; F - FITC-dT; R - Tetramethylrhodamine-dT. Andere rotverschoben Fluorophore wie BODIPY TR, Rhodamin oder TAMRA kann anstelle von Tetramethylrhodamin als R verwendet werden. Alternativ können Sie Oligonukleotid 2 -. Doppel-Haarnadel Einzelzimmer mit Fluorescein (für den Nachweis von einer einzigen Art von DNA-Brüchen (DNase II-Typ) Die Einzel-Fluorophor-tragenden Sonde ist wesentlich billiger und ist praktisch, wenn ein einzelnes Art der DNA brechen, um zu kennzeichnen: 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3 &#39;; F - FITC-dT </p&gt; <ol start="5"><li> Oligonucleotid 3. Blunt-ended rhodaminmarkierten Haarnadel für die Verbesserung der in-situ-Ligation Signal mit T4 DNA-Ligase: 5&#39;-GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC-3 &#39;; R - Tetramethylrhodamine-dT </li><li> Vaccinia DNA Topoisomerase l (VACC TOPO) - 3000 U / ul (Vivid Technologies). In den ersten Versuchen verwendeten wir 215 pmol (7,1 ug) der VACC TOPO pro jede 25 ul des Reaktionsgemisches. Allerdings kann die Topoisomerase-Konzentration deutlich, ohne den Verlust der Empfindlichkeit reduziert werden. Wir haben später benutzte eine viermal geringere Menge an VACC TOPO pro Abschnitt (1,76 mg in 25 ul der Reaktionsmischung pro Abschnitt) mit ähnlichen Ergebnissen. Reduzierung der Menge des Enzyms bis 880 ng (in 25 ul der Reaktion mix) führte ein schwächeres Signal und 8,8 ng VACC TOPO produziert keine nachweisbaren Signal. </li><li> T4 DNA-Ligase 5 U / ul (Roche). Dieses hochkonzentrierte Ligase Vorbereitung gibt das beste Signal in unseren experimentellen Bedingungen. </li&gt; <li> 10 x Reaktionspuffer für T4 DNA-Ligase: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2, 10 mM Dithioerythrit, 10 mM ATP, pH 7,5 (20 ° C) (Roche). ATP in Reaktionspuffer ist einfach in sich wiederholenden Zyklen Auftauen Einfrieren zerstört. Aliquot der Puffer in kleinen 15-20 ul Portionen und bei - 20 ° C einmal verwenden. </li><li> 30% (w / v) Lösung von PEG-8000 (Sigma) in zweifach destilliertem Wasser. 15% PEG-8000 in der Reaktionsmischung stark stimuliert die Erkennung, die Erhöhung der effektiven Konzentrationen der Bestandteile Vol. Ausgrenzung. </li><li> Proteinase K (Roche) 20 mg / ml Stammlösung in destilliertem Wasser. Lagerung bei - 20 ° C. Bei der Reaktion verwenden 50mg/ml Lösung in PBS, aus dem Lager vorbereitet. Dürfen nicht wiederverwendet werden. </li><li> Vectashield mit DAPI (Vector Laboratories). </li><li> Natriumbicarbonatpuffer: 50m M NaHCO 3, 15m M NaCl, pH 8,2. </li><li> 22x22mm oder 22x40mm Glas oder Kunststoff Deckgläser. Plastic Deckgläser sind während der Reaktion vorzuziehen, da sie einere leichter aus dem Abschnitt zu entfernen. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

Natürlich vorkommende bio-molekulare Maschinen arbeiten in jeder lebenden Zelle und zeigt eine Vielzahl von Designs 1-6. Doch die Entwicklung von künstlichen molekularen Maschinen konzentriert sich auf Geräte, die gerichtete Bewegung, dh molekularen Motoren, und auf deren abgespeckte mechanische Teile (Räder, Achsen, Anhänger usw.) 7-9. Dies ahmt die Makro-Maschinen, auch wenn die physikalischen Eigenschaften essentiell für diese Geräte, wie Trägheit und Impulserhaltung, nicht verwendbar sind in der Nanowelt Umgebungen 10. Alternative Entwürfe, die sich nicht an die mechanische macromachines Systeme und Einsatz von Mechanismen in der Evolution von biologischen Molekülen entwickelt, können die Vorteile der spezifischen Bedingungen der Nanowelt zu nehmen. Außerdem Anpassung tatsächlichen biologischen Molekülen für die Zwecke der Nano-Design reduziert mögliche Gefahren der Nanotechnologie-Produkte darstellen können. Hier zeigen wir die Montage und Anwendung eines solchen Bio-fähigen konstruieren, wieemi-künstlichen molekularen Gerät, das ein natürlich vorkommendes molekulare Maschine kombiniert mit künstlichen Komponenten. Von der Enzymologie Sicht ist unser Bau eines Designer-Fluoreszenz-Enzym-Substrat-Komplex zusammen, um eine bestimmte nützliche Funktion zu erfüllen. Diese Versammlung ist per Definition eine molekulare Maschine, wie es ein 12 enthält. Doch die Integration mit dem entwickelten Teil - leitet wieder an eine neue Aufgabe, Kennzeichnung DNA-Schäden 12 - Leuchtstofflampen zwei Haarnadel. Unsere Konstruktion montiert aus einem 32-mer DNA und ein Enzym Vaccinia-Topoisomerase I (VACC TOPO). Die Maschine nutzt dann sein eigenes Material zu zwei fluoreszenzmarkierten Detektor-Einheiten (Abbildung 1) zu fertigen. Eine der Einheiten (grüne Fluoreszenz) führt VACC TOPO kovalent an seiner 3&#39;-Ende und eine andere Einheit (rote Fluoreszenz) befestigt ist ein kostenloser Haarnadel mit einem Terminal 3&#39;OH. Die Geräte sind kurzlebig und schnell wieder zusammenbauen in den ursprünglichen Bau, der anschließend recleaves.In Abwesenheit von DNA-Brüchen dieser beiden Einheiten kontinuierlich zu trennen und religate in zyklischer Weise. In Gewebeschnitten mit DNA-Schäden, die Topoisomerase-tragenden Detektoreinheit selektiv beimisst blunt-ended DNA-Brüchen mit 5&#39;OH (DNase II-Typ Pausen) 11,12, Fluoreszenzmarkierung sie. Das zweite Enzym-freien Haarnadel nach Oligonukleotid-Spaltung gebildet wird, eine 5&#39;PO 4 blunt-ended break (DNase I-Typ Pausen) 11,12 ligieren, wenn T4 DNA-Ligase ist in der Lösung vorhanden 13,14. Wenn T4 DNA-Ligase zu einem Gewebeschnitt oder einer Lösung mit DNA mit 5&#39;PO 4 blunt-ended Pausen hinzugefügt wird, reagiert der Ligase mit 5&#39;PO 4 DNA Enden, bilden semi-stabilen Enzym-DNA-Komplexe. Die stumpfen Enden Haarnadeln wird mit diesen Komplexen freigesetzt Ligase und kovalente Verknüpfung Haarnadeln, um DNA interagieren, damit die Kennzeichnung 5&#39;PO 4 blunt-ended DNA-Brüche. Diese Entwicklung verdeutlicht eine neue praktische Annäherung an the-Design von molekularen Maschinen und bietet einen nützlichen Sensor zur Detektion von Apoptose und DNA-Schäden in fixierten Zellen und Geweben.

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In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Wir zeigen die Montage und Anwendung eines molekularen Maßstab Gerät durch eine Topoisomerase Protein versorgt. Das Konstrukt ist ein bio-molekularen Sensor, der im Wesentlichen zwei Arten von DNA-Brüchen in Gewebeschnitten Etiketten durch Anbringen von zwei unterschiedlichen Fluorophoren an ihren Enden.

In-vitro-Assembly von Semi-künstliche molekulare Maschine und ihre Verwendung zum Nachweis von DNA-Schäden

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

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Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

11.5K Aufrufe.  Baylor College of Medicine. Wir zeigen die Montage und Anwendung eines molekularen Maßstab Gerät durch eine Topoisomerase Protein versorgt. Das Konstrukt ist ein bio-molekularen Sensor, der im Wesentlichen zwei Arten von DNA-Brüchen in Gewebeschnitten Etiketten durch Anbringen von zwei unterschiedlichen Fluorophoren an ihren Enden.

Serie: In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Forschung

Biotechnik

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: Eine Hochdurchsatz-96-Well-Plattform für Mess DNA-Schäden in menschlichen Zellen Microarray

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Synthese von kationisiertem Magnetoferritin für ultraschnelle Magnetisierungs von Zellen

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) has been demonstrated to increase MSC osteogenic differentiation in vitro and promote bone healing in clinical settings. Here we describe the construction of an EStim cell culture chamber and its use in treating rat bone-marrow-derived MSC to enhance osteogenic differentiation. We found that treating MSCs with EStim for 7 days results in a significant increase in the osteogenic differentiation, and importantly, this pro-osteogenic effect persists long after (7 days) EStim is discontinued. This approach of pretreating MSCs with EStim to enhance osteogenic differentiation could be used to optimize bone tissue engineering treatment outcomes and, thus, help them to achieve their full therapeutic potential. In addition to this application, this EStim cell culture chamber and protocol can also be used to investigate other EStim-sensitive cell behaviors, such as migration, proliferation, apoptosis, and scaffold attachment.

Here we present a protocol for the construction of a cell culture chamber designed to expose cells to various types of electrical stimulation, and its use in treating mesenchymal stem cells to enhance osteogenic differentiation.

Bau und Betrieb von einer Kammer elektrische Stimulation zur Verbesserung der osteogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen/Stromazellen Zellen In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

Biopartikel-Mikroarrays für chemotaktische und molekulare Analysen des menschlichen Neutrophilen-Schwärmens in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.