Dieses Protokoll ermöglicht die Kennzeichnung einzelner ependymogliale Zellen im ZebrafischTelencephalon, um ihre Langzeitüberwachung zu ermöglichen, sowie die Manipulation bestimmter Wege auf zellautonome Weise. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Einzelzellbeschriftung auf schnelle und effiziente Weise sowie die Genbearbeitung und Signalwegmanipulation auf zellautonome Weise ermöglicht. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung grundlegender zellbiologischer Fragen, z. B. zur Zelldelamination, zur Aufrechterhaltung der epitheliaalen Homöostase und zur Symmetrie der Zellteilung.
Beginnen Sie mit einem Nadelziehgerät, um Glaskapillaren vorzubereiten. Verwenden Sie Mikrolader-Spitzen, um eine vorbereitete Glaskapillare mit zehn Mikrolitern Plasmidlösung zu füllen. Dann drücken Menü wechselkapillar"auf der Injektionsvorrichtung, damit die Nadel in den Nadelhalter geladen werden kann.
Wechseln Sie dann die Injektionsvorrichtung von der Kapillare in den Injektionsmodus. Dann schneiden Sie mit einem Stereomikroskop mit vierfacher Vergrößerung und Einer Zange nur die Spitze der Kapillare. Dann drucke auf das Fußpedal, um zu bestätigen, dass die Plasmidlösungen problemlos aus der Nadel herauslaufen.
Wenn die Nadel fertig ist, übertragen Sie einen Zebrafisch aus dem Haltungsbecken in einen Behälter mit Anästhesielösung. Und warten Sie ein paar Minuten, bis die Bewegung der Kiemen nachlässt. Drücken Sie die sedierte Fisch-Rückenseite auf einen vorbenetzten Schwamm unter dem Stereomikroskop und verwenden Sie ein Edelstahl-Sezierendes Mikromesser mit einer 40-Millimeter-Schneide und einer Dicke von 0,5 Millimetern, um vorsichtig ein kleines Loch im Fischschädel an der hinteren Seite des Telencephalons zu schaffen, direkt neben dem Rand des optischen Tektums.
Neigen Sie den Fisch nach Bedarf und richten Sie die Spitze der Glaskapillare in den richtigen Winkel, um das Eindringen der Kapillarspitze durch das Loch zu erleichtern. Dann legen Sie die Spitze der Kapillare sehr vorsichtig durch die dorsale ependymale Zellschicht in das Loch ein, bis sie die telenzephalische Herzkammer erreicht, und drücken Sie das Fußpedal für etwa 10 Sekunden, um etwa 1 Mikroliter der Plasmidlösung zu liefern. Der Erfolg der Lieferung kann durch die Beobachtung der Ausbreitung der grünen Flüssigkeit im gesamten Ventrikel bestätigt werden.
Bedecken Sie den Fisch Telencephalon mit einer kleinen Menge Ultraschallgel. Für die Elektroporation des Plasmid-injizierten Tieres, entfernen Sie den Schwamm aus dem Injektionsaufbau und tauchen Sie die Innenseite der Elektrospitzen in Ultraschallgel. Positionieren Sie den Fischkopf zwischen den Elektroden, mit der positiven Elektrode an der ventralen Seite des Kopfes und der negativen Elektrode auf der dorsalen Seite.
Dann, während Sie noch den Körper des Fisches im Schwamm halten, drücken Sie die Elektroden sanft und präzise gegen das Telencephalon und verabreichen Sie den Strom mit dem Fußpedal, wobei die Elektroden an Ort und Stelle gehalten werden, bis alle fünf Impulse fertig sind. Wenn die Elektroporation erfolgreich ist, können Plasmid-markierte einzelne ependymogliaale Zellen unter den nicht-plasmidmarkierten ependymogliaalen Zellen beobachtet werden. Je nach Effizienz des Elektroporationsprozesses kann eine höhere oder geringere Anzahl von ependymogliaalen Zellen beschriftet werden.
Dennoch ergibt das demonstrierte Protokoll eine höhere Anzahl von markierten Zellen als zuvor veröffentlichte Protokolle. Beachten Sie, dass die höchste Dichte der markierten Zellen meist an der inneren ventrikulären Seite beider Hemisphären entsteht, da sich die injizierte Plasmidflüssigkeit zwischen den Hemisphären verteilt. In diesem Video wird eine Hemisphäre des Zebrafischtelencephalons in 3D dargestellt, wo die ependymogliale Zellen mit Radioprozessen in Magenta sind, wenn sie von der Seite beobachtet werden.
Durch Ko-Elektroporation mit einem anderen Plasmid, das Kerne etikettiert, kann die Zellteilung von ependymogliaalen Zellen beobachtet werden. Erfolglose Elektroporation führt zu einer sehr geringen Anzahl oder keine beschrifteten ependymogliaalen Zellen. Dorsale ependymale Zellen sind jedoch am ehesten beschriftet.
Ihr Soma ist im Quader größer und sie besitzen keine radiolänglichen Prozesse, wie aus einer Seitenansicht der ependymoglialzelligen Zellschicht ersichtlich ist. tdTomato-mem-markierte Zellen sind höchstwahrscheinlich ependymale Zellen, die sich oberhalb der Schicht von Ependymoglia befinden. Im Gegensatz dazu führt die Einführung eines tdTomato-mem, das Plasmid in einzelne ependmyogliale Zellen ausdrückt, zusätzlich zur anfänglichen Zellbeschriftung zu einer tdTomato-mem-Expression.
Die wichtigsten Dinge, die Sie sich merken sollten, sind, nur die Spitze der Kapillare zu schneiden und die ependymale Schicht während der Injektion zu durchdringen, so dass sich die Flüssigkeit über den Ventrikel ausbreitet. Diese Technik ermöglicht die langzeitige Überwachung einzelner ependymotaler Zellen durch In-vivo-Bildgebung und damit die Etablierung ihrer Rolle bei der Regeneration des Gehirns sowie ihrer enormen genetischen In-vivo-Verbindung.
