Die Autoren sind dankbar, Fondazione Filarete für seine Hilfe und Unterstützung bei der Veröffentlichung dieses Artikels. Wir würden auch gerne Centro Europeo di Nanomedicina für die Nutzung der TECNAI G2 Transmissionselektronenmikroskop danken.

1. Plasmid, Zellkultur und Transfektion mit ER Fluoreszierende Proteine <ol><li> Das in dieser Studie verwendete Plasmid besteht aus einer verbesserten Version des GFP am C-Terminus mit dem Heckbereich des ER-Isoform von Ratten-Cytochrom b fusioniert (5) über eine Linkersequenz (als B (5), hier abgekürzt). Der Heckbereich die gesamte Sequenz (Pro94-Asp134), die Membran nach der Trypsin-Spaltung der nativen b (5), einschließlich der 17-Rückstand TMD (Transmembran-Domäne), von vor-und nachgelagerten Polar Sequenzen flankiert (USV und DPS) zugeordnet bleibt, enthält . Der Linker besteht aus dem myc-Epitop, gefolgt von [(Gly) 4 Ser] 3, und die gesamte cDNA wird in die Hind3-Xba1-Stellen des Säugetier-Expressionsvektor pcDNA3. Die Einzelheiten der Konstruktion dieses Plasmids wurden in einer früheren Veröffentlichung, in der sie als GFP-ER 16 bezeichnet wird beschrieben. </li><li> Wachsen COS-7-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% Feta ergänztl Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 1% Penicillin / Streptomycin in einem Inkubator bei 37 ° C und 10% CO 2. </li><li> Transfektion. Platte 3 x 10 5 Zellen auf einer runden Deckglas in einer 6-Well-Platte, und am folgenden Tag, Transfektion mit dem jetPEI System, wie vom Hersteller beschrieben. Beachten Sie, dass die optimale jetPEI / DNA-Verhältnis hat, um die maximale Effizienz der Transfektion in Abhängigkeit von der Plasmid-und Zelllinie zu etablieren getestet: in unserem Fall ein jetPEI: DNA-Verhältnis von 2:1 führt zu einer 70-80% Transfektionseffizienz. </li></ol> 2. Live-Fluoreszenzmikroskop-Mikroskopie <ol><li> Live-Cell-Imaging. Das Deckglas gelegt, auf dem die transfizierten Zellen wurden in einer Zellkulturkammer Stahl 24 mm Deckgläsern mit DMEM gefüllt w / o Phenolrot, mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1% Penicillin / Streptomycin, 25 mM HEPES ausgesät , 50 ug / ml Cycloheximid und 1:100 OxyFluor, um die Proben von Photobleichung zu verhindern. Ein SP5 konfokalen mikroskopische mit einem temperaturgesteuerten CO 2-Inkubator (37 ° C und 5% CO 2) ausgestattet ist zum lebenden Zellen Experimente verwendet, mit d-GFP-ER unter Verwendung eines 488-nm-Laser und einen 525/50 Bandpass-Emissionsfilter visualisiert. </li><li> Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP). Ziehung einer Region von Interesse (ROI), entsprechend einer OSER Struktur und entfärben mit 20 Iterationen und eine Kombination von 488 nm (100% eines 30 mW Argonlaser, entsprechend 5,5-6 &amp;mgr; W in der Probe) und 405 nm (60% der 30 mW Laserdiode 405, das entspricht 11,6 uW bei der Probe)-Laser, die in unserer Erfahrung, führt zu einer effizienten und schnellen Photobleaching. </li><li> Notieren Sie sich die Erholung der Fluoreszenz in den gebleichten ROIs, indem sie einen einzelnen Frame alle 10 s für 10 min (Pixelzeit = 1,61 Mikrosekunden / Pixel). </li><li> Fluoreszenzverlust in Photobleaching (FLIP). Ziehung einer ROI entsprechend einem OSER Struktur und Bleichmittel, wie oben beschrieben. Das Bleichen wird alle 30 Sekunden wiederholt,und Post-Bleich Bilder werden alle 10 Sekunden für 30 min (Pixelzeit = 1,61 Mikrosekunden / Pixel) aufgezeichnet. </li><li> FRAP und FLIP-Analyse. Alle Bilder sind mit ImageJ Software (analysiert <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a> ). In den FRAP Experimenten wird die Wiederherstellung der Fluoreszenz des gebleichten ROI über die Zeit und normiert auf die Gesamtfluoreszenz der gebleichten Zell, das immer aktiviert ist über die Zeit konstant ist, gemessen. </li><li> Für die FLIP-Experimenten ziehen eine ROI außerhalb des gebleichten OSER und für die gesamte Zelle. Messung ihrer Fluoreszenzintensität über die Zeit zu normalisieren und die Fluoreszenzniveaus eines ROI auf einem ungebleichten Zell um für jede Abnahme der Fluoreszenz von der Abbildungs ​​selbst zu korrigieren gezogen. </li><li> In allen Experimenten, subtrahiert das Hintergrundsignal (in einem Bereich außerhalb der Zellen bestimmt) von den Fluoreszenzintensitäten der ROIs. Schließlich zeichnen die Ergebnisse mit GraphPad Prism Software. </li></ol> 3. Ultrastrukturelle Analyse mittels Transmissionselektronenmikroskopie Angesichts der Toxizität vieler der Reagenzien sollten alle den Verfahren trägt einen geeigneten Labor durchgeführt werden. Mantel und Handschuhe unter einer Abzugshaube. <ol><li> Nach dem Entfernen des Deckglases aus der Petrischale, fixieren die restlichen Zellen am Boden der Schale als eine Monoschicht mit gefilterter 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer, pH 7,4, für 10 Minuten bei Raumtemperatur gezüchtet. </li><li> Kratzen Sie die Zellen mit einer Teflon Schaber und übertragen sie in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 9000 g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie frisches Fixiermittel, und lassen Sie über Nacht bei 4 ° C </li><li> Waschen der Pellets mit Puffer, dann post-fix mit einer Lösung von 1% Osmiumtetroxid in Cacodylat-Puffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie mit MilliQ Wasser und en bloc Fleck mit1% Uranylacetat in destilliertem Wasser für 20-60 min. </li><li> Entwässern der Proben in steigenden Ethanolreihe (70%, 80%, 90%, 100% und 100% für jeweils 10 Minuten) und kurz waschen zweimal in Propylenoxid (jeweils 15 min). </li><li> Infiltrieren der Proben in einem Gemisch aus Propylenoxid + Epon (1:1) (2 h bis über Nacht). </li><li> In Epon Epoxidharz bei 60 ° C für mindestens 24 Stunden gehärtet einzubetten. </li><li> § die manuell getrimmt Harzblöcke mit Hilfe eines Ultramikrotoms LEICA UC6 mit einem 45 °-Diamantmesser ausgestattet, um Abschnitte mit einer Dicke von 60-70 nm zu erhalten. Sammeln Sie die Abschnitte über 300 mesh Kupfernetze. </li><li> Färben Sie die Abschnitte in der Startaufstellung mit einer gesättigten Lösung von Uranylacetat (20 min) und Blei-Citrat (7 min) gründlich waschen, in die Netze von bi-destilliertem gefiltertes Wasser eingetaucht werden, und es ihnen ermöglichen, bei Raumtemperatur trocknen. </li><li> Die gefärbten Gitter G2 TECNAI mit einem Transmissionselektronenmikroskop beobachtet, und die Bilder werden unter Verwendung eines erfassten Bottom-CCD-Kamera montiert in verschiedenen Vergrößerungen letzten (in der Regel zwischen 6,000-39,000 X). </li></ol>

<ol>
	<li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum.">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li><li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+architecture:+structures+in+flux.">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li><li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum.">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li><li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and.">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li><li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome.">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li><li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubic+membranes:+a+legend+beyond+the+Flatland*+of+cell+membrane+organization.">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li><li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. 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L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital.">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li><li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells.">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li><li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres.">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. 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F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+faces+of+protein+misfolding:+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases.">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li><li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways.">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP,+photoactivation,+photoconversion,+and+FLIP.">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li><li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats.">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die in diesem Dokument beschriebenen Protokolle und bildgebenden Verfahren sind verwendet worden, um die Verteilung und Mobilität von transfizierten TA fluoreszierende Proteine ​​im ER lebender Zellen resident untersuchen. Wir haben auch untersucht die Wirkung der Überexpression dieser Proteine ​​auf die Architektur dieser subzellulären Kompartiment durch ultrastrukturelle Analyse. Die Kombination aus Live-Zell-konfokale Bildgebung und Elektronenmikroskopie stellt ein sehr leistun...

Die Entdeckung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und dessen Varianten Spektralbereich und die parallele Entwicklung der Fluoreszenzmikroskopie wurden völlig neue Möglichkeiten für die Untersuchung von Protein-Verhalten in den Zellen geöffnet. Techniken wie Fluoreszenz-Erholung nach Photobleaching (FRAP) und Fluoreszenzverlust Photobleaching (FLIP), die aufgrund der Eigenkapazität der Fluorophore ihrer Fluoreszenz unter intensiver Beleuchtung erlischt möglich sind, werden auf der konfokalen Abbildung lebender Zellen basiert und die Verwendung von transfizierten Fluoreszenz-Fusionsproteine ​​1-3. Sie sind weit verbreitet, nicht nur die Lokalisierung von Proteinen, sondern auch ihre Mobilität und vesikulären Transport, die wichtige Hinweise über ihre Funktion 4 offenbaren kann beurteilen. Das einzigartige Merkmal von eukaryontischen Zellen ist die Anwesenheit von intrazellulären Kompartimenten, die spezifische Lipid-und Proteinzusammensetzungen. Obwohl Organellen sind körperlich Isolated, müssen sie miteinander kommunizieren und molekularen Komponenten, um die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Die sekretorischen Weg garantiert, dass die Proteine ​​und Lipide im ER synthetisiert erreichen den richtigen Bestimmungsort in dem sie ihre Funktion ausüben. Intrazellulären Organellen kann auch durch dynamische Kontaktstellen, die Moleküle (Lipide), direkt zwischen den Abteilungen ausgetauscht werden können angeschlossen werden. Darüber hinaus haben viele Proteine ​​in großen heteromeren Komplexen zusammengesetzt oder mit bestimmten Lipidspezies (Lipid Rafts / Mikrodomänen), um sich funktionell aktiv oder an ihren Bestimmungsort transportiert werden verbunden. Alle diese biologischen Aspekte stark beeinflussen die kinetischen Eigenschaften der Proteine, und kann daher in geeigneter Weise mittels der unten beschriebenen Methoden untersucht werden. Unsere Gruppe hat sehr stark genutzt FRAP und FLIP mit Elektronenmikroskopie kombiniert, um die Architektur des ER und ihrer verschiedenen studierenDomänen. Das ER ist die erste Station des sekretorischen Weg und spielt eine Schlüsselrolle in der Protein-und Lipidsortierung 5. Es ist eine sehr dynamische Organellen, deren unterschiedliche Teilbereiche spiegeln die viele verschiedene Funktionen (zB Protein-und Lipid Biosynthese und Menschenhandel, Proteinfaltung, Ca 2 +-Speicher-und Freigabe und Fremdstoffmetabolismus). Obwohl sie morphologisch räumlich und funktionell verschieden sind diese Bereiche kontinuierlich zueinander und ihre relative Häufigkeit in Zellen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen modifiziert werden. Die bekannteste und meist räumlich getrennter Domänen des ER sind die Kernhülle und die glatten und rauen ER, allerdings haben wir und andere gezeigt, dass es ER Strukturen mit aufwendiger Architektur und dreidimensionale Organisation in verschiedenen Zelltypen und Geweben unter physiologischen Bedingungen, die auch durch Stressreize wie Hypoxie, Drogen induziert werden kannVerwaltung, oder die Überexpression von ER-residenten Transmembranproteine ​​2,6 (und darin). Wir haben vor kurzem auch die Anwesenheit solcher Strukturen in Zellmodellen menschlicher Krankheiten 1,7 nachgewiesen. Hervorgegangen aus dem gestapelten Zisternen des glatten ER, sie den gemeinsamen Namen der organisierten glatten endoplasmatischen Retikulum (OSER) im Jahr 2003 6 angegeben wurden, obwohl sie auch als karmellae, Lamellen und kristalloiden ER auf der Grundlage ihrer Architektur bekannt, die, wie ihre Größe kann variieren. Nachdem die Zellen mit GFP zu cytosolischen Schwanz-Bereich verankert (TA) ER fremde Proteine ​​(d EGFP-ER), die schwach Dimerisierung Tendenz von GFP in trans dramatisch verändert die Organisation und Struktur der ER fusioniert transfiziert. FRAP und FLIP-Experimente zeigten, dass d EGFP-ER ist kostenlos innerhalb Osers diffundieren, und die Tatsache, dass es von der retikulären ER bewegt sich nach OSER und umgekehrt &lt;/ Em&gt; zeigt an, dass die Aggregate sind kontinuierlich mit der umgebenden retikulären ER. Ultrastrukturelle Analyse hat uns erlaubt, die Fluoreszenzdaten mit einer detaillierten Beschreibung der OSER Architektur und Organisation auf Nanoebene korrelieren: Osers werden immer von Stapeln von gepaarten Zisternen des glatten ER gemacht, sondern kann verschiedene Formen der räumlichen Organisation, wie regelmäßig angeordneten Sinus haben Arrays oder Quirlen oder sechseckigen &quot;kristalloiden&quot; Rohr Arrays. Diese Umlagerungen führen zu kubischen Morphologien 8, die, wie sie in Zellen unter physiologischen Bedingungen 9 und folgenden Belastungen wie Hypoxie 10. Arzneimittelbehandlung 11, 9 und Krebs gefunden worden, erhebliche Potential als ultra Marker aufweisen kann. Nach dieser ersten Demonstration mit GFP-Fusionsproteine ​​verwendeten wir Abbildungsexperimente, die Proliferation von ER-Domänen analysiert als Reaktion auf pharmakologische Behandlungen 12, assess der Neigung von fluoreszierenden Proteinen in Zellen 13 oligomerisieren, und die Rolle eines mutierten ALS-verknüpften TA Protein an der Bildung von intrazellulären Aggregaten von ER Herkunft, die relevant für seine Pathogenität 1,8 sein kann, zu untersuchen. Es wurde vorgeschlagen, daß die Bildung von intrazellulären Aggregaten (die in vielen neurodegenerativen Krankheiten 14 auftritt) kann eine Schutzmechanismus, der die Wechselwirkungen zwischen toxischen mutierten Proteinen und den umgebenden Zellkomponenten 15 zu verhindern. Was folgt, ist eine Beschreibung einer Kombination optischer und Elektronenmikroskopie Verfahren zur Untersuchung Konstrukte, deren C-terminale hydrophobe Domäne in der Membran des ER eingeführt, und eine Analyse ihrer dynamischen Verhalten und die Wirkungen der Überexpression von ER-Domäne Architektur in kultivierten Zellen (siehe Abbildung 1 ein Ablaufdiagramm des experimentellen Protokolls).

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31053028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>PP10110</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OxyFluor</td>
			<td>Oxyrase Inc.</td>
			<td>OF-0005</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde Grade I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Osmium Tetroxide 4% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Uranyl Acetate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>73943</td>
			<td>slightly radioactive</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propylene Oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82320</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EPON embedding medium kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lead Citrate </td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bench top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectral Confocal Microscope </td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Microscope Cage Incubation System </td>
			<td>OkoLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultramicrotome </td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Diamond knife </td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45 &deg;</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Transmission Electron Microscope </td>
			<td>FEI</td>
			<td>Tecnai G2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>steel culture cell chamber for 24 mm coverslip</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>CSC-25</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Electron Microscopy grids</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>G300Cu</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

visualization of endoplasmic reticulum subdomains in cultured cells

Die Lipide und Proteine ​​in eukaryotischen Zellen kontinuierlich zwischen Zellkompartimenten ausgetauscht, obwohl diese trotz der intensiven interorganelle Molekularverkehr behalten ihre unverwechselbare Zusammensetzung und Funktionen. Die in diesem Beitrag beschriebenen Techniken sind mächtige Mittel des Studiums Protein-und Lipid Mobilität und Menschenhandel in vivo und in ihrer physiologischen Umgebung. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) und Fluoreszenzverlust in Photobleaching (FLIP) werden häufig für die Untersuchung intrazellulären Transport durch die exo-endocytischen, die Kontinuität zwischen den Organellen oder Unterkammern, die Bildung von Proteinkomplexen und Protein-Lokalisierung verwendet Live-Cell-Imaging-Techniken Lipidmikrodomänen, die alle unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu beachten. Die Grenzen dieser Ansätze sind hauptsächlich auf die Verwendung von fluoreszierenden Fusionsproteine ​​und ihre möglichen Nachteile umfassen artifactual überexprimierenIonen in Zellen und die Möglichkeit, Unterschiede in der Faltung und Lokalisierung von markierten und nativen Proteinen. Schließlich, als die Auflösungsgrenze der Lichtmikroskopie (etwa 200 nm) keine Untersuchung der Feinstruktur des ER oder den spezifischen Unterkammern, die in Zellen unter Stress entstehen kann damit (dh Hypoxie, Medikamentengabe, die Überexpression von Transmembran basierend auf Transmissions-Elektronenmikroskopie ER ansässig Proteine) oder unter pathologischen Bedingungen, kombinieren wir Live-Cell-Imaging von kultivierten transfizierten Zellen mit ultrastrukturelle Analysen.

Figur 2 zeigt ein Beispiel FRAP Untersuchung von Protein-Mobilität. Die Mobilität von d EGFP-ER-Protein wird durch die schnelle Erholung nach Fluoreszenzphotobleaching in gebleicht Osers demonstriert. Für die quantitative Analyse wurden die Halbzeit-und Mobil Fraktion aus experimentell gemessenen Daten durch Einsetzen der folgenden monoexponentiellen Gleichung abgeleitet: F (t) = F post + (F-F rec post) (1-e-t / τ) <...

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Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Wir beschreiben die bildgebenden Verfahren verwenden wir, um die Verteilung und Mobilität der transfizierten fluoreszierenden Proteinen in das endoplasmatische Retikulum (ER) mittels des konfokalen Abbildung von lebenden Zellen resident untersuchen. Wir haben auch ultrastrukturell analysieren die Wirkung ihrer Expression auf die Architektur dieser subzellulären Kompartiment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

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12.9K Aufrufe.  Fondazione Filarete.  Wir beschreiben die bildgebenden Verfahren verwenden wir, um die Verteilung und Mobilität der transfizierten fluoreszierenden Proteinen in das endoplasmatische Retikulum (ER) mittels des konfokalen Abbildung von lebenden Zellen resident untersuchen. Wir haben auch ultrastrukturell analysieren die Wirkung ihrer Expression auf die Architektur dieser subzellulären Kompartiment. 

Serie: Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Zählen und Bestimmung der Lebensfähigkeit von kultivierten Zellen

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Forschung

Biologie

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

Visualisierung der interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) Netzwerk in Mäuse

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

Organell-Transport in kultivierten<em&gt; Drosophila</em&gt; Zellen: S2-Zelllinie und primären Neuronen.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Visualisierung von G3BP Stress-Granulat Dynamics Live Primärzellen

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Massively Parallel Reporter Assays in kultivierte Säugerzellen

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the large size of the human BRCA2 protein (approximately 390 kDa). We report modifications of standard siRNA transfection and immunoblotting protocols to silence human BRCA2 and detect endogenous BRCA2 protein, respectively, in human epithelial cell lines. Key steps include a high siRNA to transfection reagent ratio and two subsequent rounds of siRNA transfection within the same experiment. Using these and other modifications to the standard protocol we consistently achieve more than 70% silencing of the human BRCA2 gene as judged by immunoblotting analysis with anti-BRCA2 antibodies. In addition, denaturation of the cell lysates at 55 &#176;C instead of the conventional 70-100 &#176;C and other technical optimizations of the immunoblotting procedure allow detection of intact BRCA2 protein even when very low amounts of starting material are available or when BRCA2 protein expression levels are very low. Efficient silencing of BRCA2 in human cells offers a valuable strategy to disrupt BRCA2 function in cells with intact BRCA2, including tumor cells, to examine new molecular pathways and cellular functions that may be affected by pathogenic BRCA2 mutations in tumors. Adaptation of this protocol for efficient silencing and analysis of other &#39;large&#39; proteins like BRCA2 should be readily achievable.

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

Silencing<em&gt; BRCA2</em&gt; Zum Novel BRCA2-regulierten Biologische Funktionen in kultivierten menschlichen Zellen zu identifizieren

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...