Diese Arbeit wurde durch ein NIH R15 AREA gewähren John Horne (; R15MH083221 NIMH) finanziert.

1. Transgene Embryonen <ol><li> Hier sind wir mit einer transgenen Linie von Zebrafisch durch ein Transposon-vermittelte Enhancer-trap Methode 8 erstellt haben. Die transgenen einfügen umfasst zwei codierende Sequenzen: KalTA4, ein Zebrafisch-optimierte Version des Gal4 Transkriptionsaktivator, und die rot fluoreszierendes Protein, mCherry. Die Enhancer-trap Methode liefert Linien transgener Zebrafische, dass diese transgenen Kassette ausdrückliche unter Kontrolle eines endogenen Enhancer-Sequenz. So können je nach der Identität des spezifischen Enhancer-Sequenz ist die Expression der beiden KalTA4 und mCherry auf bestimmte Regionen des sich entwickelnden Gehirns lokalisiert. Für die Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 Linie, die wir hier benutzen, ist Ausdruck auf mehrere Standorte in der Hinterhirn, Vorderhirn, lokalisiert und, von besonderer Bedeutung, den Riechkolben 8 (siehe auch Abb. 1). . Angesichts dieses Muster der Expression und Lokalisation der Kassette in das Genom, sind die Transgene voraussichtlich unter der Kontrolle der zic4 Promoter 8 (siehe auch <a href="http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/neuroimaging/lines_distel/main">http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ Neuroimaging / lines_distel / main</a> .). </li><li> Adult Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 Fische heterozygot für die transgenen einzufügen sind in der Regel mit WT (AB) Fisch gedeckt, was zu ca. 50% transgene Nachkommen. (Für einen höheren Anteil an transgenen Nachkommen können zwei Heterozygoten gepaart werden.) </li><li> Um Block Pigmentbildung und erleichtern Fluoreszenz-Imaging, behandeln transgenen Embryonen mit 100 pM N-Phenylthioharnstoff (PTU) Anfang bei 6-8 hpf. </li></ol> 2. Montage Embryonen <ol><li> Bei 24-28 hpf, Transfer Embryonen Ei Wasser ohne PTU. Identifizieren transgenen Embryos durch die Expression von mCherry mit einem Fluoreszenzmikroskop. Entfernen Sie die Chorion-Membran aus transgenen Embryonen mit feinen Pinzetten. 4: Transfer Embryonen aus ihrem Chorion auf eine Petrischale mit Elektroporation Puffer plus 0,02% Tricaine [180 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH 7,2 Elektroporationspuffer] befreit. Lassen Sie 2 Minuten, bis die Betäubung wirksam, bevor Sie fortfahren, um die Montage Schritt zu tun. </li><li> Bereiten Sie eine 0,5% ige Lösung mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose in Elektroporation Puffer plus Tricaine durch microwaving die Lösung, und das Setzen der Lösung in ein 34-37 ° C Inkubator. Sobald die Temperatur der Agarose-Lösung wurde äquilibriert, statt einen großen Tropfen (~ 500 ul) der Agarose-Lösung in die Mitte einer 60 mm Petrischale. Fügen Sie 6-8 betäubt Embryonen dieser Tropfen Agarose. </li><li> Mit feinen Pinzette (oder die feinen Enden geschnitten Microloader Pipettenspitzen), positionieren Sie den Embryonen, so dass sie alle in die gleiche Richtung ausgerichtet und in einer senkrechten Reihe. Zur Verfestigung der Agarose und Trap die Embryonen in der Lage, die Schale auf eine große Petrischale mit 2-3 mm aus Eis. </li><li> Nach Erstarren der Agarose, Überschwemmung die Schale mit Elektroporation Puffer plus Tricaine, sicherzustellen, dass die Lösung vollständig bedeckt die erstarrte Agarose fallen. </li></ol> 3. Micro-Injektion von DNA-Expressionsplasmid <ol><li> Bereiten Sie die GFP Expressionsplasmid mit einem Midi-oder Maxi-Prep Plasmid Isolation Kit (zB Qiagen). Suspend das Plasmid in einer Endkonzentration von 0,5 ug / ul in sterilem Wasser plus 0,03% Phenolrot. Für den Riechkolben Targeting hier beschriebene Experiment, wir sind mit einem Expressionsplasmid mit der kodierenden Sequenz des EGFP unter der Kontrolle von mehreren Gal4-Bindungsstellen (14 Tandem-UAS-Sequenzen und die basale Fisch-Promotor, E1b). Mit diesem Plasmid nur Zellen transgen exprimieren den Transkriptionsfaktor KalTA4 können GFP auszudrücken; so vermitteln gezielt die Expression von GFP. Hinweis: hier sind wir mit Phenolrot werden zur Visualisierung der DNA-Injektionen, die Anwendung für die Ausrichtung in anderen Regionen des sich entwickelnden Gehirns sollte, solange der Region können von den Kammern abgerufen werden. Für die Ausrichtung von anderen Zelltypen, die fluoreszierende Visualisierung benötigen, könnte Bodipy oder Quantam Dot Farbstoffe potenziell zur Injektion unter fluoreszierendem Licht zu visualisieren. </li><li> Mikroinjektion Pipetten können unter Verwendung entweder eine horizontale oder vertikale Pipette puller werden. Wärme-und Pull-Stärke-Einstellungen werden je nach Art des Abzuges, die Art der Heizkörper variieren, und die Art der Glaskapillaren. Mit einem Sutter P-30 vertikale Abzieher, verwenden Sie eine Kochstufe von 980 und einen Pull-force von 960 bis lang, konisch, scharfe Pipetten aus dünnwandigen Kapillare Borosilikat Glas mit Fäden zu erzeugen [Sutter Instrument # BF100-78 bis 10]. Microinjetion Pipetten mit diesen Einstellungen gezogen werden versiegelt und muss vor der Injektion gebrochen werden. </li><li> Verwenden Sie einen Microloader Pipettenspitze auf 1-2 ul der DNA-Plasmid-Lösung zur Injektion Pipette hinzu. </li><li> Berg-undSicherung der geladenen Pipette in die Einspritzanlage Pipettenhalter. </li><li> Pause wieder den geladenen Pipette mit feinen Pinzetten bis Druckimpulse aufgeblasen Freigabe der roten DNA-Lösung zu produzieren. Alternativ können die Spitzen wieder durch schnelles Eindringen in ein untergetaucht, gefaltet Labor Kimwipe gebrochen werden. Hinweis: Da die Injektion Pipetten zunächst versiegelt und müssen manuell gebrochen zurück, werden die Düsengröße und Injektionsvolumen variabel. Ideal Injektion Pipetten sollte verlangen, 3-5 Einspritzimpulse vollständig zu füllen den Entwicklungsländern Vorderhirn Ventrikel von 24 hpf Embryonen (100 ms Einspritzimpulse bei 40 psi). </li><li> Spritzen Sie die Plasmid-DNA-Lösung in die Ventrikel des sich entwickelnden Gehirns, so dass DNA grenzt an, Zwangs-und eingelagert in die Region des Gehirns bestimmt, der Riechkolben bilden. Der Riechkolben ist aus Zellen in die Vorderwand des Vorderhirns Ventrikel abgeleitet. So kann durch Einsetzen der Injektionspipette in die Ventrikel, so dass die Pipette wird auf dem vorderen Ende des sich entwickelnden Gehirns zeigt, zwingt Druck Injektion der DNA in und neben dem Interessenten Riechkolben. Inject DNA bis rote Farbstoff ist gut sichtbar am vorderen Ende des Vorderhirns Ventrikels. Da die DNA beginnt sofort diffuse, Verdünnen der DNA, ist es wichtig, die Elektroporation Schritt so schnell wie möglich nach der Injektion (zB innerhalb von 10 sec) vor. </li></ol> 4. Elektroporation <ol><li> Die Elektroporation erfolgt mit selbst konstruierten Elektroden aus Platin Grass subdermale Elektroden (Grass Technologie # E2) durchgeführt. Die Elektroden sind mit einem Hand-Sonde befestigt, und die endgültige Entfernung zwischen den Platin-Elektroden sollte 1 mm (für Details auf dem Bau zu sehen 9). Square-wave Elektroporation Impulse werden durch den Anschluss der Elektroden an einem Grass SD-9 Stimulator (Grass Technology, Modell SD-9) hergestellt. </li><li> Setzen Sie die SD-9-Stimulator zur Einzel-, 5 ms Elektroporation Impulse bei 70 Volt zu erzeugen. Position der Elektroden, so dass die positive Elektrode positioniert ist neben dem vorderen Ende des Embryos, während die negative Elektrode ist hinter dem Embryo Kopf. Manuell einleiten ~ 7-8 Elektroporation Impulse mit der Single-Mode-Schalter der SD-9-Stimulator, Trennen jeder Puls von ~ 1 sek. Entsprechende Spannungen variieren je nach Alter des Embryos und der Spannungsquelle eingesetzt. Jüngere Embryonen erfordern niedrigere Spannungen Embryo Schäden zu vermeiden, während ältere Embryonen höhere Spannungen benötigen, um Elektroporation 7 einzuleiten. </li><li> Lassen Sie die Embryonen für mindestens 10 min nach der Elektroporation vor ihrer Befreiung aus der Agarose zu erholen. </li><li> Mit feinen Pinzetten, kostenlos die Embryonen aus der Agarose durch vorsichtiges die Umrisse der Embryonen unter Vermeidung tatsächlichen Kontakt mit den Embryonen selbst. </li><li> Einmal befreit, kehren die Embryonen auf Eis Wasser (PTU falls erforderlich). Halten Sie diese bei 28 ° C, bis sie für die GFP-Expression abgebildet werden sollen. </li></ol> 5. Montage Embryonen für die Bildgebung <ol><li> Transfer-Embryonen aus Ei Wasser plus PTU zu Ei Wasser plus 0,02% Tricaine. Lassen Sie einige Minuten, bis die Betäubung wirksam, bevor Sie fortfahren, um die Montage Schritt zu tun. </li><li> Bereiten Sie eine 0,5% ige Lösung mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose in Ei Wasser plus Tricaine durch microwaving die Lösung, und das Setzen der Lösung in ein 34-37 ° C Inkubator. Sobald die Temperatur der Agarose-Lösung wurde äquilibriert, statt einen großen Tropfen (~ 300 ul) der Agarose-Lösung in die Mitte einer 35 mm Petrischale. Fügen Sie einen narkotisierten Embryo zu dieser Tropfen Agarose. </li><li> Mit feinen Pinzette (oder die feinen Enden geschnitten Microloader Pipettenspitzen), positionieren Sie den Embryonen, so dass sie aufrecht stehen, so dass es möglich, eine dorsale Ansicht des sich entwickelnden Gehirns mit einem aufrechten Mikroskop (inverted Bereiche wird eine andere Embryo Geometrie erfordern visualisieren, und ein anderes Gericht erlaubt Visualisierung von unten, siehe 12). Verfestigen sich die Agarose, indem Sie die Schale auf einer großen Petrischale mit 2-3 mm aus Eis. Re-Orientierung mit feinen Pinzetten wird wahrscheinlich während der Erstarrung benötigt werden, um sicherzustellen, dass der Embryo nicht fällt auf die Seite. </li><li> Nach Erstarren der Agarose, Überschwemmung die Schale mit Ei Wasser plus Tricaine sicherzustellen, dass die Lösung vollständig bedeckt die erstarrte Agarose fallen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Obwohl die GFP-Expression bereits nach 6 Stunden nach der Elektroporation beobachtet werden kann, hier zeigen wir Bilder aus einem Embryo 4 Tage nach der Elektroporation, so dass die Neuriten Struktur der Zielzellen ausreichend entwickelt hat. Die Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 transgenen enhancer trap Linie zeigt die konstitutive Expression mCherry (und KalTA4) im Hinterhirn, Kleinhirn, Vorderhirn und Riechkolben in Embryonen 5 Tage nach der Befruchtung (Abb. 1A und 1C). Embryonen, die hatte einen UAS-GFP Expressionsplasmid durch gezielte Elektroporation (wie oben beschrieben), zeigen die GFP-Expression, die Zellen des sich entwickelnden Riechkolben (Abb. 1B, 1D und 1E) beschränkt ist eingebaut haben. Nur Zellen transgen-exprimierenden die KalTA4 Transkriptionsfaktor sind in der Lage, die Expression von diesem UAS-GFP-Plasmid zu aktivieren. Der Einbau von diesem Plasmid in nicht-transgenen Embryonen zu keiner nachweisbaren GFP-Expression führen. So ist es die kombinierte Wirkung von gezielten Elektroporation von UAS-GFP und lokalisierte transgene Expression der KalTA4 Treiber, der auf exklusive Expression von GFP führt in Zellen des sich entwickelnden Riechkolben. Die GFP-exprimierenden Zellen zeigen typische axonale Projektionen der Riechkolben Mitralzellen (Abb. 1B und 1D) 10. Um Axon Projektionen visualisieren, hatte Bilder in Abbildung 1B und 1D auf hohem Niveau, so dass die Region von Zellkörpern gut waren überbelichtet ausgesetzt werden. Ein niedrigerer Exposition (Abb. 1E) zeigt, dass Zellkörper, die GFP in der Tat sind die Riechkolben (vgl. Abb. 1C und 1E.; Graue Linie markiert die Grenze der Riechkolben) lokalisiert. <img src="/files/ftp_upload/2964/2964fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Targeted GFP-Expression in den Riechkolben eines 5 dpf Zebrafischembryo. Die Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 transgenen enhancer trap Linie, zeigt die konstitutive Expression mCherry im Hinterhirn, Kleinhirn, Vorderhirn und Riechkolben (A und C, mCherry Fluoreszenz in rot dargestellt). Dieser Ausdruck mCherry ist durch transgene Gal4-Expression vermittelt. Embryonen, die mit einem UAS-GFP-Expressionsvektor wurden bei 28 hpf elektroporiert, um zielgerichtet die GFP-Expression in den Riechkolben an 5 Tagen nach der Befruchtung (B, D und E, GFP-Fluoreszenz in grün dargestellt. Gleiche Embryo als in A und C). Eine geringere Belastung Bild unten (E) zeigt, dass die GFP-Expression zu Zellkörper der Riechkolben ist begrenzt. Die graue Linie zeigt die Grenze der Riechkolben. Hellfeld (Graustufen), Grün-Fluoreszenz (grün) und rote Fluoreszenz (rot) Bilder wurden alle mit einer Olympus BX60 Fluoreszenzmikroskop zu nehmen.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Hier haben wir eine in vivo Elektroporation beschriebenen Methode in Zebrafisch, dass ein Enhancer-trap Gal4 transgene Linie um die Expression des Transgens elektroporiert zu einer bestimmten Population von Zellen, in den Entwicklungsländern Riechkolben Ziel nutzt. Dieser Ansatz kombiniert die hervorragende zeitliche Auflösung der in vivo Elektroporation 7 mit dem Zelltyp-spezifische Expression von Enhancer-trap transgenen Linien 8 vermittelt. Obwohl hier haben wir die Ausrichtung der Riechkolben beschrieben, in vivo Elektroporation kann verwendet werden, um anderen Regionen der Entwicklung des Nervensystems 7.2 Ziel sein, und Enhancer-trap-Linien sind mit gezielten Ausdruck von Gal4 in vielen verschiedenen Zelltypen oder Gewebe zur Verfügung 8, 11. Natürlich sollten diese Elektroporation Technik auch für andere combinatioral genetische Ansätze wie die LexA oder Tet-Systeme 13, 14, 15. Ein großer Vorteil der Elektroporation ist, dass es keine zusätzlichen transgenen Linien gegeben, dass ein geeigneter Gal4-line verfügbar ist zu machen. Das spart sechs Monate. In-vivo-Elektroporation ermöglicht die Aufnahme von Oligonukleotiden in Neuronen und deren Vorstufen auf welcher bestimmten Stadium des Nervensystems Entwicklung von Interesse 7. Diese zeitliche Auflösung ist besonders vorteilhaft für loss-of-function-Analyse, weil es Probleme mit Targeting-Gene, die wichtige Funktionen haben in früheren Entwicklungsstadien umgehen kann. Die Methode, die wir hier beschreiben, können auch verwendet werden, um loss-of-function-Reagenzien einschließlich RNAi-Oligonukleotiden oder Konstrukte und Morpholino Antisense-Oligonukleotide, 4, 7 enthalten sein. Plasmid-driven Reagenzien wie dominant-negative Protein-Expression von Plasmiden oder kurze Haarnadel-RNA-Plasmide können auch unter der Kontrolle eines Gal4 UAS platziert werden, so dass für die genaue Zelltyp-spezifische Expression haben wir hier für die Expression von GFP dargestellt.

Reagenzien: <ul><li> Agarose, niedrige Schmelzpunkt (Sigma, A9414) </li><li> Plasmid Midi-oder Maxi-Prep-Kit (zB Qiagen, # 12643] </li><li> Phenolrot (Sigma, P3532) </li></ul> Ausstattung: <ul><li> Kapillar-Glas mit Filament, ID = 0,78 mm; OD = 1,0 mm (Sutter Instruments, # BF100-78 bis 10) </li><li> Grass SD-9 Stimulator (Grass Technology, Modell SD-9) </li><li> Grass Platin subdermale Elektroden, gerade Nadel (Grass Technology, # E2) </li><li> Micro-loader Pipettenspitzen (Eppendorf, # X22703R) </li><li> Pipette Abzieher (z. B. Sutter, Modell P-30) </li><li> Pipette Abzieher (z. B. Sutter, Modell P-30) </li></ul>

targeting olfactory bulb neurons using combined in vivo electroporation and gal4-based enhancer trap zebrafish lines

In-vivo-Elektroporation ist eine leistungsfähige Methode für die Bereitstellung von DNA-Expressionsplasmide, RNAi-Reagenzien und Morpholino Antisense-Oligonukleotiden auf bestimmte Regionen der sich entwickelnden Embryonen, auch die der C. elegans, chick, Xenopus, Zebrafisch und Maus 1. In Zebrafisch hat in vivo Elektroporation wurde gezeigt, dass gute räumliche und zeitliche Auflösung für die Lieferung dieser Reagenzien 2-7 haben. Die zeitliche Auflösung dieser Methode ist wichtig, weil sie für den Einbau dieser Reagenzien können in bestimmten Phasen in der Entwicklung. Darüber hinaus, weil Ausdruck von elektroporiert Vektoren erfolgt innerhalb von 6 Stunden 7 ist diese Methode aktueller denn transgene Ansätze. Während die räumliche Auflösung kann sehr präzise, ​​wenn gezielt eine einzelne Zelle 2, 6, ist es oft besser, Reagenzien in eine bestimmte Zellpopulation innerhalb eines Gewebes oder Struktur zu integrieren. Bei der Ausrichtung mehrerer Zellen, in vivo Elektroporation für die Zustellung an eine bestimmte Region des Embryos eine effiziente, aber besonders in der Entwicklung des Nervensystems, ist es schwierig, spezifische Zelltypen allein durch räumlich diskreten Elektroporation Ziel. Alternativ bieten enhancer trap transgenen Linien ausgezeichnete Zelltyp-spezifische Expression der Transgene 8. Hier beschreiben wir einen Ansatz, dass transgene Gal4-basierten Enhancer-trap-Linien 8 kombiniert mit räumlich diskreten in vivo Elektroporation 7, 9, gezielt entwickeln Neuronen des Zebrafisch Riechkolben. Die Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 (ehemals GA80_9) enhancer trap line zuvor beschriebenen 8, zeigt gezielte transgene Expression mCherry vermittelt durch einen Zebrafisch optimierte Gal4 (KalTA4) Transkriptionsaktivator in mehreren Regionen des sich entwickelnden Gehirns einschließlich Hinterhirn, Kleinhirn, Vorderhirn und den Riechkolben. Um Ziel GFP-Expression spezifisch auf die Riechkolben, einem Plasmid mit der kodierenden Sequenz des GFP unter der Kontrolle mehrerer Gal4-Bindungsstellen (FH) wurde in das vordere Ende des Vorderhirns bei 24-28 Stunden nach der Befruchtung (HPF) elektroporiert. Obwohl diese Methode enthält Plasmid-DNA in mehreren Regionen des Vorderhirns, ist die GFP-Expression nur in Zellen transgen Ausdruck der KalTA4 Transkriptionsfaktor induziert. So mit dem GA080_9 transgene Linie führte dieser Ansatz zur GFP-Expression ausschließlich in den Entwicklungsländern Riechkolben. GFP-exprimierenden Zellen durch diesen Ansatz gezielt zeigten typische axonale Projektionen, wie zuvor für Mitralzellen der Riechkolben 10 beschrieben. Diese Methode könnte auch für die gezielte Verabreichung von anderen Reagenzien einschließlich kurz-Haarnadel RNA-Interferenz Expressionsplasmide, die ein Verfahren zur räumlich und zeitlich diskreten loss-of-function-Analyse würde verwendet werden.

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Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Die zeitliche und räumliche Auflösung von genetischen Manipulationen bestimmt das Spektrum der biologischen Phänomene, die sie stören. Hier haben wir zeitlich und räumlich diskreten Einsatz<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroporation, mit transgenen Linien der Zebrafisch kombiniert, um die Expression eines GFP-Transgen spezifisch induzieren in Neuronen des sich entwickelnden Riechkolben.

Targeting Riechhirn Neuronen mit kombinierten In Vivo Elektroporation und Gal4-Based Enhancer-Trap Zebrafischlinien

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

targeting-olfactory-bulb-neurons-using-combined-vivo-electroporation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

12.0K Aufrufe.  Pace University. Die zeitliche und räumliche Auflösung von genetischen Manipulationen bestimmt das Spektrum der biologischen Phänomene, die sie stören. Hier haben wir zeitlich und räumlich diskreten Einsatz In vivo Elektroporation, mit transgenen Linien der Zebrafisch kombiniert, um die Expression eines GFP-Transgen spezifisch induzieren in Neuronen des sich entwickelnden Riechkolben.

Serie: Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

Mapping und Anwendung von Enhancer-trap Flippase Expression in Larven und Erwachsene Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Forschung

Neurowissenschaften

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus-vermittelte Gen-Manipulation und Visualisierung von Riechzellen In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

Imaging Gerüche hervorgerufene Aktivitäten in der Maus Riechhirn mit Optical Reflexions-und Autofluoreszenzsignale

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Selektive Viral Transduktion von Adult-geboren olfaktorischen Neuronen für chronische In vivo Optogenetische Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Riechzellen durch nasale Biopsie Combined Erhalten mit Laser-Mikrodissektion: Ein möglicher Ansatz zum Behandlungserfolg bei Mental Disorders Studieren

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Aufzeichnung von Temperatur-induzierte neuronale Aktivität durch Calcium Überwachen von Änderungen in der Riechkolben von<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Quadruple Immunfärbung der olfaktorischen Glühbirne zur Visualisierung von olfaktorischen sensorischen Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...