Die Autoren bedanken sich bei Travis Wheeler und die Werkstatt am Institut für Zellbiologie und Physiologie, University of Pittsburgh für den Bau des Kryo-Fluoreszenzprobe Bühne Changlu Tao und Cheng Xu an der University of Science and Technology of China danken für die technische Unterstützung und Dr. Teresa Brosenitsch für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (GM082251 &amp; GM085043) unterstützt.

1. HeLa Zellkultur auf Kohlenstoff-beschichteten Gold EM Finder Grids <ol><li> Glimmentladung die Kohlenstoff-Seite eines 200-mesh R2 / 2 Quantifoil Gold EM finder Gitter unter 25 mA für 25 sek. </li><li> Bestreichen Sie die EM-Raster mit Fibronektin, von schwimmenden es, Kohlenstoff-Seite nach unten auf ein 40 ul Tröpfchen von 50 ug / ml Fibronektin-Lösung, dann desinfizieren sie unter UV-Licht für 2 Stunden in einer Gewebekultur Kapuze. </li><li> Teller HeLa-Zellen auf das Gitter in einer Dichte von 2 x 10 4 Zellen / ml (insgesamt 2 ml Kultur) in einem Glas-bottom Kulturschale wachsen und die Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2, in DMEM mit 4,5 ergänzt g / L L-Glutamin und Glukose, 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, für ungefähr 18 Stunden. HeLa-Zellen werden nach der O / N-Kultur infiziert. </li></ol> 2. HIV-1-Infektion und Live-Cell-Imaging <ol><li> In einer fluoreszierenden Zelle tracker (Red CMTPX, 1 ul / 2 ml) in den Glasboden-KulturSchale (aus Stufe 1.3) und Inkubation die Schale bei 37 ° C für 10 min, damit der Fluoreszenzfarbstoff up-nehmen. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit PBS und 50 ul vorgewärmte frisches Medium. </li><li> Die Schale auf den Live-Cell Kammer bei 37 ° C, einer Wischfeld Konfokalscanner Mikroskop. Wählen Sie mehrere Felder (10-15 Positionen), die 1-3 Zellen / square enthalten, die mit den Zellen zwischen zwei Phasen der Mitose, wenn sie am meisten ausgebreiteten und flach (siehe Abbildungen 2c und 2d), da sind Kryo-EM erfordert relativ dünnen Bereiche der Probe. Bewahren Sie diese Positionen für zukünftige Bildgebung (Schritt 2.5). </li><li> Infizieren die Zellen mit VSV-G pseudo-typisierte HIV-1 Partikel, die GFP-Vpr enthalten (wir verwenden 40 ul einer Probe mit 40 ng / ml p24). Beim Hinzufügen der Viruspartikel in den Boden der Schale, vorsichtig zu stören die EM Netz, da die Positionen für die Bildgebung bereits ausgewählt und gespeichert wurden. </li><li> Unmittelbar nach Zugabe von Virionen, sammeln time-verfallen Hochgeschwindigkeits-3D-konfokale Bilder, auf den zuvor ausgewählten Positionen (aus Schritt 2.3) für 20-40 min. </li><li> Konfokale Bilder wurden unter Verwendung MetaMorph und analysiert durch automatisierte 3D particle tracking für einzelne Partikel Dynamik mit Imaris Software (siehe Abbildung 1). Da wir Korrelation des dynamischen Verhaltens von beugungsbegrenzter sind HIV-1 Partikel mit zellulären Ultrastruktur, Zeitraffer-Live-Cell-Imaging und 3D particle tracking sind entscheidend für die Ergebnisse. Jedoch für eine große und statische Struktur, würde eine einfache Fluoreszenzbild (ohne lebende Zellen) ausreichend für die korrelative Analyse. </li></ol> 3. Frozen-hydratisiert EM Probenvorbereitung Um die Zeitverzögerung zwischen Sammlung der letzten Konfokalbild und Kryo-Fixierung der Probe zu minimieren, sollte die FEI Vitrobot (oder einem anderen Gerät Verglasung) initiiert und vorbereitet für Sprung-Einfrieren während der Sammlung der Fluoreszenz konfokale Live-Cell-Bildern.<ol><li> Schalten Sie das Gerät und Verglasung gesetzt sein Klima Temperatur auf 22 ° C, das Ziel Luftfeuchtigkeit bis 100%, das Löschpapier auf 7 sec, und das Warten und Drain auf 1 sek. </li><li> Legen Sie die Grid-Storage-Box in der Kolben Dewar und bereiten kalt flüssigem Ethan. Montieren Sie den Dewar auf die Verglasung Gerät. </li><li> Unmittelbar nach konfokale Live-Cell-Imaging (Abschnitt 2), legen Sie die Kulturschale auf einer eisgekühlten Kupfer Block und überträgt es auf die Kryo-EM Probenvorbereitung Zimmer. Laden Sie die EM Gitter auf den spezialisierten Pinzette und schnell auslöschen entfernt alle Medien in der Startaufstellung. Der Blot wird manuell mit Filterpapier getan, woraufhin 4 ul von 15 nm Gold Bead-Lösung mit 0,2 um fluoreszierende Mikrosphären wird sofort auf dem Gitter platziert gemischt. Die Gold-Kügelchen sind als Bezugsmarker zur tomographischen Datenerhebung und Ausrichtung zu unterstützen. Die fluoreszierende Mikrosphären werden verwendet, um Korrelation zwischen Fluoreszenz-und Kryo-EM-Bilder unterstützen (siehe Abbildungen 2c-2f). </li><li> Legen Sie die Pinzette auf die Verglasung und Gerät anweisen, das Gerät zu tilgen und stürzen Einfrieren in flüssigem Ethan 16. Die Blot-Parameter optimiert, um beste Ergebnis zu erzielen sind: Blot Zeit, 7 sec; Blot Offset, 0; Drain Zeit, 1 sec, Temperatur, 22 ° C und Luftfeuchtigkeit 100%. </li><li> Übertragen der tiefgefrorenen Gitters an eine Kryo-EM-Halter zum sofortigen cryoET Bildgebung oder einer Lagerung in flüssigem Stickstoff Dewar zur späteren Verwendung. </li></ol> 4. Cryo-Fluoreszenz Lichtmikroskopie Eine selbst gebaute, Kryo-Fluoreszenz Probenraum und Bühne (Abbildung 3), die zur Durchführung Schritte 4,1-4,10. Die detaillierten Spezifikationen und Beschreibung der Stufe kann in Juni et al. 15 gefunden werden. <ol><li> Füllen Sie ein selbst unter Druck flüssigem Stickstoff Dewar mit flüssigem Stickstoff mindestens 2 Stunden vor dem Start Kryo-Fluoreszenz Lichtmikroskopie (siehe Abbildung 3a). </li><li> Montieren Sie einen selbstgebauten Kryo-fluorescence Probe Stufe 15 (Abbildung 3) auf einem invertierten Fluoreszenz-Mikroskop, wie ein Olympus IX 71. </li><li> Verbinden Sie den flüssigen Stickstoff Einlass der Kryo-Probe auf die Bühne selbst unter Druck Dewar und platzieren Sie den flüssigen Stickstoff Überlaufschutz Steckdose in einen geeigneten Behälter. Schließen Sie ein trockenes Stickstoffgas Linie mit einer Hülse über dem Objektiv, damit die Linse warm und frostfrei platziert. </li><li> Legen Sie eine Kupfer-Block-Plattform (schwarzer Pfeil in Abb. 3b) in der Kryo-Kammer Bühne für das Laden der tiefgefrorenen Probe Netz. Abkühlen und füllen das Kupfer Kammer des Kryo-Bühne mit flüssigem Stickstoff durch die Zuleitung von der selbst unter Druck Füllung Dewar. </li><li> Wenn die Kryo-Bühne Temperatur von flüssigem Stickstoff (in ~ 4-6 min) erreicht, übertragen Sie die Grid-Storage-Box (aus Schritt 3.5) mit dem Kryo-Bühne. </li><li> Legen Sie die tiefgefrorenen Probe Gitter in der EM Probe Patrone auf dem Kupfer-Block und klemmen Sie den glos in Ort mit einem C-Ring (bei ​​Verwendung eines Mikroskops Polara Kartusche), oder legen Sie eine vorgekühlte Kupfer Ring an der Oberseite (schwarz Pfeilspitze in Abbildung 3d), um das Raster in Position zu halten und auch für einfache Wiederherstellung des Netzes nach Kryo-Fluoreszenz-Bildgebung (wenn für eine nicht-Polara Kryo-Elektronenmikroskop). </li><li> Platzieren der Kassette (aus Schritt 4.6) in den Innenraum des Cryo-Stufe (weiße Pfeilspitze in Fig. 3b). </li><li> Suchen und finden Sie die gleichen Viruspartikeln aus den Live-Cell-Imaging-Daten. Da die EM Grid hat einen Index, ist es einfach zu lokalisieren dasselbe Teilchen auf dem Gitter in beiden Live-Cell-Bilder und Kryo-Blüte Bilder. </li><li> Erwerben Kryo-DIC-und GFP-Bilder an den identifizierten Positionen unter Kryo-Zustand mit einem Lichtmikroskop mit einem langen Arbeitstag (2.7-4 mm) Objektiv. Während der Kryo-Fluoreszenz-Bildgebung, regelmäßig den flüssigen Stickstoff Ebene in der Kryo-Bühne und füllen Sie ihn, falls erforderlich, um die Probe zu Stufe unterhalb -170 halten° C. </li><li> Nach Abschluss der Kryo-Fluoreszenz-Bildgebung, vorsichtig wieder die Probe Patrone zum Kupfer-Block-Plattform und speichern Sie die Patrone in einem Flüssigstickstoff-Dewar für zukünftige cryoET Analyse mit einem Polara System. Bei Verwendung eines nicht-Polara Kryo-Elektronenmikroskop, entfernen Sie den Ring Kupfer, rufen Sie die Probe Gitter, legen Sie sie in einem Grid-Storage-Box, und speichern Sie die Probe in einem Flüssigstickstoff-Dewar bis die Probe durch cryoET untersucht wird. </li><li> Für die Datenanalyse, überlappen die erworbenen Kryo-DIC-und GFP-Bilder (aus Schritt 4.9, siehe Abbildung 4b) und korrelieren die Positionen der GFP-Signale in der Kryo-Fluoreszenz-Bild mit den in der Live-Cell-Imaging-Serie erhalten. </li></ol> 5. Cryo-Elektronen-Tomographie <ol><li> Wägegut Patrone in den Cryo-Übergabestation mit einem Elektronenmikroskop mit einer Feldemissionsquelle, wie Polara G2 Mikroskop ausgestattet. </li><li> Unter low-dose-Suchmodus bei einer Vergrößerung von 140X, identify und speichern Sie die zugehörigen Planquadrate (aus Schritt 4.11) in eine Bühne Datei. </li><li> Unter low-dose-Suchmodus bei einer Vergrößerung von 3500 X, legen Sie eine 100 um Objektivapertur, Such-und speichern Sie alle Positionen mit GFP-Signale in einer zweiten Stufe Datei korreliert. </li><li> Unter low-dose-Aufnahme-Modus, finden Sie einen leeren Bereich Strahlintensität zu einer Dosis von 1 oder 2 E einstellen - / Å 2 und verfeinern die Kippachse, über die Bühne y-Funktion, durch die Verbrennung entfernt das Eis in einem unwichtigen Kohlenstoff Region mit mehreren Gold-Kügelchen. </li><li> Unter low-dose-Fokus-Modus, stellen Sie den Fokus auf ~ 3 um und stellen Sie den Winkel, um die Richtung des Fokus auszurichten, dass sie parallel zur Kippachse. </li><li> Unter low-dose-Suchmodus erinnern gespeicherten Positionen (aus Schritt 5.3), passen Sie die Probe euzentrische Höhe und überprüfen Sie den Schwenkbereich für den Bereich von Interesse. Erwerben Sie ein Projektionsbild mit sehr niedrigen Elektronen-Dosis (~ 1 e - / Å 2) bei 8 bis 10 um Unschärfe, in Ausstellungenure-Modus, um die korrelierten Viruspartikel für Kryo-Elektronen-Tomographie bestätigen. </li><li> Wechseln Sie auf die low-dose-Fokus-Modus. In TEM auto Funktionen Menü, stellen Sie dem automatisierten euzentrische Höhe und konzentrieren Funktionen der Schwerpunktsetzung. </li><li> Stellen Sie die Parameter für den Erwerb eines Tilt-Serie. Für Abbildung 4 in diesem Papier, angefangen Neigungswinkel ± 70 °, unterhalb und oberhalb 45 °, bei 3 ° und 2 ° Neigung Schritten jeweils verwendet wurden, mit einem 6 um Unschärfe und etwa 70 e - / Å 2 Gesamtdosis. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.7 und 5.8 für alle gespeicherten Positionen. Batch-Tomographie-Software kann für die automatisierte Datenerfassung auf mehreren Positionen eingesetzt werden, um den Durchsatz zu erhöhen. </li></ol> 6. Dreidimensionale Rekonstruktion mit IMOD 17 <ol><li> Überprüfen Sie die rohen Kippserie um die minimalen und maximalen Dichte Werte einzustellen und festzustellen, ob es irgendeine Aussicht ausgeschlossen aufgrund der großen Bildvers werden. </li><li> Starten eTomo und Setup Tomogramm Panel mit Achse Typ, Pixelgröße, fiducial Durchmesser, etc. Dann erstellen com Skripte. </li><li> Konfigurieren Sie das Hauptfenster, so dass mehrere Stufen des Tomogramms Berechnung angepasst werden kann / gefolgt gleichzeitig. Ändern Sie die erforderlichen Parameter und führen die spezifischen Programme, die von jedem Verarbeitungsschritt (Siehe eTomo Tutorial benötigt werden <a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html" target="_blank">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html</a> ). </li><li> In der letzten Stufe, erstellen Sie eine vollständige ausgerichteten Stapel (mit einer mittleren Restfehler kleiner als 0,6) und zu rekonstruieren Schichtaufnahmen mit einer gewichteten Rückprojektionsalgorithmus in IMOD. </li><li> DeNoise mögliche Bereiche von Interesse mit einem 3D nichtlinearen anisotropen Diffusion Rand Verbesserung Programm in IMOD mit entsprechenden Parametern implementiert, um den Kontrast und die Klarheit zu verbessern. </li></ol>

<ol>
	<li>Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cells+at+the+nanoscale.">Visualizing cells at the nanoscale.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).</li><li>Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+3D+intermediates+of+membrane+fusion+in+herpes+simplex+virus+1+entry.">Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).</li><li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+intracellular+behavior+of+HIV+in+living+cells.">Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells.</a> The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).</li><li>Arhel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+four-dimensional+tracking+of+cytoplasmic+and+nuclear+HIV-1+complexes.">Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes.</a> Nature Methods. 3, 817-824 (2006).</li><li>Gousset, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+HIV-1+GAG+trafficking+in+infected+macrophages.">Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages.</a> PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).</li><li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells.">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li><li>Koch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fusion+of+pseudotyped+HIV-1+particles+in+real+time+by+live+cell+microscopy.">Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy.</a> Retrovirology. 6, 84 (2009).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+chemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr.</a> Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).</li><li>Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+structure+determination+of+native+mammalian+cells+using+cryo-FIB+and+cryo-electron+tomography.">3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).</li><li>Sartori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography.">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).</li><li>Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+vitreous+sections+from+cultured+mammalian+cells.">Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells.</a> Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).</li><li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+HIV-1+with+correlative+live-cell+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography.</a> Structure. 19, 1573-1581 (2011).</li><li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors.">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).</li><li>Agronskaia, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+fluorescence+and+transmission+electron+microscopy.">Integrated fluorescence and transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).</li><li>Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryo-electron+microscopy.">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 4, 215-217 (2007).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Wir haben eine einfache Reihe von Protokollen vorgelegt, um eine erweiterte korrelativen Ansatz zur dynamischen zellulären Ereignissen mit Zeitraffer-konfokale, Live-Zell-Fluoreszenz-Imaging von cryoET gefolgt analysieren zu stellen. Unsere methodische Entwicklung zur 3D-Live-Cell-Imaging mit hochauflösenden cryoET korrelieren ist entscheidend für viele anspruchsvolle biologische Probleme, wie die Visualisierung selten, dynamisch (nicht statisch, wie bereits berichtet) und beugungsbegrenzter viralen Partikel und ihre...

Cryo-Elektronen-Tomographie (cryoET) ist ein leistungsfähiges bildgebendes Verfahren, das drei-dimensionale (3D) Visualisierung von Zellen und Geweben ermöglicht und Einblicke in die Organisation von nativen Organellen und zellulären Strukturen auf molekularer Auflösung in einem nahe-zu physiologischen Zustand 1. Allerdings macht die inhärent niedrigen Kontrast von ungefärbten tiefgefrorenen Probe mit ihrer Strahlung Empfindlichkeit kombiniert, ist es schwierig, Bereiche von Interesse in einer Zelle zu lokalisieren und anschließend die Durchführung der Kippserie erfolgreich ohne Beschädigung des Zielbereichs. Um diese Probleme zu überwinden, ist ein Ansatz, der korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie kombiniert notwendig. Spezifische Eigenschaften von Fluoreszenz-Markierung hervorgehoben werden identifiziert und lokalisiert durch Fluoreszenz Lichtmikroskopie und dann ihre Koordinaten auf dem Elektronenmikroskop für den Erwerb von hochauflösenden 3D-Strukturdaten übertragen. Diese Methode hilft Korrelat Ortung des Ziels einreas von Interesse angesprochen werden. Durch die Begrenzung auf Probe Dicke mit Kryo-EM (&lt;300 nm), die derzeit nur die peripheren Regionen der Zelle sind geeignet für 3D-Strukturanalyse durch CryoET. Weitere Verringerung der Dicke der tiefgefrorenen Proben durch Glaskörper Schneiden 8 oder durch Kryo-Focused Ion Beam (FIB)-Fräsen 9 erweitern würde die Fähigkeit der korrelativen Bildgebung. Bisher wurden korrelative Methoden in erster Linie verwendet, um cryoET Datenerfassung für große und statischen Strukturen 10-13 erleichtern. In diesen Studien wurden Kryo-Stufen realisiert, um Kryo-EM-Gittern zu akzeptieren und passen entweder auf einem aufrechten Mikroskop oder einem inversen Mikroskop 10,11,14. Obwohl Umschalten Gitter scheint recht einfach in ihre Konstruktionen gibt es weitere Schritte zur Übertragung des EM Netz beteiligt sind, die Chance zu erhöhen, dass das Gitter verformt werden, beschädigt und verunreinigt. Wir haben vor kurzem gezeigt, einen technischen Fortschritt inkorrelative Mikroskopie, die uns direkt sichtbar dynamische Ereignisse, die von Natur aus schwer zu erfassen, wie z. B. HIV-1-und Host-Zell-Interaktionen in frühen Stadien der Infektion 15 erlaubt. Wir erreichten dies durch die Entwicklung und Implementierung eines Kryo-Lichtmikroskopie Probe Bühne, die eine Cartridge-System, um die Probe Schäden durch Gitter Handhabung minimieren passt, und erleichtert so Korrelation. Unser Design verfügt über einen integrierten Probe Kartuschenhalters, so dass sowohl Kryo-Licht und Kryo-Elektronenmikroskopie durchgeführt, werden nacheinander auf der gleichen Probenhalter, ohne Probe zu übertragen, damit die Straffung des korrelativen Verfahren. Darüber hinaus haben wir auch eine genaue und zuverlässige Korrelation Verfahren unter Verwendung von fluoreszierenden Latex-Kügelchen als Bezugsmarker.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine</td>
			<td>Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA</td>
			<td>12-604F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>HeLa cell culture on EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell tracker</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>Red CMTPX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A gold conjugates</td>
			<td>Ted Pella, Inc., Redding, CA</td>
			<td>15822-1</td>
			<td>15 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &mu;m fluorescent microspheres</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>F8811</td>
			<td>Yellow-green fluorescent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal calf bovine serum</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>10082-139</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom culture dish</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold quantifoil finder EM grids</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany</td>
			<td>R2/2 Au NH2 200 mesh</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow-discharge device 100X</td>
			<td>EMS, Hatfield, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>300 keV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 microscope</td>
			<td>Olympus America Inc., Center Valley, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE microscope</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sweptfield confocal microscope</td>
			<td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokai Hit live cell chamber</td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-fluorescence sample stage</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative microscopy for 3d structural analysis of dynamic interactions

Cryo-Elektronen-Tomographie (cryoET) ermöglicht 3D-Visualisierung von zellulären Strukturen auf molekularer Auflösung in einem close-to-physiologischen Zustand 1. Allerdings ist die direkte Visualisierung einzelner viraler Komplexe in ihrem Wirt zellulären Umgebung mit cryoET herausfordernd 2, aufgrund der seltenen und dynamischen Charakter der das Eindringen des Virus, insbesondere im Fall von HIV-1. Während Zeitraffer-Live-Cell-Imaging eine große Menge an Informationen über viele Aspekte des Lebenszyklus von HIV-Januar 03-07 geführt hat, die Auflösung durch Live-Cell-Mikroskopie geleistet wird, ist begrenzt (~ 200 nm). Unsere Arbeit wurde bei der Entwicklung einer Methode, die Korrelation direkte Visualisierung der frühen Ereignisse des HIV-1-Infektion ermöglicht durch die Kombination von lebenden Zellen Fluoreszenzlichtmikroskopie, Kryo-Fluoreszenzmikroskopie und cryoET abzielen. Auf diese Weise kann in lebenden Zellen und Kryo-fluoreszierenden Signale zur genauen Führung der Probenahme in cryoET werden. Darüber hinaus strukturelle Informationen aus cryoET kann b erhaltene mit den dynamischen funktionellen Daten ergänzt gewonnen durch Live-Cell-Imaging von fluoreszierenden markierten Ziel. In diesem Video-Artikel, bieten wir detaillierte Methoden und Protokolle zur strukturellen Untersuchung von HIV-1-und Host-Zell-Interaktionen mit 3D Korrelat High-Speed ​​Live-Cell-Imaging und hochauflösende cryoET Strukturanalyse. HeLa Zellen, die mit HIV-1-Partikeln infiziert wurden zuerst durch konfokale Mikroskopie lebenden Zellen dadurch, und die Region, die den gleichen viralen Partikel wurde dann durch Kryo-Elektronen-Tomographie zur 3D-Struktur-Details analysiert. Die Korrelation zwischen zwei Sätzen von Bilddaten, optische Bildgebung und Elektronenabbildungseinrichtung, wurde unter Verwendung eines selbst zusammengestellten Kryo-Fluoreszenz-Lichtmikroskopie Stufe. Der Ansatz detailliert hier wertvoll sein wird, nicht nur für die Untersuchung von Virus-Wirt-Zell-Wechselwirkungen, sondern auch für breitere Anwendungen in der Zellbiologie, wie z. B. Zell-Signal-, Membran-Rezeptor-, und viele andere dynamische zelluläre Prozesse. &lt;/ P&gt;

Um das dynamische Verhalten der Viruspartikel zu charakterisieren, wurden HeLa-Zellen mit HIV-1 infiziert von High-Speed-konfokale Mikroskopie lebender Zellen abgebildet und die Partikel-Bewegungen wurden durch automatisierte 3D particle tracking analysiert (Abbildung 1). Um die Zeitspanne von mehreren Minuten, die zwischen Sammlung der letzten konfokale Live-Cell-Bild und tauchen Gefrierpunkt (die lang genug, um HIV-1 korreliert Teilchen verlieren), eine Kryo-Fluoreszenz Lichtmikroskopie Bühne <strong...

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Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Wir beschreiben eine korrelative Mikroskopie-Methode, die High-Speed-3D-Live-cell Fluoreszenzlichtmikroskopie und hochauflösenden Kryo-Elektronen-Tomographie vereint. Wir demonstrieren die Fähigkeit des korrelativen Verfahren durch Abbilden dynamisch kleine HIV-1-Partikeln Interaktion mit dem Host-HeLa-Zellen.

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.9K Aufrufe.  University of Pittsburgh School of Medicine. Wir beschreiben eine korrelative Mikroskopie-Methode, die High-Speed-3D-Live-cell Fluoreszenzlichtmikroskopie und hochauflösenden Kryo-Elektronen-Tomographie vereint. Wir demonstrieren die Fähigkeit des korrelativen Verfahren durch Abbilden dynamisch kleine HIV-1-Partikeln Interaktion mit dem Host-HeLa-Zellen.

Serie: Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Studieren der Stöchiometrie der Epidermal Growth Factor Receptor in intakten Zellen mit korrelative Mikroskopie

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Forschung

Biotechnik

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Ein Hochdurchsatz-Zellarray-Plattform für korrelative Analyse von Zelldifferenzierung und Zugkräften

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Korrelative Licht Elektronenmikroskopie (CLEM) für die Verfolgung und Imaging virales Protein verbundenen Strukturen in den Cryo-immobilisierten Zellen

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

Bau eines vielschichtigen mesenchymale Stammzellen-Blatt mit einem 3D dynamische Kultursystem

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

Ökologische dynamische mechanische Analyse um die Erweichung Verhalten der neuronale Implantate

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Unterstrukturanalysator: Ein benutzerfreundlicher Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in Fluoreszenzmikroskopiebildern

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Kontrollierte Dehnung von 3D-Hydrogelen unter Live-Mikroskopie-Bildgebung

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...