Dieses Protokoll ist ein einfacher, auf Flusszytometrie basierender Assay, der die Messung des mitochondrialen Membranpotentials und der mitochondrialen Masse in lebenden Zellen ermöglicht. Standard-Metabolische Assays scheitern bei der Arbeit mit seltenen Populationen wie den hämatopoetischen Stammzellen. Diese Methode ermöglicht es Benutzern, mitochondriale Membranprofilierung bei der Arbeit mit einer geringen Anzahl von Zellen und neue metabolische Modulatoren von Zellen wie den HSCs zu bestimmen.
Darüber hinaus können Sie es mit nachgelagerten funktionellen Assays wie Knochenmarktransplantation oder koloniebildenden Assays kombinieren, um die Funktionalität Ihrer Zellen nach der Kultur zu bestimmen. Unsere Technik kann zur Identifizierung neuartiger Moleküle genutzt werden, die in der Lage sind, die HSC-Funktion im Zusammenhang mit Knochenmarktransplantationen und hämatopoetischer Immunrückgewinnung nach ablativen Therapien zu verbessern. Wie in unserem Protokoll beschrieben, kann unsere Methode verwendet werden, um die metabolische Fitness von Immun-T-Zellen zu bewerten.
Es ist sehr wichtig, dass die Zellen nach der Färbung nur minimal lichtdurchäuert werden. Darüber hinaus muss der Einsatz von Pumpeninhibitor verapamil einbezogen werden, um den Beitrag des Pumpenausflusses zu bewerten. Jedoch, Benutzer müssen sich bewusst sein, dass Verapamil zutiefst stört ionisches Gleichgewicht und kann nicht verwendet werden, um die Wirkung eines metabolischen Modulators auf mitochondriale MembranPotenzial zu bewerten.
Visuelle Demonstration dieser Methode ist extrem wichtig, weil es einige kritische Schritte gibt, die man bei der Arbeit mit einer geringen Anzahl von Zellen beachten muss, und diese Schritte fehlen sehr oft in den regulären Papieren, die Benutzer auf PubMed lesen. Für die FAC-Sortierung wird die LKS-Population, definiert durch Abstammung negativ, Sca1-positiv, cKit-positiv identifiziert. Hämatopoetische Stammzellen aus etwa fünf bis zehn % der Zellen in der LKS-Population werden durch Gating für CD150-positive CD48-negative Population identifiziert, die als HSCs bezeichnet wird.
Nach der hämatopoetischen Stammzellsortierung zentrieren Sie die Rohre bei 300 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie vorsichtig den größten Teil des Überstandes, ohne das Pellet zu lösen, und lassen Sie 50 bis 80 Mikroliter auf dem Zellpellet. Das Zellpellet im Stammzellausdehnungsmedium auf ein Endvolumen von 200 Mikrolitern aussetzen.
Bereiten Sie eine sterile Gewebekultur behandelt 96 U-Boden-Brunnenplatte, und identifizieren Sie die Brunnen, in denen die Zellen kultiviert werden. Übertragen Sie 100 Mikroliter 2x Basalmedium, das zuvor in diesen Brunnen hergestellt wurde. In der nr markierten gut, fügen Sie zwei Mikroliter einer 100x Nicotinamid-Ribosi-Lösung.
Übertragen Sie 100 Mikroliter 2x Basalmedium in Brunnen zur Färbekontrolle. Samen 100 Mikroliter vorbereiteter hämatopoetischer Stammzellen auf den Brunnen, die 2x Basalmedium enthalten. Samen 100 Mikroliter ganzer Knochenmarkzellen auf Brunnen, die als Fleckenkontrollen gekennzeichnet sind.
Fügen Sie 200 Mikroliter autoklaviertes Wasser in alle umliegenden Brunnen hinzu, um die Verdunstung aus Brunnen, die Zellen enthalten, zu reduzieren. Legen Sie die Platte ungestört in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für 72 Stunden. Nehmen Sie den Teller heraus, um Nicotinamid-Ribosi alle 24 Stunden aufzufüllen, und legen Sie ihn wieder in den Inkubator.
Am Ende der Kulturperiode zwei Mikroliter 100x TMRM-Lösung und zwei Mikroliter 100x grüne fluoreszierende Fleckenlösung in jede der Testbrunnen geben. Fügen Sie zwei Mikroliter 100x TMRM in die TMRM-Färbungskontrolle gut ein. Fügen Sie zwei Mikroliter von 100x grünen fluoreszierenden Fleck in der MitoTracker Färbung Gut.
Bedecken Sie die Oberseite der Platte mit Aluminiumfolie. und legen Sie die Platte wieder in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für 45 Minuten. Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator, und zentrifugieren Sie sie bei 300 mal g für fünf Minuten.
Invertieren Sie die Platte, um den Überstand zu entfernen, und fügen Sie 200 Mikroliter Standard-FACS-Puffer hinzu, um sie wieder aufzuhängen. Bedecken Sie die Platte mit Folie. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 mal g für fünf Minuten.
Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Setzen Sie die Zellen in 200 Mikroliter FACS-Puffer aus und übertragen Sie sie in FACS-Rohre. Um die Proben auf dem Durchflusszytometer auszuführen, laden Sie zuerst die einzelnen Farbsteuerelemente in das Gerät, und zeichnen Sie jeweils mindestens 5.000 Ereignisse auf.
Drücken Sie in der Software Acquire and then Record auf dem Dashboard, um einzelne Farbsteuerelemente zu erfassen und aufzuzeichnen. Drücken Sie Compensation Setup, und klicken Sie auf Vergütung berechnen, um die Vergütung zu berechnen. Sobald die Kompensation angewendet wurde, erwerben Sie die hämatopoetische Stammzellprobe und zeichnen Sie so viele Ereignisse wie möglich auf.
Exportieren Sie die FACS-Dateien aus dem Zytometer, und öffnen Sie die Datei auf der Analysesoftware. Verwenden Sie in FlowJo Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung, um die Zellpopulation zu identifizieren. Identifizieren Sie Singlets in den nächsten Gates, und zeichnen Sie dann den negativen DAPI-Anteil, der lebende Zellen darstellt.
Erstellen Sie im Live-Zell-Tor ein Konturdiagramm im TMRM- und grünen fluoreszierenden Fleckenkanal, um das mitochondriale Membranpotenzial bzw. die Masse zu messen. Exportieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität dieser beiden Kanäle im Live-Zell-Gate. Exportieren Sie dann den Anteil der Zellen im TMRM-Low-Gate in allen Proben.
Die Behandlung mit Nicotinamid-Ribosi zeigte einen deutlichen Anstieg der TMRM-Armenpopulation. Es erhöhte auch signifikant den Anteil der Zellen im TMRM Low Gate und zeigte eine signifikante Senkung der TMRM-Fluoreszenzintensität. Mitochondriale Masse änderte sich nicht auf Nicotinamid Ribosid Supplementierung.
Zusätzlich wurde die Mastzellmarkerfärbung mit der mitochondrialen Färbung nach der Kultur kombiniert. Mit der Gating-Strategie zur Identifizierung hämatopoetischer Stammzellen zeigte die Exposition gegenüber Nicotinamid-Ribosid einen signifikanten Anstieg der TMRM-Niedrigen Population und eine signifikante Abnahme der TMRM-Fluoreszenzintensität in gated HSCs. Das grüne fluoreszierende mitochondriale Fleckgrünsignal blieb in den beiden Bedingungen unverändert.
Es ist wichtig, die Färbeplatte mit Aluminiumfolie zu bedecken, um die Lichteinwirkung von Fleckenproben zu minimieren. Diese Methode kann mit nachgelagerten Assays wie Knochenmarktransplantation und koloniebildenden Assays kombiniert werden, um die Funktionalität Ihrer Stammzellen zu bestimmen. Diese Technik ermöglicht eine einfache Screening-Methode zur Identifizierung neuartiger Metabolenmodulatoren von HSCs.
