Die Autoren bedanken sich bei Julia und Martin Hatler Ramsden (R &amp; D Systems) für hilfreiche Diskussionen und Manuskript Kritik bestätigen.

1. Die Induktion der EMT <ol><li> Warmen Kulturmedium auf 37 º C in einem Wasserbad. Das verwendete Kulturmedium ist das gleiche wie für den Standard-Kultur von den Zellen von Interesse verwendeten Medien. Zum Beispiel wird die A549 humanen Lungenkarzinomzelllinie in Kaighn F12 mit 10% fötalem Rinderserum und 2 mM Glutamin gezüchtet. </li><li> Ernten Sie die Zellen von Interesse mit einem Dissoziation Lösung (zB TrypLE Express). </li><li> Suspend-Zellen in vorgewärmten Kulturmedium in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren der Zellsuspension bei 400 × g für 5 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Eingießen in einen Abfallbehälter. </li><li> Hängen Sie das Zellpellet in vorgewärmten Kulturmedien. </li><li> Count lebensfähiger Zellen mit Trypan-Blau. Entfernen einer Probe der Zellsuspension und 0,4% Trypanblau-Lösung zu verdünnen. Platz 10 ul der verdünnten Probe auf einer Zählkammer und zählen lebensfähigen Zellen (Zellen, die nicht erscheinen, blau). Verwenden Zellzahlen, um die Zelle zu bestimmen, dichte in Ihre Lösung. </li><li> Platten Zellen auf Gewebekultur-behandelten Platten oder Kolben bei 0,9-1,0 × 10 4 Zellen pro cm 2. Beispielsweise 0,5 × 10 6 Zellen in einer 100 mm-Platte in Kulturmedien, enthaltend 1X EMT Induktionsmedium Zusatz (6 ml Medium pro 100 mm-Platte) plattiert. </li><li> Kultur plattierten Zellen in einem 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator. Überwachung der Zellmorphologie täglich. </li><li> Drei Tage nach der Plattierung, entfernen Medien und ersetzen mit frischem vorgewärmten Kulturmedien, die 1X EMT Inducing Medien Ergänzung. Weiterhin Kultur in ein 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Fünf Tage nach der Beschichtung, sind Zellen für die Analyse bereit. Zellmorphologie durch invertierte Lichtmikroskopie sichtbar. </li></ol> 2. Analyse der Proteinexpression durch Immunzytochemie <ol><li> Vorbereitung sterile 12 mm Deckgläsern für eine 24-Well-Platte, indem Deckgläschen in einer Petrischale mit 95% Ethanol. Deckgläser vorsichtig entfernen aus Ethanol unsten einer Nadel und einer gebogenen Pinzette und Flamme sterilisieren. Zeigen sterilen Deckglas in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. Wiederholen Sie mit den restlichen Deckgläser. </li><li> Bereiten Sie die Zellsuspension, wie in Abschnitt 1.1 beschrieben - 1.7. </li><li> Platte 1,6 x 10 4 Zellen / Vertiefung in 0,5 ml vorgewärmten Kulturmedien, die 1X EMT Inducing Medien Ergänzung. </li><li> Wachsen und ernähren Zellen wie in den Abschnitten 1.9 beschrieben - 1.11. </li><li> Fünf Tage nach dem Ausplattieren, wird das Medium entfernt und die Zellen zu fixieren mit 300 &amp;mgr; l / Vertiefung von 4% Paraformaldehyd in 1 × phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Fixiermittel entfernen und spülen Zellen 2x mit 1x PBS, 500 ul /. </li><li> Inkubieren Zellen in 400 &amp;mgr; l / Vertiefung Blockierungspuffer (1 × PBS, das 1% Rinderserumalbumin (BSA), 10% normalem Eselserum und 0,3% Triton X-100) für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubation in primären Antikörpers an Hersteller empfohlenen Konzentration in 400 ul / Blocking-Puffer für 3 Stunden bei Raumtemperature oder über Nacht bei 4 ° C. Bei Verwendung eines primären Antikörper direkt an ein Fluorochrom konjugiert ist, inkubiert Proben im Dunkeln. </li><li> In 500 &amp;mgr; l / Vertiefung 1 × PBS mit 0,1% BSA für 5 min bei jedem Waschwäsche Zellen dreimal. Bei Verwendung eines primären Antikörper direkt mit einem Fluorochrom konjugiert, gehen Sie direkt zu Schritt 2.12. </li><li> Zellen in sekundären Antikörper inkubieren bei vom Hersteller empfohlenen Konzentration in 400 ul / Vertiefung 1 × PBS, das 1% BSA für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> In 500 &amp;mgr; l / Vertiefung 1 × PBS mit 0,1% BSA für 5 min bei jedem Waschwäsche Zellen dreimal. </li><li> Wenn gewünscht, Gegenfärbung Kerne mit DAPI-Lösung. </li><li> Spülen Zellen in VE-Wasser und montieren Deck Gesicht nach unten auf einem Objektträger mit Montage Medien. </li></ol>

<ol>
	<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition.">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li><li>Thiery, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions+in+tumour+progression.">Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression.</a> Nature Reviews Cancer. 2, 442-454 (2002).</li><li>Heuberger, J., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cadherin-mediated+cell+adhesion+and+canonical+Wnt+signaling.">Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 1-23 (2010).</li><li>Onder, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E-cadherin+promotes+metastasis+via+multiple+downstream+transcriptional+pathways.">Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways.</a> Cancer Research. 68, 3645-3654 (2008).</li><li>Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin/&#946;-catenin+complex+and+the+epithelial+barrier.">E-cadherin/&#946;-catenin complex and the epithelial barrier.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-6 (2011).</li><li>Scheel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+and+autocrine+signals+induce+and+maintain+mesenchymal+and+stem+cell+states+in+the+breast.">Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast.</a> Cell. 145, 926-940 (2011).</li><li>Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition.">TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition.</a> Cell Research. 19, 156-172 (2009).</li><li>Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;1+induces+human+alveolar+epithelial+to+mesenchymal+cell+transition.">TGF-&#946;1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition.</a> EMT). Respiratory Research. 6, 56-70 (2005).</li><li>Miettinen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+induced+transdifferentiation+of+mammary+epithelial+cells+to+mesenchymal+cells:+involvement+of+type+I+receptors.">TGF-&#946; induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors.</a> Journal of Cell Biology. 127, 2021-2036 (1994).</li><li>Pelton, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+genes+encoding+TGFs+&#946;1,+&#946;2,+and+&#946;3+during+murine+palate+formation.">Differential expression of genes encoding TGFs &#946;1, &#946;2, and &#946;3 during murine palate formation.</a> Dev. Biol. 141, 456-460 (1990).</li><li>Taube, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+epithelial-to-mesenchymal+transition+interactome+gene-expression+signature+is+associated+with+claudin-low+and+metaplastic+breast+cancer+subtypes.">Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes.</a> PNAS. 107, 15449-15454 (2010).</li><li>Roussos, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AACR+special+conference+on+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+progression+and+treatment.">AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment.</a> Cancer Research. 70, 7360-7364 (2010).</li><li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states:+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits.">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).</li><li>Brown, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+by+transforming+growth+factor-&#946;1+of+epithelial+to+mesenchymal+transition+is+a+rare+event+in+vitro.">Induction by transforming growth factor-&#946;1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro.</a> Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).</li><li>De Falco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+proteolysis+increases+CREB+phosphorylation+and+sustains+proliferation+of+thyroid+cancer+cells.">CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells.</a> Cancer Research. 72, 1449-1458 (2012).</li><li>Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Erk+pathway+is+required+for+TGF-&#946;1-induced+EMT+in+vitro.">Activation of the Erk pathway is required for TGF-&#946;1-induced EMT in vitro.</a> Neoplasia. 6, 603-610 (2004).</li><li>Bachelder, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase-3+is+an+endogenous+inhibitor+of+Snail+transcription:+implication+for+the+epithelial-mesenchymal+transition.">Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).</li><li>Pon, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p70+S6+kinase+promotes+epithelial+to+mesenchymal+transition+through+Snail+induction+in+ovarian+cancer+cells.">p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells.</a> Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).</li><li>Wegner, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays.">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li></ol>

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Bisherige Verfahren zur Induktion EMT haben im Allgemeinen verwendet, TGF-β Stimulation oder genetische Veränderung. Obwohl TGF-β allein hat sich gezeigt, EMT in einigen Zelltypen induzieren, wurde nun gezeigt, dass TGF-β für EMT notwendig ist, aber es genügt nicht in allen Zelltypen 6,14. Mit genetischen Modifikation für EMT Induktion ist zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Das hier beschriebene Verfahren verwendet eine Kombination von Faktoren, einschließlich, Anti-Human-E-Cadherin-, anti-human sFRP-1, Anti-Human-Dkk-1, rekombinantes humanes Wnt-5a und rekombinantes menschliches TGF-β1, zuverlässig herbei EMT. Diese Kombination von Faktoren ist für die E-Cadherin-basierten Haftung, einen entscheidenden Schritt für EMT Induktion 4 zu blockieren, und verbessern Wnt-Signalweg durch Hinzufügen des Wnt-5a-Protein als auch mit blockierende Antikörper gegen den Wnt-Inhibitoren, sFRP-1 und Dkk -1. Wnt-und TGF-β-Signalisierung wurde gezeigt, dass in einer autokrinen Schleife dienen zur Einleitung und Aufrechterhaltung der mesenchymalen Zell state 6. Dieses Verfahren vermeidet Induktions Genmanipulation und ist effektiver als die Verwendung von TGF-β allein. Wichtig ist, dass wir in der Lage, die Induktion der EMT in Zelltypen zu beobachten, einschließlich MCF7 und PANC-1-Zellen, die zuvor gezeigt wurde, nicht nur auf die TGF-β Stimulation reagieren (Fig. 5) 14. Zellen mit EMT-Inducing Medien Supplement zeigen weniger kompakt und erhöhte spindelförmige Morphologie (Abbildung 1) behandelt. Zusätzlich gibt es eine Abnahme der Oberflächen E-Cadherin-Expression gleichzeitig mit einem Anstieg der Fibronektin, das Markenzeichen von EMT (Fig. 2 und 3) sind. Zusätzliche mesenchymalen Marker wie Vimentin und Schnecke sind auch in den EMT induzierten Zellen im Vergleich zu nicht-induzierten Kontrollen (Fig. 4) hochreguliert. Erhöhte Migration und Invasion Fähigkeiten sind die wichtigsten Funktionsmerkmale von mesenchymalen Zellen. In in vitro </em&gt; Migration und Invasion Assays Zellen mit EMT-Inducing Medien Supplement behandelt wurden, zeigten eine deutlich erhöhte Kapazität zur Migration und dringen (Abbildung 6). Diese einfache Methode zur Induktion EMT ist nützlich für die Untersuchung der EMT Signalgebung mit den Antikörperarray-Expressionsdaten in Fig. 7 gezeigt, dargestellt. Verschiedene Zelltypen können pre-und post-EMT Induktions verglichen werden, um gemeinsame Expression Signaturen mit EMT verbunden sind, wie die Erhöhung der phosphorylierte CREB und ERK1 / 2 in sowohl MCF7 und A549 EMT-induzierten Zellen gesehen zu erhalten. S133 Phosphorylierung von CREB stimuliert die DNA-Bindung und hat sich gezeigt, stromabwärts von TGF-β1-induzierten EMT 15 zu wirken. ERK1 / 2 Phosphorylierung wurde auch gezeigt, stromabwärts von TGF-β1-induzierten EMT 16 zu wirken. Unterschiede in der Signalwege zwischen den Zellen-Typen können auch erläutert, wie mit der Zunahme der GSK-3β-Phosphorylierung in A549 Zellen gegenüber p70S6 sehenK-Phosphorylierung in MCF7. GSK-3β-Phosphorylierung an Serin 9 verringert sie Funktion und GSK-3β ist gezeigt worden, um die pro-EMT-Transkriptionsfaktor, Schnecke 17 zu verhindern. Im Gegensatz dazu induziert p70S6K Snail Tätigkeit und deren Phosphorylierung wird mit der Aktivierung dieses Proteins 18 zugeordnet. Insgesamt einfache und sichere Induktion der EMT, insbesondere in bisher nicht gezeigt, um sich ausschließlich auf TGF-β-Zellen reagieren, ist für das Verständnis der Biologie von EMT, Festlegung gemeinsamer Ausdruck Signaturen für die Verwendung als prognostische Marker, und die Entwicklung und Evaluierung neuer Therapeutika für Krebs und fibrotischer Erkrankung.

Epitheliale mesenchymale Transition (EMT) ist der Prozess, durch den eine polarisierte Epithelzelle erfährt eine Vielzahl von Änderungen, die sich in einer sehr beweglich, Fibroblasten-ähnliche Zellen mesenchymalen. Dieser Prozess erfolgt zum Teil durch Veränderungen der Genexpression und der Degradation von Adhärenzverbindungen, was zu einer erhöhten Fähigkeit zu migrieren und zu erobern. Physiologisch EMT spielt eine wichtige Rolle während der embryonalen Entwicklung und Wundheilung. Verlust der Kontrolle über die richtige EMT kann zur Fibrose und Metastasierung von Karzinomen 1,2 führen. Die Reduktion von E-Cadherin auf der Oberfläche der Epithelzellen ist ein kritischer Schritt in der Progression einer Zelle durch EMT 3,4. E-Cadherin ist ein Single-Pass-Transmembranprotein, das direkt mit Cadherin Proteine ​​auf benachbarten Zellen interagiert. Zusätzlich zu seiner Rolle bei der Zelladhäsion, E-Cadherin Einflüsse Zellsignalisierung über Wechselwirkungen zwischen dem zytoplasmatischen Schwanz von E-Cadherin einda Vielzahl von regulatorischen Proteinen, insbesondere β-Catenin. β-Catenin spielt eine Rolle bei der Stabilisierung der Adhärenzverbindungen. Während der Wnt-Signalisierung wird β-Catenin von E-Cadherin freigegeben und an den Kern, wo es als ein Transkriptionsfaktor, der stromabwärts des Wnt-Signalwegs 3,4,5 wirkt transloziert. Im Zellkern ist β-Catenin wurde gezeigt, dass die Transkription von mehreren EMT bezogene Faktoren wie Twist, Slug, Fibronektin, und eine Vielzahl von Matrix-Metalloproteasen 3,6 zu erhöhen. Neben Wnts hat TGF-β Signal gezeigt worden, um eine bedeutende Rolle bei EMT Induktion sowohl während der normalen Entwicklung und bei Krankheitszuständen 7,8,9 spielen. TGF-β ist in der EMT, die während der Gaumen Bildung und in der Entwicklung von Herz 10 tritt beteiligt. Es hat sich auch in Fibrose und in der Krebsprogression zur Metastasierung 7 in Verbindung gebracht. Das hier beschriebene Verfahren provides konsistente Induktion der EMT in einer Vielzahl von Zelltypen ohne genetische Manipulation. Dieses Verfahren verwendet eine Mischung aus E-Cadherin, sFRP-1 und Dkk-1-blockierende Antikörper und Wnt-5a und TGF-β1 rekombinanten Proteinen. Dieser Cocktail ist für die E-Cadherin-basierten Haftung zu blockieren und gleichzeitig die Wnt-und TGF-β-Signalisierung. Die Fähigkeit für robuste EMT Induktion ist entscheidend für das Verständnis der Biologie dieser Prozess und wie man sie für therapeutische Zwecke zu manipulieren. Strom gemeinsam Marker der EMT, E-Cadherin (in EMT herunterreguliert) und Vimentin (in EMT hochreguliert), können gefunden werden in Krebs co-exprimiert und somit nicht bieten die besten Diagnosemarker von potentiellen metastatischen Zellen 12. Wichtiger ist, ist die Analyse von einer Vielzahl von Zelltypen, EMT laufen haben nützliche gemeinsame Genexpression Signaturen, die für diagnostische Zwecke bei Krebs und Fibrose 11 eingesetzt werden können. Zusätzlich haben neuere Studien gezeigt, dass EMT kann eine Rolle bei der Bildung von Krebs-Stammzellen zu spielen, was darauf hindeutet, dass Zellen, die EMT durchlaufen haben kann für Wirkstoff-Screening sein, um Verbindungen, die diese Zielzellen kann 13 zu identifizieren.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Epithelial cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT Inducing Media Supplement</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CCM017</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&beta;1</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>240-B</td>
			<td>Used at 10ng/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL648R</td>
			<td>Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin </td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1838</td>
			<td>Used at 0.1 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Fibronectin</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1918</td>
			<td>Used at 10 &mu;g/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>AF5718</td>
			<td>Used at 0.2 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL009</td>
			<td>Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF109</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF007</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>SC026</td>
			<td>Used according to the manufacturer's instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96 Well BME Cell Invasion Assay</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>3455-096-K</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>ARY002B</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations19.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting Media</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CTS011</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15350-061</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>789-704</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fine pointed curved forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>12 mm coverslips</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>633009</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used at 5% in TBST for blocking in western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting blocking and washing</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-20% SDS-page gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plates/flasks, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>24-well plates, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipettes / pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet Aid / pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C/5%CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition

Epitheliale mesenchymale Transition (EMT) ist für die richtige Morphogenese während der Entwicklung. Fehlregulation dieses Prozesses wurde als ein Schlüsselereignis in der Fibrose und der Progression von Karzinomen zu einem metastasierten Zustand gebracht worden. Das Verständnis der Prozesse, die EMT zugrunde liegen, ist für die Frühdiagnose und klinische Kontrolle dieser Krankheitszustände Imperativ. Zuverlässige Induktion der EMT in vitro ist ein nützliches Werkzeug für die Wirkstoffforschung sowie zur gemeinsamen Genexpressionssignaturen für diagnostische Zwecke zu identifizieren. Hier zeigen wir ein einfaches Verfahren für die Induktion der EMT in einer Vielzahl von Zelltypen. Verfahren zur Analyse von Zellen, prä-und post-EMT-Induktion durch Immunzytochemie sind ebenfalls enthalten. Darüber hinaus zeigen wir die Wirksamkeit dieser Methode durch Antikörper-basierten Array-Analyse und Migration / Invasion Assays.

. EMT Induzieren hier beschriebenen Kulturbedingungen eine robuste Methode zur Induktion von EMT in einer Vielzahl von Zelltypen 1 und 2 zeigen die Morphologie und Markerexpressionsniveaus für 4 verschiedenen menschlichen Zelllinien: T98G-Glioblastomzellen, Kolon-Adenokarzinom-Zellen HT29 , A549-Lungenkarzinomzellen und MCF10A Brustepithelzellen. Zellen, die mit der EMT Inducing Medien Supplement behandelt wurden, änderte sich von einem klassischen epithelialen Morphologie (den 1A - 1D) zu einem mesenchymalen, spindelförmige Morphologie (1E - 1H). EMT-induzierten Zellen erschien im Vergleich zu nicht-induzierten Zellen weniger dicht in engen Kolonien verpackt. Nicht-induzierten MCF10A Proben enthielten dicht gepackten Clustern lockerer gepackten Zellen umgeben. Diese dicht gepackten Clustern waren E-Cadherin-positiven (2D) und verschwanden nach Behandlung mit der EMT Inducing Medien Supplement (2H). EMT wurde auch durch die Herunterregulierung von epithelialen Marker und Hochregulation von mesenchymalen Marker bewertet. Die Herunterregulierung von E-Cadherin-Expression ist in der Regel folgende EMT Induktion in verschiedenen Zelltypen beobachtet 3,4 Abbildung 2 zeigt die Oberflächenexpression von E-Cadherin in der Mehrzahl von unbehandelten Zellen (Fig. 2A - 2D; rot). Im Vergleich zu seiner Abwesenheit nach EMT Induktion (2E - 2H, rot). Eine Zelllinie T98G, wurde festgestellt, einen extrem niedrigen Basisniveau von E-Cadherin vor EMT Induktion, die ihre Analyse ausgeschlossen haben. Hochregulation von mesenchymalen Marker, Fibronektin, war auch nach der Induktion mit der EMT Inducing Medien Supplement (Figuren 2A - 2D gegenüber 2E - 2H, grün) sichtbar. Die Expression von E-Cadherin und Fibronectin durch Immunzytochemie gesehenwurden ferner durch Western-Blot von Gesamtzell-Lysaten (Fig. 3) bestätigt. Der Western-Blot bestätigt Herunterregulierung von E-Cadherin und Hochregulation von Fibronektin-Expression durch Immunzytochemie gesehen. Die Banden wurden mit Densitometrie und normiert auf GAPDH, um die relative Veränderung nach EMT fach Induktion bestimmen quantifiziert. E-Cadherin-Spiegel wurden 6,4 und 3,4 fach in A549 und MCF10A Zellen reduziert sind. Fibronektin-Spiegel wurden um 4,6, 4,1 und 2,3-fach in T98G, A549 und MCF10A-Zellen. Obwohl die Western-Blot keine signifikante Reduktion von E-Cadherin-Protein-Spiegel in HT29-Zellen nach Induktion EMT zeigen die immunzytochemischen Ergebnisse zeigen eine Verringerung in der Oberflächenexpression von E-Cadherin (2B gegen 2F), die nicht in unterscheiden ist Western Blot von Gesamtzell-Lysaten. Um weiter zu evaluieren EMT-Status, weitere bekannte Markers für EMT wurden analysiert, Pre-und Post-EMT-Induktion. In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen wurde E-Cadherin in allen untersuchten Zelllinien herunterreguliert, was darauf hinweist, dass EMT induziert. Darüber hinaus sind die mesenchymalen Marker Vimentin und Schnecke, wurden in A549, T98G und MCF10A Zellen nach der Behandlung mit EMT Inducing Medien Supplement (Abbildung 4) hochreguliert. Die HT29-Zelllinie hat (Daten nicht gezeigt) nicht Ausdruck dieser mesenchymalen Marker entweder mit oder ohne Induktions EMT zeigen, was darauf hindeuten kann, dass diese Zellen nutzen alternative Wege für die EMT-Induktion. Obwohl TGF-β ausreicht, um EMT in bestimmten Kontexten 7,8,9 Zelle induzieren, haben die anderen Zelltypen nicht nur reagieren auf die Zugabe von TGF-β 14. MCF7-Brustkrebszellen und PANC-1-humane Pankreas-Karzinom-Zellen sind sowohl gemeldet nicht auf TGF-β Signal allein 14 reagieren. Um festzustellen, ob die beiden Linien konnte EMT in vitr unterzieheno, wurden die Zellen in Gegenwart des EMT Induktionsmedium kultiviert Supplement. Die Zellen wurden mit rekombinantem TGF-β1 allein angeregt, bei der Konzentration im Medien EMT Inducing Ergänzung. Diese Zellen behielten ihre epitheliale Morphologie, bestehend aus dicht gepackten Kolonien von Zellen (Daten nicht gezeigt) und Oberflächen E-Cadherin-Spiegel wurden ähnlich denen in den Kontrollzellen beobachtet (Fig. 5C und 5D gegenüber den Fig. 5A und 5B). Im Gegensatz dazu zeigten Zellen mit EMT-Induktionsmedium Supplement stimuliert eine drastische Abnahme der Oberflächen E-Cadherin-Ebenen (Fig. 5E und 5F). Diese Zellen erhalten auch eine mesenchymale Morphologie, wie Zellen wurde weniger kompakter und spindelförmigen (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass die hier beschriebenen Verfahren EMT induzieren kann EMT Morphologie und Markerexpression Veränderungen in Zellen typischerweise beständig gegen TGF-β-i Förderungnduced EMT. Zusätzlich zu den Veränderungen in der Marker-Ausdruck ist ein weiteres Markenzeichen von mesenchymalen Zellen ihre Fähigkeit zu wandern und zu erobern. Migration und Invasion von Zellen mit oder ohne Ergänzung EMT induzierenden Medien wurden unter Verwendung des 96-Well-Zellinvasion BME Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert kultiviert. Kurz gesagt wurden die Zellen auf 96-Well-Platten ausgesät (50000 Zellen / Vertiefung), die Filtereinsätze mit 8,0 &amp;mgr; m Poren. Nach 48 h wurde die Migration von Calcein AM-Färbung der Zellen, die durch das Filter gewandert waren, beurteilt. Jede Probe wurde dreifach zweimal mit ähnlichen Ergebnissen getestet. Repräsentative Ergebnisse eines Experiments sind in Fig. 6A gezeigt. Statistisch signifikanter Anstieg (P-Wert &lt;0,003) bei der Zellmigration wurden sowohl mit A549 und PANC-1-Zellen nach Induktion EMT gesehen. Um die Fähigkeit dieser Zellen einzudringen (dh wandern durch extrazelluläre Matrix) zu bewerten, wurde dieselbe Analysemit einer Basalmembran-Extrakt-beschichteten Filter durchgeführt. EMT-induzierten Zellen zeigten eine statistisch signifikante (p-Wert &lt;0,001) Anstieg der Invasion Fähigkeiten im Vergleich zu unbehandelten Zellen, wie in Fig. 6B zu sehen. Die robuste Induktion von EMT ist nützlich für die Analyse von Veränderungen der Genexpression und Signalisierung, die sich in diesen Zellen. Antikörper-basierte Array-Analyse unter Verwendung von Lysaten von beiden behandelten und unbehandelten Zellen ist eine Methode, um die Expressionsniveaus von einer Vielzahl von Molekülen in einer einzelnen Probe zu analysieren. Als ein Beispiel, analysierten wir die Ebenen der phosphorylierten MAPK Familienmitglieder in Lysaten aus nichtinduzierten und EMT-induzierten MCF7 und A549-Zellen unter Verwendung des Proteome Profiler Menschen Phospho-MAPK-Array-Kit. Das Array wurde zweimal aus unabhängigen EMT-Induktion Behandlungen mit ähnlichen Ergebnissen führen. Abbildung 7 zeigt repräsentative Daten von einem Array. Beide Zelltypen zeigten erhöhte Phosphorylierung von CREB (S133), ERK1 (T2<html> 02/Y204) und ERK2 (T185/Y187) in EMT-induzierten Zellen im Vergleich zu Kontrollen. Unterschiede in der Signalereignisse wurden zwischen den beiden Zelltypen ebenso beobachtet. A549-Zellen zeigten einen Anstieg der GSK-3-β (S9) Phosphorylierung, während MCF7-Zellen zeigten erhöhte p70S6K (T421/S424) Phosphorylierung. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> Fig. 1 ist. Mesenchymale Morphologie Induktion nach Stimulation mit dem EMT Inducing Medien Supplement (A - D). Epitheliale Morphologie in den vier Zelltypen angegeben folgenden Kultur für 5 Tage im Standard-Kulturmedien ohne die EMT Inducing Medien Supplement (E - H). Mesenchymalen Morphologie in der vier Zelltypen angegeben mit der EMT Inducing Medien Ergänzung für 5 Tage kultiviert. nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="Figur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> 2. Herabregulierung von epithelialen Marker-Expression und Hochregulation von mesenchymalen Marker-Expression in EMT-induzierten Zellen. Zellen wurden durch Immunfluoreszenz angefärbt, um die Expression des epithelialen Marker, E-Cadherin (rot) zu erfassen, und die mesenchymalen Marker, Fibronectin (grün). (A - D) Kontrollzellen ohne die EMT Inducing Medien Ergänzung für 5 Tage kultiviert (E -. H) Zellen mit EMT-Inducing Medien Ergänzung für 5 Tage kultiviert. Alle Zellen sind mit DAPI (blau) gegengefärbt. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="Fig. 3"/> 3. Bestätigung der epithelialen und mesenchymalen Marker Ausdruck mit Western-Blot ein<html> . alysis Western-Blot von Gesamtzell-Lysaten der vier Zelltypen angegeben, mit (EMT) oder ohne behandelt (-) der EMT Inducing Medien Ergänzung für 5 Tage. Bands für E-Cadherin, Fibronektin und GAPDH Ladekontrolle sind auf der linken Seite angezeigt. Die Größenmarker ist auf der rechten Seite angegeben. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="Fig. 4"/> 4. Hochregulation der mesenchymalen Marker Vimentin und Schnecke im EMT-induzierten Zellen. Zellen wurden durch mehrfarbige Immunfluoreszenz angefärbt, um die Expression des epithelialen Marker, E-Cadherin (grau) erkennen und die mesenchymalen Marker Vimentin (grün) und Schnecke (rot) . (A - C) Kontrollzellen ohne die EMT Inducing Medienzusatz für 5 Tage kultiviert. (D - F) Zellen mit EMT-Inducing Medien Ergänzung für 5 Tage kultiviert. mmer &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="Figur 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> 5. Induktion der EMT in TGF-β1 nicht-ansprechenden Zellen. (A und B) Zellen, die mit Medium allein für 5 Tage kultiviert. (C und D)-Zellen in Medium, enthaltend 10 ng / ml TGF-β1 für 5 Tage kultiviert. (E und F) Zellen in EMT Inducing Medien Ergänzung für 5 Tage kultiviert. Alle Zellen sind für die E-Cadherin-Expression (rot) gefärbt und mit DAPI (blau) gegengefärbt. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="Fig. 6"/> 6. EMT-induzierten Zellen Migration und Invasion Kapazitäten erhöht. A. Anzahl der Zellen, die durch eine 8 um Porenfilter nach Inkubation für 48 h migriert. B. Durchschnittliche Anzahl derZellen, die in der Lage, durch eine 8 um Porenfilter mit Basalmembran-Extrakt nach Inkubation für 48 h beschichtet waren einzudringen. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung über 3 Brunnen. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="Fig. 7"/> Abbildung 7. Antikörper-basierten Array-Expressionsanalyse von EMT-Induktion. Lysate aus A549 (A und C) und MCF7 (B und D) Zellen mit oder ohne EMT Inducing Medien Supplement kultiviert wurden, wurden für die Array-Analyse unter Verwendung der Proteome Profiler Menschen Phospho-MAPK-Array-Kit verwendet. Flecken markiert A und B wurden dann unter Verwendung Densitometrie quantifiziert. Vergleiche der un-induzierte EMT-induzierten Lysate werden in den entsprechenden Balken unten (C und D) gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung &lt;sehen</a>/ A&gt;.

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Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Ein einfaches Verfahren ist für die Induktion von epithelialen mesenchymale Transition (EMT) in einer Vielzahl von Zelltypen beschrieben. Methoden zur Analyse von Zellen in EMT-Staaten durch Immunzytochemie sind enthalten.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

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Research

JoVE Journal

Biology

35.5K Aufrufe.  R&D Systems, Inc..  Ein einfaches Verfahren ist für die Induktion von epithelialen mesenchymale Transition (EMT) in einer Vielzahl von Zelltypen beschrieben. Methoden zur Analyse von Zellen in EMT-Staaten durch Immunzytochemie sind enthalten. 

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Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Hell / Dunkel Transition Test für Mäuse

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Forschung

Biologie

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for vision. In the human a single LG resides in the orbit above the lateral end of each eye delivering tears to the ocular surface through 3 - 5 ducts. The mouse has three pairs of major ocular glands, the most studied of which is the exorbital lacrimal gland (LG) located anterior and ventral to the ear. Similar to other glandular organs, the LG develops through the process of epithelial branching morphogenesis in which a single epithelial bud within a condensed mesenchyme undergoes multiple rounds of bud and duct formation to form an intricate interconnected network of secretory acini and ducts. This elaborate process has been well documented in many other epithelial organs such as the pancreas and salivary gland. However, the LG has been much less explored and the mechanisms controlling morphogenesis are poorly understood. We suspect that this under-representation as a model system is a consequence of the difficulties associated with finding, dissecting and culturing the LG. Thus, here we describe dissection techniques for harvesting embryonic and post-natal LG and methods for ex vivo culture of the tissue.

The lacrimal gland (LG) is a branching organ that produces the aqueous components of tears necessary for maintaining vision and ocular health. Here we describe murine LG dissection and ex vivo culture techniques to decipher signaling pathways involved in LG development.

Manipulation der Murine Lakrimal

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Kryoschneiden Verfahren zur Mikrodissektion von Murine Kolonschleimhaut

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...