Wir danken Mitglieder der Alto Labor für hilfreiche Diskussionen. Wir danken auch der molekularen und zellulären Imaging Facility am UT Southwestern Medical Center, speziell Dr. Chris Gilpin, Tom Januszewski und Laurie Mueller für technische Kompetenz und Beratung. Wir danken auch Dr. Xionan Dong für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wird durch NIH AI083359 um NMA unterstützt

Ein. Mammalian Cell Culture <ol><li> Normale Rattenniere (NRK), immortalisierten Gebärmutterhalskrebs (HeLa) oder andere geeignete Säugerzelllinien werden bei 37 ° C, 5% CO 2, unter photogeätzten Glas gerasterten Deckgläser befestigten Geschirr Zelle lebt (siehe Tabelle 1 für jede Reagenz oder Vorrichtung in diesem Protokoll verwendet) in DMEM + 10% FBS und 1% Pen / Strep. Es sollten Vorkehrungen getroffen werden, um eine sterile Umgebung beizubehalten, wenn die Arbeit mit kultivierten Säugetierzellen werden. </li><li> Je nach Ihrer Versuchszeit-line (0-5 Stunden vs 1-2 Tage nach der Injektion) die Konfluenz der Zellen sollte ~ 50% eingestellt werden oder ~ 25% betragen. </li></ol> 2. Mikroinjektion <ol><li> Planen gewünschte Protein, DNA, oder kleinen Molekülen in der Wahl der Puffer in Abhängigkeit von ihrer Zugänglichkeit für Zellkultur, zu einem Endvolumen von ~ 50 pl. Inerten fluoreszierenden Farbstoffen wie Texas Red oder Cascade Blueenthalten sind, um die mikroinjizierten Zellen kennzeichnen; Wahl der Injektion Farbstoff und fluoreszierende Sonde sollte nicht überlappenden Anregungs-und Emissionswellenlängen haben. Die Konzentration des Moleküls von Interesse für die Mikroinjektion benötigt sollte empirisch bestimmt werden, und die fluoreszierenden Farbstoffe werden üblicherweise Tracking bei 0,5-1,0 mg / ml verwendet. Typischerweise wird Rhodamin oder ein anderer Fluorophor kovalent an dein Molekül von Interesse unter Verwendung eines kommerziellen Kits befestigt jedoch andere Verfahren zur Detektion verwendet werden, können je nach Empfindlichkeit werden. Für weitere Informationen, siehe Kritische Überlegungen unten. </li><li> Filtern Sie die Injektionsmittel (~ 50 ul) durch einen 0,22 um Zentrifugalfilter. Centrifugal Filter werden über Vakuum und / oder Spritze Filtration, die Totvolumina zugeordnet haben bevorzugt. </li><li> Um die Mikroinjektionsnadel erzeugen, werden Borosilikatglas Pipetten zog mit einem flammenden-Brown Feinpipettenziehvorrichtung folgenden Herstellern Richtlinien. Alternativ MikroinjektionNadeln können von Anbietern wie Eppendorf, die Femtotip Mikroinjektion Nadeln macht erworben werden. </li><li> Sorgfältig pipettieren 4 ul Injektionsmittelkammer in die unbehelligt Ende des Mikroinjektionsnadel mit Eppendorf 20 Femtotips. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen innerhalb des herausgezogen Mikroinjektionsnadel sind. Legen Mikroinjektionsnadel in den Mikromanipulator Arm des Eppendorf FemptoJet InjectMan an einem inversen Mikroskop. Für einen guten Überblick über die Mikroinjektion Verfahren wird der Leser auf einen früheren Journal of Visualized Experiments Artikel 8 gerichtet. </li><li> Zeigen live cell Teller mit Gitternetz Deckglas und kultivierten Zellen in der Schale Inhaber des invertierten Zeiss-Mikroskop. Finden wachsenden Zellen innerhalb eines fotogeätzten Netz und beachten Sie den Gittern alphanumerische Kennung, wird diese in allen nachfolgenden Schritten verwendet werden. Idealerweise lokalisieren Zellen in der Mitte des Deckplättchens als nachfolgende Schritte werden Probentransfer an den Kanten des Deckglases begrenzt. </li><li> Manuell unteren Injektionsarm einrastet über dem Deckglas und Verwenden des Mikromanipulators Joystick und Steuerelemente, niederes Injektionsnadel nach unten, bis die Spitze sanft berührt die Oberfläche der kultivierten Zellen und drücken &#39;Limit, um eine Bewegung der Nadel über diesen Punkt hinaus zu verhindern und so brechen die zerbrechliche gezogen Borosilikatglas. Alle anderen Aspekte der Zell-Mikroinjektion werden nach Eppendorf FemtoJet InjectMan Bedienungsanleitung durchgeführt. Die Mikroinjektionstechnik wurde kürzlich verwendet, um einzelne abgesondert Virulenzproteine ​​von Bakterien 9 verstehen. </li><li> Microinject jeder anderen Zelle innerhalb des gewählten Gitters. Mit Zellen bei ~ 50% Konfluenz gezüchtet, kann man erwarten ~ 80 Zellen pro 600 um 2 Rasters (Beispiel in gezeigt. 3A). Daher wird bei Fluoreszenz-und Elektronenmikroskopie Inspektion, wird es eine n von ~ 30-40 Versuchs-und Kontrollgruppen Zellen sein. </li><li> Zeigen live-cell Teller zurück in Säugetier-Zellkultur-Inkubator für die gewünschteZeit diktiert durch die Versuchsanordnung. Alternativ kann man unmittelbar aus Mikroinjektion Zeitraffer-Mikroskopie-Analyse, um das Aussehen von besonderer subzellulären Strukturen von Interesse vor der Fixierung zu erwarten. </li></ol> 3. Fluorescent Microscopy <ol><li> Falls gewünscht, durchzuführen lebenden Zellen Zeitraffer Fluoreszenzmessungen von mikroinjizierten Zellen, wonach die Stelle der Medien mit 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylat-Puffer (pH 7,4) und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. Wenn jedoch Messungen lebenden Zellen nicht erforderlich sind, zu verwerfen Zellwachstumsmedium und fixieren die Zellen mit 5 ml 3,7% Formaldehyd in 1xPBS bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Entsorgen Fixiermittel und ersetzen mit 5 ml 1xPBS, fahren 3,2 fort. Hinweis: Es ist wichtig, nicht zu Glutaraldehyd erst nach Fluoreszenzmikroskopie ist komplett hinzuzufügen. </li><li> Legen Sie die Live-Cell-Teller mit fotogeätzten gridded Deckglas in einem Fluoreszenzmikroskop (konfokale ist nicht für thi erforderlichs Schritt) und sammeln 5-10 Hellfeld und fluoreszierenden Bildern des entsprechenden Gitters, um die Anordnung der Zellen (Abb. 4A) dokumentieren. Identifizieren derjenigen Zellen mikroinjiziert worden sind mit den Anregungs-und Emissionswellenlängen des inerten Farbstoffs Injektion (4B). Es ist wichtig, um Bilder in verschiedenen Vergrößerungen (zB 10x und 65x) zu erhalten, um die Identifikation von mikroinjizierten Zellen in nachfolgenden Schritten mit Elektronenmikroskopie erleichtern. </li><li> Mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop, sammeln ein Z-Stapel mikroinjizierten Zellen innerhalb des Gitters in Schritt 2.5 oben identifiziert. Hoher Vergrößerung (100x) wird benötigt, um Fluoreszenzbilder mit subzellulären Strukturen, die in der Elektronenmikroskopie ermittelt werden korrelieren. </li><li> Die Deckgläser werden vom Boden der Lebendzelldichte Gerichte mit handelsüblichen Entschichtungsflüssigkeit Deckglas entfernt und Zell-Seite nach oben in einem unberührten Zellkulturschale enthaltend 5 ml1xPBS. Das Deckglas wird dann für die Elektronenmikroskopie verarbeitet wie unten. </li></ol> 4. Transmission Electron Microscopy <ol><li> Ersetzen 1xPBS Puffer mit 2 ml 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylat-Puffer (pH 7,4) und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Längere Inkubationszeit, die zwar nicht notwendig, wird in der Instandhaltung von subzellulären Strukturen zu unterstützen. Hinweis: Formaldehyd allein ist keine ausreichende Fixativ für EM-Analyse. </li><li> Entfernen Fixiermittel und Beize Zellen mit der Zugabe von 2 ml 1% Osmiumtetroxid in 0,1 M Cacodylat-Puffer für 30 min mit drei Waschungen mit Cacodylatpuffer und schließlich gefolgt ersetzen aller Puffer mit ddH 2 O. </li><li> Nach Standard-EM-Protokolle, dehydrieren die Probe in einer abgestuften (70% bis 100%) Reihe von Ethanol. Bereiten Epon Harz und Deckglas Zell-Seite nach unten auf die Oberseite eines Epon Harz gefüllten Röhre. Erlauben Polymerisation für 24 Stunden bei 60 ° C. Indem Sie die fotogeätzten gridded Deckglas Zell-Seite zu tunwn auf die Epon Harz, wird sowohl die Zellen von Interesse als auch die Gittermuster der Epon Harzes während der Polymerisation überführt (Beispiel in gezeigt. 3B). </li><li> Entfernen von Deckgläsern Epon Harz durch schnell Eintauchen in flüssigen Stickstoff und / oder kochendem Wasser. Überprüfen Sie die Oberfläche des Harzes unter einem Binokular Dissektion Rahmen, um das Raster von Interesse (Hinweis: Das Gitter patter wird als Spiegelbild zu übertragen) zu lokalisieren. Verwenden Sie eine sterile Rasierklinge oder Skalpell, trim die Epon Block unten, so daß nur das Raster des Interesses an der Spitze der Epon Harzblock ist. </li><li> Verwendung Ultramikrotom erwerben Schnittserien des beschnittenen Block an der gewünschten Dicke (~ 70 nm Dicke für konventionelle TEM und ~ 250 nm Dicke zum tomographischen TEM). Kontrast in den Abschnitten mit Uranylacetat und Bleicitrat nach Standardprotokollen. </li></ol> 5. Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie <ol><li> Verlagern die Zellen von Interesse indas Elektronenmikroskop unter Verwendung von Bildern in früheren Schritten erhalten. Sobald mikroinjiziert Zellen von Interesse lokalisiert wurden, verwenden Sie die hochauflösenden konfokalen Fluoreszenz-Bildern auf Regionen innerhalb der Zelle, die von Interesse waren identifizieren. Bild diese in hoher Auflösung mittels TEM. Verwenden Sie Sehenswürdigkeiten wie die Zelle Peripherie und der Kernhülle zu bestimmen, welche fluoreszierende z-Stapel-Bild auf die EM schneiden entspricht. </li><li> Mit der Imaging-Programm Ihrer Wahl (zB Image J, Adobe Photoshop, etc.), reduzieren Sie die Deckkraft der Fluoreszenzbild zu 50% und überlagern sie auf die TEM-Aufnahme, mit denen sie korreliert. Ausrichten der Bilder durch Anpassung der Skala (erinnern Sie Proportionen) und die Drehung des konfokalen Bild, um das TEM-Bild entsprechen. Feineinstellungen Kontrast, Schärfe, usw. in dem fluoreszierenden Bild kann in der Ausrichtung zu unterstützen. Hinweis: Wir haben festgestellt, dass Heterochromatin, die Kernhülle und die Zellperipherie eine ausgezeichnete Sehenswürdigkeiten von Beihilfe darstellenin der Ausrichtung der beiden Bilder. </li></ol> 6. Kritische Überlegungen <ol><li> Stark beim Lokalisieren des injizierten kleinen Moleküls zu unterstützen, kann ein Fluoreszenz-Tag wie Rhodamin oder Fluorescein kovalent gebunden werden mit kommerziell erhältlichen Kits. Zusätzliche Informationen werden von ektopisch eine fluoreszierende subzelluläre Lokalisation Markerprotein vor Mikroinjektion gewonnen. Daher ist die Wahl der Fluorophore und inerten Mikroinjektion Markierungsfarbstoff wichtig. </li><li> Wählen Zellen, die für die Mikroinjektion Anhaften der Nähe des Zentrums des Deckplättchens sind und um die Wahl eines Rasters randnah. Daraufhin wird die größte Wahrscheinlichkeit, daß die Zellen von Interesse für die Epon Harz für Elektronenmikroskopie eingesetzt werden übertragen. </li><li> Konfluenz der Zellen iWichtig ist, wie ein voll konfluenten Platte wird Identifizierung von mikroinjizierten Zellen im Elektronenmikroskop sehr erschweren. Vielmehr Saatzellen so dass sie erreichen ~ 50% Konfluenz am Tag kurzer Experiment oder ~ 25% Konfluenz am Tag der längere (1-2 Tage) Experiment. Verwenden Sie die Position und die Form der Zellen sowie die &quot;leeren Raum als Landmarken zur Orientierung der Elektronenmikroskopie Bild. </li><li> Konfokale optische Schnittdicke sollte den Bedürfnissen des Experiments abgestimmt werden und sollten deshalb empirisch ermittelt werden 10. </li><li> Die Fixative Formaldehyd und Glutaraldehyd sollte von höchster Qualität zur Verfügung stehen. Formaldehyd wird fix die Zellen, aber bewahren die Fluoreszenzeigenschaften von beiden Proteinen und kleinen fluoreszierenden Moleküle (wie Rhodamin oder FITC). Es wird jedoch nicht erhalten, um die Strukturen hoher Auflösung EM erlauben. Glutaraldehyd bewahrt Membranen und subzellulären Strukturen zu einem hohen Grad für EM Analysesis, wird aber erheblich behindern Fluoreszenz. Daher ist das Zwei-Schritt-Fixierung kritischen sowohl Fluoreszenz-Mikroskopie und EM. Der Formaldehyd Fixierungsschritt kann, wenn die live-Zell-Messungen entfallen, als endgültige Fixierung durch Behandlung Glutaraldehyd durchgeführt werden kann. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Dieses Verfahren bietet die Möglichkeit, ein Molekül von Interesse direkt in die eukaryotische Zytoplasma Bereitstellung und Überwachung ihrer Lokalisation und / oder Effekte auf zellulärer und organeller Architektur von Millimeter bis multi-Nanometer-Auflösung. Eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus und das Verfahren ist in Abbildung 2 gezeigt. Diese Technik beruht auf Mikroinjektion von Zellen auf einem Laser-geätzte Glas gerasterten Deckplättchens (3A), die nach der konfokalen Mikroskopie, in der Lage ist, sowohl die interessierenden Zellen sowie das Gittermuster der Epon Resin Transfer gezüchtet (Abb.3B). Ein typisches Mikroinjektion CLEM Verfahren ergibt Fluoreszenz-Bildern und elektronenmikroskopische Aufnahmen, die beim korreliert, ermöglichen sowohl subzellulären Lokalisation und ultrastrukturelle Analyse. Zellen auf einer gerasterten photogeätzten Glas Deckplättchens gezüchtet werden mit einem Molekül von Interesse, nach der Hellfeld-Bilder erhalten werden (Abb. 4A) mikroinjiziert. Eine inerte Markierungsfarbstoff eingebaut wird, um mikroinjizierten Zellen von nicht-mikroinjizierten Zellen (4B) zu unterscheiden. Konfokalen z-Stapel werden erhalten unter Verwendung eines Fluorophor oder eine andere Kennung an der mikroinjizierten kleines Molekül von Interesse (4C). Die Probe wird mit Glutaraldehyd fixiert und für die Elektronenmikroskopie. Elektronenmikroskopische Aufnahmen erhalten werden und auf die Zellen, denen sie entsprechen, (4D) überlagert. Bereiche beherbergen Fluoreszenzsignale werden ausführlicher in höherer Vergrößerung inspiziert (4E </strong&gt;). <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Timeline der Mikroinjektion CLEM Verfahren. Je nach der Versuchsanordnung kann Mikroinjektion und Fluoreszenzmessungen am gleichen Tag vorgenommen werden. Herstellung der Probe für die Elektronenmikroskopie ist zeitaufwändigste aufgrund langer Inkubationen Schritte und dauert 2-3 Tage. TEM-Analyse und Korrelation Fluoreszenzsignale mit Elektronenmikroskopie Bilder können an einem Tag durchgeführt werden. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2 Allgemeine Darstellung der Mikroinjektion CLEM Schritt 1:.. Suchen wachsenden Zellen auf Laser-geätzten Glas gridded Deckglas und microinject Molekül von Interesse. Schritt 2:. Erfassung sowohl Hellfeld-Bildern und konfokale Fluoreszenz-z-Stapel mikroinjizierten Zellen Schritt 3: vorbereitenDeckglas für EM-Analyse und betten in Epon Harz. Mit transferiert Raster, Trimmblock, so dass Zellen von Interesse sind an der Spitze. Schritt 4: Schneiden Sie serielle Abschnitte mit Ultramikrotom. Schritt 5: Korrelation fluoreszierende Bilder mit EM Bildern. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> . Abbildung 3 Grid-Muster erleichtert die Identifizierung von Zellen von Interesse Panel A zeigt die Mikroinjektion von Zellen gezüchtet, um ~ 50% Konfluenz;. Beachten Sie das Gitter Kennung aK. Maßstabsbalken 100 um ist. Tafel B zeigt das übertragene Gittermuster aus dem Deckglas auf dem polymerisierten Harz Epon Block, sektioniert wird seriell hinter das Gitter von Interesse in einer Dissektionsmikroskop identifiziert wird. Tafel C zeigt das übertragene Gittermuster in Vorbereitung zur Sektionierung . Beachten Sie, dass die übertragenen Grid patter in umgekehrter auf dem Harz Block; scale Bar ist 1200 um. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> .. Abbildung 4 Repräsentative Ergebnisse aus Mikroinjektion korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie Panel A zeigt die Hellfeld-Aufnahme NRK wachsenden Zellen auf einem Laser-geätzten Glas gridded Deckglas; Pfeile zeigen zwei Zellen, visualisiert durch CLEM in Platten CD sind Panel B zeigt die Fluoreszenz. des inerten Markierungsfarbstoff, in diesem Fall Cascade Blue, verwendet wurden, um Zellen zu identifizieren, mikroinjiziert. Tafel C zeigt die Überlagerung von Hellfeld und die Fluoreszenz Signatur eines Rhodamin-markierte kleine Molekül. Die beiden Zellen sind hier dargestellt durch Pfeile in Abb. A &amp; B. Tafel D darstellt CLEM von Hellfeld, fluoreszierenden und Elektronenmikroskopie ergab;. Pfeilspitze zeigt fluoreszierenden puncta abzubildenden bei höheren Vergrößerung im Panel E Maßstabsbalken sind wie folgtTiefen: Panels A &amp; B, 100 &amp;mgr; m; C &amp; D, 50 um; E, 100 nm.

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Keine Interessenskonflikte erklärt werden.

Das hier vorgestellte Verfahren ermöglicht die direkte Abgabe des gereinigten Proteinen, Nukleinsäuren, oder kleinen Molekülen an die eukaryotischen Zytoplasma und liefert ultrahochauflösende Analyse durch die Korrelation von fluoreszierenden und Elektronenmikroskopie. Die Anwendung dieser Methode ist einfach, aber robust und kann in-house mit vielen bestehenden Core Facilities und / oder entsprechend ausgestattete Elektronenmikroskopie Labors durchgeführt werden. Die Technik eignet sich auch, um Live-Zelle, so das...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Fotoätzteile Coverslip und Live-cell Platte </td><td> MatTek </td><td> P35G-2-14-CGRD </td><td></td></tr><tr><td> Texasrot </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> Cascade Blue </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamin Labeling Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 um Zentrifugalfiltration Einheit </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikatglas Pipetten </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Feinpipettenziehvorrichtung </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modell P-97 </td><td> Mit dem Programm # 4 nach Durchführung Ramp Test </td></tr><tr><td> FemtoJet Mikroinjektions-System </td><td> Eppendorf </td><td> InjectMan NI2 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslip Removal Flüssigkeit </td><td> MatTek </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai Transmission Electron Microscope </td><td> FEI </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> Leica </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets

Die eukaryotische Zelle beruht auf komplexen, stark regulierten und funktionell unterschiedlichen membrangebundene Kompartimente eine biochemische Polarität notwendig für korrekte zelluläre Funktion zu bewahren. Verstehen, wie die Enzyme, Proteine ​​und Zytoskelett-Komponenten und regeln pflegen diese biochemischen Segregation ist daher von größter Bedeutung. Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Moleküle und / oder stören subzellulären Kompartimenten hat eine Fülle von Wissen nachgegeben und zu unserem Verständnis der zellulären Regulation lokalisieren. Bildgebende Verfahren wie fluoreszierende und konfokale Mikroskopie machen Ermittlung der Position eines fluoreszierend markierten Kleinmolekül relativ einfach, jedoch wird die Auflösung des sehr kleinen Strukturen 1 begrenzt. Auf der anderen Seite hat Elektronenmikroskopie Einzelheiten subzellulären Morphologie bei sehr hoher Auflösung offenbart, sondern seine statische Natur erschwert hochdynamischen Pro messenProzesse mit Präzision 2,3. So ergibt die Kombination von Lichtmikroskopie mit Elektronenmikroskopie der gleichen Probe, genannt Korrelative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, die zwei Vorteile ultraschnellen Fluoreszenz-Bildgebung mit hoher Auflösung der Elektronenmikroskopie 6. Diese leistungsstarke Technik wurde eingeführt, um viele Aspekte der Zellbiologie 5,7 studieren. Seit seiner Gründung hat sich dieses Verfahren unsere Fähigkeit zur subzellulären Architekturen und Morphologien in hoher Auflösung zu unterscheiden erhöht. Hier präsentieren wir eine optimierte Methode zur raschen Durchführung Mikroinjektion von CLEM (Abb. 1) gefolgt. Die Mikroinjektion CLEM Verfahren kann verwendet werden, um bestimmte Mengen von kleinen Molekülen und / oder Proteine ​​direkt in der eukaryotischen Zelle Zytoplasma einzuführen und die Wirkungen von Millimeter zu Multi-Nanometer-Auflösung (Abb. 2). Die Technik basiert auf der Grundlage MikroinjizierenZellen auf Laser Ätzglas gerasterten Deckgläser befestigt an der Unterseite der Lebendzelldichte Geschirr und Bildgebung sowohl konfokale Fluoreszenz-und Elektronenmikroskopie gewachsen. Lokalisierung der Zelle (n) von Interesse vom Gittermuster, die leicht übertragen wird, zusammen mit den Zellen von Interesse zur Epon Harz zur Immobilisierung von Proben verwendet und Schaltstellen vor elektronenmikroskopische Analyse (Abb. 3) erleichtert. Überlagerung von Fluoreszenz-und EM-Bilder ermöglicht dem Benutzer, die subzelluläre Lokalisation sowie jegliche morphologischen und / oder ultrastrukturelle Veränderungen durch die mikroinjizierten Molekül von Interesse (Abb. 4) induziert wird. Diese Technik ist zugänglich Zeitpunkten von ≤ 5 s bis zu einigen Stunden, abhängig von der Natur des mikroinjizierten Probe.

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Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Die CLEM Technik angepasst worden, um ultrastrukturelle Morphologie der Membranen, Organellen und subzelluläre Strukturen mikroinjizierten Moleküle beeinflusst analysieren. Diese Methode kombiniert die leistungsstarke Techniken der Mikromanipulation / Mikroinjektion, konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Elektronenmikroskopie zu ermöglichen Millimeter bis multi-Nanometer-Auflösung. Diese Technik ist zugänglich für eine breite Vielzahl von Anwendungen.

Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie (CLEM) als Werkzeug zur Visualisierung mikroinjiziert Moleküle und ihre Eukaryotic Sub-zellulären Targets


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

19.0K Aufrufe.  University of Texas Southwestern Medical Center. Die CLEM Technik angepasst worden, um ultrastrukturelle Morphologie der Membranen, Organellen und subzelluläre Strukturen mikroinjizierten Moleküle beeinflusst analysieren. Diese Methode kombiniert die leistungsstarke Techniken der Mikromanipulation / Mikroinjektion, konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Elektronenmikroskopie zu ermöglichen Millimeter bis multi-Nanometer-Auflösung. Diese Technik ist zugänglich für eine breite Vielzahl von Anwendungen.

Serie: Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Elektroantennographischer Bioassay als Screening-Instrument für Wirtspflanzen Volatile

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Forschung

Biologie

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused throughout tissues made of diverse cell types, such as enteroendocrine cells of the intestinal epithelium. These gastrointestinal sensors of food and bacteria have been difficult to study because they are dispersed among other epithelial cells at a ratio of 1:1,000. Recently, transgenic reporter mice have been generated to identify enteroendocrine cells by means of fluorescence. One of those is the peptide YY-GFP mouse. Using this mouse, we developed a method to correlate confocal and serial block-face scanning electron microscopy. We named the method cocem3D and applied it to identify a specific enteroendocrine cell in tissue and unveil the cell&#8217;s ultrastructure in 3D. The resolution of cocem3D is sufficient to identify organelles as small as secretory vesicles and to distinguish cell membranes for volume rendering. Cocem3D can be easily adapted to study the 3D ultrastructure of other specific cell types in their native tissue.

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Korrelat konfokale und 3D-Elektronenmikroskopie eines spezifischen Sinneszelle

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Rasterelektronenmikroskopie von Mazerierte Gewebe zu visualisieren die extrazelluläre Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

Vorbereitung der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen mit chemischen Trocknung für die morphologische Analyse in Rasterelektronenmikroskopie (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Kryo-elektronenmikroskopische Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Studien mit einem neuartigen Robotersystem, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal details that are important for understanding the autophagic process. However, EM methods often lack molecular information, obstructing the correlation of ultrastructural information obtained by EM to fluorescence microscopy-based localization of specific autophagy proteins. Furthermore, the rarity of autophagosomes in unaltered cellular conditions hampers investigation by EM, which requires high magnification, and hence provides a limited field of view.
In answer to both challenges, an on-section correlative light-electron microscopy (CLEM) method based on fluorescent labeling was applied to correlate a common autophagosomal marker, LC3, to EM ultrastructure. The method was used to rapidly screen cells in fluorescence microscopy for LC3 labeling in combination with other relevant markers. Subsequently, the underlying ultrastructural features of selected LC3-labeled spots were identified by CLEM. The method was applied to starved cells without adding inhibitors of lysosomal acidification.
In these conditions, LC3 was found predominantly on autophagosomes and rarely in autolysosomes, in which LC3 is rapidly degraded. These data show both the feasibility and sensitivity of this approach, demonstrating that CLEM can be used to provide ultrastructural insights on LC3-mediated autophagy in native conditions-without drug treatments or genetic alterations. Overall, this method presents a valuable tool for ultrastructural localization studies of autophagy proteins and other scarce antigens by bridging light microscopy to EM data.

Here, we present a protocol for optimized on-section correlative light-electron microscopy based on endogenous, fluorescent labeling as a tool to investigate the localization of rare proteins in relation to cellular ultrastructure. The power of this approach is demonstrated by ultrastructural localization of endogenous LC3 in starved cells without Bafilomycin treatment.

Ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 mittels korrelativer Lichtelektronenmikroskopie

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Neuartiges Protokoll zur gleichzeitigen Fluoreszenz- und Ultrastrukturkonservierung

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence microscopy (FM) and the context of cellular ultrastructure acquired by electron microscopy (EM). CLEM is a trade-off between fluorescence and ultrastructure, and usually, ultrastructure compromises fluorescence. Compared with other hydrophilic embedding resins, such as glycidyl methacrylate, HM20, or K4M, Epon is superior in ultrastructure preservation and sectioning properties. Previously, we had demonstrated that mEosEM can survive osmium tetroxide fixation and Epon embedding. Using mEosEM, we achieved, for the first time, Epon post embedding CLEM, which maintains the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. Here, we provide step-by-step details about the EM sample preparation, the FM imaging, the EM imaging, and the image alignment. We also improve the procedures for identifying the same cell imaged by FM imaging during the EM imaging and detail the registration between the FM and EM images. We believe one can easily achieve Epon post embedding correlative light and electron microscopy following this new protocol in traditional EM facilities.

Autor im Rampenlicht: Fortschritte in der korrelativen Licht- und Elektronenmikroskopie mit der Konservierung fluoreszierender Proteine

We present a detailed protocol for Epon post-embedding correlative light and electron microscopy using a fluorescent protein called mScarlet. This method can maintain the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. This technique is amenable to a wide variety of biological applications.