Die Lokalisierung von Proteinen im Kontext der Zellultrastruktur ist seit Jahrzehnten ein leistungsfähiges Forschungswerkzeug. Mit diesem Protokoll haben wir die Proteine erweitert, die in geringer Häufigkeit vorhanden oder schwer zu finden sind. Wir verwenden die Fluoreszenzmikroskopie, um Proteine empfindlich und screenbar zu markieren, und kombinieren sie mit der Elektronenmikroskopie, um die Ultrastruktur der Zelle wieder aufzufüllen.
Hier werden wir CLEM auf Autophagie-Proteinen demonstrieren, aber es kann wirklich auf jede biologische Fragestellung angewendet werden, bei der die Ultrastruktur der Zelle von Interesse ist, insbesondere bei der Untersuchung seltener Ereignisse. Tineke Veenendaal, eine leitende Forschungstechnikerin aus unserem Labor, wird mir das Verfahren vorführen. Ersetzen Sie zunächst das PBS mit 0,15 % Glycin durch 1 % Gelatine in PBS, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt ist.
Die Zellen werden abgeschabt und in Gelatine in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Pelletieren Sie die Zellen bei 6.000 G für eine Minute bei Raumtemperatur in einer Mikrozentrifuge und entfernen Sie dann die Gelatine, ohne das Pellet zu stören. Dem Pellet wird 12%ige auf 37 Grad Celsius erwärmte Gelatine zugegeben und durch Pipettieren mit Pipettenspitzen oder auf die gleiche Temperatur vorgewärmten Weidepipetten vorsichtig resuspendiert.
10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren und dann eine Minute lang bei 6.000 g pelletieren. Die Gelatine 30 Minuten auf Eis erstarren. Um die in Gelatine eingebetteten Zellen aus dem Röhrchen zu entfernen, schneiden Sie das Röhrchenende, das das Pellet enthält, mit einer Rasierklinge vom Rest des Röhrchens ab.
Schneiden Sie dann das Röhrchenende mit dem Zellpellet senkrecht zum ersten Schnitt in zwei Hälften. Die beiden Rohrendenhälften mit dem Zellpellet in 2,3 molare Saccharose legen und 10 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Dadurch schrumpfen die Zellpellethälften leicht und lösen sich aus dem Kunststoffschlauch.
Entfernen Sie die Tubenhälften mit dem in Gelatine eingebetteten Zellpellet aus der Saccharose und entfernen Sie dann die Zellpellethälften mit einer Pinzette aus den Kunststoffröhrchenhälften. Schneiden Sie das Pellet manuell mit einer Rasierklinge in Blöcke geeigneter Größe und verwenden Sie ein Stereo-Präpariermikroskop, um das Motiv während des Schneidens zu vergrößern. Inkubieren Sie die Zellblöcke über Nacht in 2,3 molar Saccharose bei vier Grad Celsius.
Legen Sie sie auf einen Probenhalterstift aus Aluminium. Lassen Sie so viel Saccharose um die Ränder des Blocks, dass sie einen dünnen Kragen zwischen dem Block und der Nadel bildet. Einfrieren und in flüssigem Stickstoff aufbewahren.
Schneiden Sie die Vorderseite des Blocks ab, um seine Oberfläche abzuflachen, um etwa 250 Nanometer dicke Abschnitte zu erhalten. Schneiden Sie dann die Seiten des Blocks ab, indem Sie 50 bis 100 Mikrometer in die Seite der Probenblockfläche mit der Messerecke schneiden. Durch das Trimmen von vier Seiten der Probenblockfläche entsteht ein etwa 250 x 375 Mikrometer großes Rechteck.
Schneiden Sie ein Band aus dem hervorstehenden Rechteck und stellen Sie sicher, dass die Abschnitte zwischen 70 und 90 Nanometer dick sind und einen silbrig-goldenen Glanz haben. Führen Sie die Abschnitte mit einem Haar an einem Stock von der Schneide des Diamantmessers weg, um ein langes Band zu bilden. Nehmen Sie das Farbband auf, indem Sie die drei Millimeter lange Tonabnehmerschlaufe in eine Eins-zu-Eins-Mischung aus 2,3 molar Saccharose und 2 % Methylcellulose tauchen.
Führen Sie die Schlaufe in die Kältekammer des Mikrotoms ein, und sobald das Tröpfchen zu gefrieren beginnt, nehmen Sie die Abschnitte sofort auf, indem Sie das Tröpfchen vorsichtig dagegen drücken. Entfernen Sie die Schlaufe aus der Kältekammer. Warten Sie, bis der Tropfen vollständig aufgetaut ist, und drücken Sie den Tropfen auf ein vorbereitetes Gitter.
Legen Sie die Gitter mit Abschnitten auf etwa einen Milliliter PBS in eine kleine Schale oder eine Multi-Well-Platte und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Verarbeiten Sie die Gitter auf rund 75 Mikroliter Tröpfchen auf Parafilm und beginnen Sie mit PBS-Glycin-Waschungen bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Gitter mit einem Blockierungspuffer aus 0,1 % Rinderserumalbumin C und 0,5 % Fischhautgelatine in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur als Blockierungsschritt.
Verdünnen Sie Primärantikörper in Blockierungspuffer in PBS und inkubieren Sie die Gitter auf etwa 10 Mikrolitertröpfchen dieser Lösung für eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Gitter fünfmal bei Raumtemperatur in 0,1%igem Rinderserumalbumin in PBS. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper und DAPI im Blockierungspuffer in PBS.
Inkubieren Sie dann die Gitter auf etwa 10 Mikrolitertröpfchen dieser Lösung für 30 Minuten oder länger bei Raumtemperatur, bevor Sie die Gitter fünfmal in PBS waschen, wie zuvor gezeigt. Um die Proben für die Lichtmikroskopie zu montieren, tauchen Sie die Gitter zweimal für fünf Minuten bei Raumtemperatur in 50%iges Glycerin in destilliertes Wasser. Platzieren Sie ein Gitter pro Deckglas zwischen einem Objektträger und einem Deckglas aus 50%igem Glycerin und achten Sie darauf, dass die Abschnitte zum Deckglas zeigen.
Für die Lichtmikroskopie nehmen Sie einen Objektträger mit den Sandwichgittern zu einem Weitfeldmikroskop mit einem automatisierten Tisch. Wählen Sie ein Ölobjektiv mit hoher Vergrößerung aus, und erstellen Sie einen Bildkachelsatz des Menübands der Abschnitte. Als Nächstes geben Sie für die Demontage und Elektronenmikroskopie oder EM-Kontrastierung 10 Mikroliter destilliertes Wasser an die Seite des Glasobjektträger-Deckglas-Sandwiches und warten Sie, bis die Kapillarwirkung die Glasdeckglas-Sandwich-Schnittstelle gefüllt hat.
Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas, ohne Immersionsöl in das Glycerin zu mischen. Holen Sie die Gitter mit einer Pinzette heraus und tauchen Sie sie dreimal bei Raumtemperatur in destilliertes Wasser, um das 50%ige Glycerin abzuwaschen. Trocknen Sie die Rückseite des Gitters vorsichtig mit einem fusselfreien Seidenpapier ab und legen Sie das Gitter mit der Teilseite nach unten auf destillierte Wassertropfen.
Um die Schnitte für den Kontrast in der Elektronenmikroskopie zu färben, inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit Uranylacetat. Kühlen Sie die Uranylacetat-Methylcelluloselösung ab, indem Sie die Tröpfchen auf Parafilm auf eine Metallplatte auf Eis legen. Waschen Sie dann die Gitter zweimal mit dieser eiskalten Lösung und inkubieren Sie sie 10 Minuten in der Lösung.
Schlaufe die Gitter aus, indem du eine Gittertrocknungsschleife in das Uranylacetat-Methylcellulose-Tröpfchen unter jedem Gitter einführst und vorsichtig anhebst, bis das Gitter vom Tropfen abgezogen wird. Um die überschüssige Lösung abzutupfen, berühren Sie die Schlaufe in einem Winkel von etwa 60 Grad auf das fusselfreie Filterpapier und ziehen Sie sie langsam über das Papier, bis keine Lösung mehr absorbiert wird. Legen Sie die Schlaufe mit dem Gitter in ein geeignetes Gestell und lassen Sie sie bei Raumtemperatur länger als 10 Minuten trocknen.
Verwenden Sie die durch die Lichtmikroskopie erhaltene Übersicht, um einen Bereich von Interesse für die Bildgebung im Transmissionselektronenmikroskop oder TEM zu lokalisieren, und kommentieren Sie den ROI im Lichtmikroskopie-Datensatz. Sobald ein Bereich ausgewählt ist, erhalten Sie eine Bildkachel mit 20.000- bis 50.000-facher Vergrößerung im TEM. Rekonstruieren Sie den Bildkachelsatz in der Nachbearbeitungssoftware.
Führen Sie die Korrelation basierend auf DAPI-Signalen und Fluoreszenz- und Kernkonturen in der Elektronenmikroskopie durch. Verschieben Sie die Bilder, um sie präzise zu überlagern und die manuelle Korrelation genau durchzuführen. Hepatoblastom-abgeleitete HEPG2-Zellen wurden zwei Stunden lang in EBSS ausgehungert, bevor sie zwei Stunden lang mit 4%Paraldehyd fixiert wurden.
Die IF-Bildgebung von LC3 und LAMP1 auf Schnitten zeigt relativ wenige LC3-Punkte und eine geringe Kolokalisation mit LAMP1. Molekulare Informationen von IF wurden mit den ultrastrukturellen Informationen verknüpft, die in der Elektronenmikroskopie gewonnen wurden, indem die beiden Bildgebungsmodalitäten auf der Grundlage von DAPI und Kernkonturen überlagert wurden. Die Korrelation der LC3-positiven Organellen mit der EM-Ultrastruktur zeigte, dass die verschiedenen Puncta unterschiedliche Stadien der Autophagie repräsentierten.
Die Ultrastruktur der einzelnen LC3-beschrifteten Kompartimente, wie sie in Kasten eins veranschaulicht wird, ist hier dargestellt. Die korrelativen lichtelektronenmikroskopischen Bilder sind auf der linken Seite und die pseudofarbigen Elektronenmikroskopiebilder auf der rechten Seite zu sehen. Innere und äußere autophagosomale Membranen sind durch weiße und schwarze Pfeilspitzen gekennzeichnet.
Interessanterweise identifizierte EM relativ schwache fluoreszierende Flecken als LC3-positive Autolysosomen, die sich durch dichten Inhalt und intraluminale Vesikel auszeichnen. Dies zeigt eine minimale LC3-Sichtbarkeit in IF von ultradünnen Kryoschnitten, was darauf hindeutet, dass LC3 trotz der abbauenden Umgebung in stationären Autolysosomen nachweisbar ist. LC3-positive Punkte repräsentieren jedoch hauptsächlich Autophagosomen, während nur wenige Autolysosomen repräsentieren.
Für Forscher, die eine Immunogold-Markierung anstelle von On-Section-CLEM durchführen möchten, sind die hier beschriebenen Protokolle und Tipps auch für die Immunogold-Markierung uneingeschränkt anwendbar. Wir haben CLEM zunächst auf endosomale regulatorische Proteine mit geringer Häufigkeit angewendet und zum ersten Mal ihre endogene ultrastrukturelle Lokalisation gezeigt.
