Die Augenforschung in früheren Zeiten stützte sich hauptsächlich auf das Augengewebe von Verstorbenen. Im Laufe der Jahre wurden jedoch viele ophthalmologische Nagetiermodelle entwickelt und der Bedarf an menschlichem Augengewebe hat abgenommen. Aufgrund der geringen Größe und des begrenzten Operationsbereichs im Auge des Nagetiers ist der effektive Zugang zu den okulären Unterteilen stark eingeschränkt.
Um das Auge eines Nagetiers zu operieren, wird das Auge typischerweise über den Sehnerv immobilisiert und die Dissektion durchgeführt. Diese Praxis ist mühsam und kann das zerbrechliche Gewebe beschädigen, da sich das sphärische Auge während der Dissektion weiter bewegt. Obwohl diese Technik bei der Isolierung der verschiedenen Abschnitte der Netzhautschichten vorteilhaft ist, kann sie die räumliche Orientierung des Gewebes bei der Dissektion des Gewebes nicht abgrenzen.
Darüber hinaus ist ein gezielter Eingriff nach der Dissektion aufgrund der homogenen zellulären Anordnung der hinteren und vorderen Augenmuschel schwer zu lokalisieren. In diesem Video wird eine modifizierte Operationsmethode für die Mikrodissektion demonstriert. Das Vorhandensein der angebrachten Nickhaut oder des dritten Augenlids bietet einzigartige und signifikante Vorteile.
Bei dieser Methode wird zuerst der Augapfel mit dem dritten Augenlid enukleiert, dann wird das dritte Augenlid verwendet, um das Auge zu immobilisieren. Es folgt das Durchstechen des Augapfels durch den Hornhautlimbus, und der Schnitt wird als Eintrittspunkt verwendet. Dann werden durch Schneiden entlang des Umfangs vordere und hintere Augenmuscheln getrennt.
Durch eine weitere Sektion der hinteren Augenmuschel wird die durchscheinende Schicht der neuralen Netzhaut identifiziert und sanft abgezogen. Auf diese Weise werden die neuronalen und RPE-Schichten für die weitere Verarbeitung erhalten. Das dritte Augenlid ermöglicht es uns, die räumliche Orientierung der Enukleation des Augenpfostens abzugrenzen.
Lassen Sie uns nun eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung befolgen. Erweitern Sie die Augen der Nagetiere mit einem Tropfen 0,8 % Tropicamid und 5 % Phenylephrin-Augenlösungen und legen Sie das Tier vor dem Eingriff 30 Minuten lang in einen dunklen Bereich. Euthanasieren Sie das Tier durch intraperitoneale Verabreichung der fünffachen Anästhesie.
Eine typische Dosis beträgt 200 Mikroliter PBS, die 10 mg Ketamin und ein mg Xylazin enthalten. Bestätigen Sie das völlige Fehlen einer Reaktion auf den Reiz, indem Sie den Pedalreflex untersuchen. Legen Sie die Maus in die seitliche Liegelage, um einen vollständigen Zugang zum Auge zu ermöglichen.
Halten Sie eine Colibri-Nahzange, eine gebogene Pinzette, eine Mikroklinge mit einer Größe von 15 Grad und drei Millimetern, eine Feder-Mikroschere und eine abgewinkelte Feder-Mikroschere für den Eingriff bereit. Legen Sie eine gebogene Pinzette um den Augapfel und kneifen Sie, um das Auge von Fremdanhaftungen zu befreien. Das dritte Augenlid, auch Nickhaut genannt, befindet sich in Richtung des oberen Winkels der Nasentangente und kann als kleiner durchscheinender Vorsprung mit pigmentierten Rändern identifiziert werden.
Verwenden Sie anschließend eine Federmikroschere und schneiden Sie um den Augapfel herum. Kleine, kontinuierliche Schnitte lösen den Augapfel von Skleraansätzen. Legen Sie eine gebogene Feder-Mikroschere unter den Augapfel, um das Auge zu befreien, indem Sie den Sehnerv durchtrennen.
Legen Sie das enukleierte Auge in eine Petrischale, die PBS-Puffer enthält, so dass der Augapfel in PBS eingetaucht ist. Einige extraokulare Muskeln oder Gewebe beginnen vom Augapfel wegzuschweben. Entfernen Sie sie, indem Sie sie mit einer Feder-Mikroschere vom Augapfel abschneiden.
Entfernen Sie dann den Sehnerv von der Basis des Augapfels, um eine bessere Trennung der Netzhaut für Wholemount-Präparate zu ermöglichen. Es ist nicht notwendig, den Sehnerv für die Gewebeschnitte zu entfernen. Übertragen Sie den Augapfel in ein 1,5-ml-Röhrchen, das einen ml 4% Paraformaldehyd oder PFA enthält.
Bewahren Sie es zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf, um das Gewebe zu fixieren. Es ist möglich, bei diesem Schritt eine Pause einzulegen, indem das Gewebe bis zu 12 Stunden bei vier Grad Celsius in PFA belassen wird. Für die Isolierung lebender Zellen sollten die Fixierungsschritte jedoch nicht durchgeführt werden und der gesamte Vorgang muss im Kontinuum durchgeführt werden.
Übertragen Sie den Augapfel nach der PFA-Fixierung in eine Petrischale, die PBS enthält, und legen Sie ihn unter ein Präpariermikroskop, um den nachfolgenden Eingriff durchzuführen. Immobilisieren Sie den Augapfel, indem Sie das dritte Augenlid mit einer Colibri-Nahzange festhalten. Der Limbus ist die Hornhaut-Sklera-Verbindung.
Machen Sie einen kleinen Einschnitt am Limbus, indem Sie ihn mit einer Mikroklinge durchstechen. Der Schnitt erfolgt vorzugsweise gegenüber dem dritten Augenlid. Als nächstes nehmen Sie diesen Schnitt als Ausgangspunkt und machen Sie mit der Mikroschere kleine und kontinuierliche Schnitte entlang dieses Hornhaut-Sklera-Limbus-Umfangs.
Vervollständigen Sie zuerst einen Halbkreis von Schnitten, beginnend mit dem Einschnitt bis zum dritten Augenlid. Vervollständigen Sie dann den verbleibenden Halbkreis der Schnitte auf der anderen Seite. Machen Sie zum Schluss einen Schnitt um das dritte Augenlid, um die hintere und die vordere Schale zu trennen.
Entfernen Sie die Linse mit einer Pinzette aus dem hinteren Becher, um den hinteren Becher zu erhalten, der aus der neuralen Netzhaut und der RPE-Schicht und dem vorderen Hornhautpfanne besteht. Wenn mit nicht fixiertem Gewebe gearbeitet wird, können die vorderen und hinteren Cups nun enzymatisch verdaut werden, um eine einzellige Hornhaut- oder Netzhautsuspension zu erhalten. Um die Gewebe zu fixieren, geben Sie diese Becher 12 Stunden lang bei vier Grad Celsius in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml 4%PFA.
Nach der Fixierung kann das Gewebe in ein geeignetes Medium eingebettet werden, und es kann eine Kryosektion oder Paraffinschnitte durchgeführt werden, um Hornhaut- oder Netzhautschnitte zu erhalten. Setzen Sie den hinteren Becher wieder in die Petrischale ein, die PBS-Puffer enthält. Eine undurchsichtige Schicht auf der pigmentierten RPE-Schicht ist die neurale Netzhaut.
Ziehen Sie die Netzhaut mit einer zweiten Pinzette ab. Eine sehr sanfte und leichte Handbewegung wird dringend empfohlen, um das Gewebe nicht zu beschädigen. Am Ausgang des Sehnervs kann die gebogene Federschere unter die Netzhaut der Neuralnetzhaut eingeführt werden, und es kann ein Schnitt gemacht werden, um die Schichten vollständig zu befreien, wenn die Netzhaut anhaftet.
Die Netzhaut kann auch durch sanftes Streicheln mit einer weichen Bürste befreit oder abgelöst werden. Führen Sie die vorderen und hinteren Becher wieder in die Petrischale ein, die PBS-Puffer enthält. Verwenden Sie eine abgewinkelte Feder-Mikroschere, um neben dem dritten Augenlid von der Peripherie senkrecht zum optischen Zentrum einen Schnitt zu machen.
Halten Sie das dritte Augenlid fest und machen Sie einen Schnitt neben dem ersten Schnitt. Machen Sie einen ähnlichen Schnitt zwischen dem zweiten Schnitt und dem dritten Augenlid. Drei oder vier solcher äquidistanten Schnitte öffnen die halbkugelförmigen Becher zu einer Blütenform, die flach fällt und leicht montiert werden kann.
Machen Sie keine sehr tiefen Schnitte bis zur Mitte der Tasse, da dies dazu führen kann, dass die Blattabschnitte auseinanderfallen oder sich leicht trennen. Das flüssige Medium ermöglicht es der vorderen Augenmuschel, eine gekrümmte Struktur zu erreichen. Befolgen Sie die gleichen Schritte wie beim Ausführen von Schnitten an der hinteren Pfanne, um drei oder vier gleich weit entfernte Schnitte an der vorderen Pfanne vorzunehmen.
Das Gewebe ist nun bereit für die weitere Färbung. In dieser Abbildung ist die gesamte Halterung des vorderen Bechers dargestellt. Das Hornhautgewebe wurde wie beschrieben mikroseziert, um die Lymphgefäße im anhaftenden Bindehautgewebe des Hornhautsegels freizulegen.
In dieser Abbildung ist der gesamte Berg der neuralen Netzhaut dargestellt. Das retinale Gefäßsystem der neuralen Netzhaut wurde mit Isolectin gefärbt und ist als grüne Gefäße sichtbar. Bei dieser Methode wird der enukleierte Augapfel der Mäuse mit dem angebrachten dritten Augenlid für eine effektive und einfache Handhabung erhalten.
Das dritte Augenlid immobilisiert den Augapfel vollständig und ermöglicht eine einfache und fehlerfreie Dissektion. Diese Methode ist vorteilhaft für okuläre gewebespezifische Schnitte, Einzelzellanalysen und Wholemounts. Die Notwendigkeit einer wiederholten Gewebefixierung macht das Gewebe jedoch für Zellkulturen oder solche lebenden Zellnotwendigkeiten unbrauchbar.
Daher muss das Verfahren im Kontinuum für die Isolierung lebender Zellen durchgeführt werden.
