JQW, SZ, SD and KC are supported by grant from the National Institutes of Health and the Staman Ogilvie Fund&#8212;Memorial Hermann Foundation.

1. EML Zellkultur und Trennung von Lin-CD34 + und Lin-CD34- Zellen unter Verwendung Magnetic Cell Sorting System und fluoreszenzaktivierte Zellsortierverfahren <ol><li> Herstellung von Babyhamster-Nieren (BHK) Zellkulturmedium für die Stammzellfaktor Sammlung: <ol><li> Kultur BHK-Zellen in DMEM-Medium mit 10% FBS in 25 cm 2 -Kolben (Tabelle 1) bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem Zellkulturbrutschrank. </li><li> Wenn Zellen wachsen, um 80 bis 90% Konfluenz, waschen Sie die Zellen einmal mit 10 ml PBS. 5 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung zu der Monoschicht und Inkubieren der Zellen für 1-5 min bei Raumtemperatur (RT) bis die Zellen abgelöst werden. </li><li> Pipette die Lösung oben und unten vorsichtig aufzubrechen Zellklumpen. 5 ml komplettem DMEM in den Kolben zu Trypsinaktivität stoppen. Sammeln Zellen durch Zentrifugation bei 200 xg für 5 Minuten bei RT. </li><li> Entfernen des Mediums und Resuspendieren des Zellpellets in 10 ml frische BHK-Zellkulturmedium. </li&gt; <li> Übertragungs 2 ml der Zellsuspension aus Schritt 1.1.4 auf eine neue 75 cm 2 eingewogen und 48 ml der frischen BHK-Zellkulturmedium in den Kolben. </li><li> Kultur die BHK-Zellen für zwei Tage zu sammeln und das Kulturmedium. Gang das Medium durch einen 0,45 um-Filter. Bewahren Sie das Medium, in -20 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol></li><li> EML Zellkultur: <ol><li> Kultur EML-Zellen (in Suspension) in Grundmedium, das EML BHK-Zellkulturmedium (Tabelle 1) bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem Zellkulturbrutschrank. </li><li> Aufrechterhaltung der EML Zellen bei geringer Zelldichte (0,5-5 x 10 5 Zellen / ml) mit dem Spitzendichte von weniger als 6 x 10 5 Zellen / ml. Aufgeteilt, die Zellen alle 2-3 Tage in einem Verhältnis von 1: 5. Passage EML Zellen vorsichtig und entsorgen Sie die Kultur nach Passagieren für 10 Generationen. </li></ol></li><li> Depletion von Lineage-positiven Zellen: <ol><li> Ernten Sie die EML Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g for 5 min und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Sammeln der Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 min. </li><li> Resuspendieren der Zellen mit PBS und zähle die Zellen mit einem Hämozytometer. Bestimmen Sie die Antikörper-Konzentration in der anschließenden Zellseparationsschritt nach der Anzahl der Zellen (beachten Sie bitte die Anweisungen des Anbieters des Zellisolationssystem angeboten beziehen). </li><li> Isolieren Sie die Linie negativ (Lin-) Zellen unter Verwendung Linie Antikörper-Cocktail (Cocktail aus Biotin-konjugierten monoklonalen Antikörper CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G / C), 7-4 und Ter-119 ) und eine magnetische Zellsortierung System nach den Anweisungen des Herstellers. </li></ol></li><li> Trennung von Lin-CD34 + und Lin-CD34- Zellen: <ol><li> Spin-down der Lin- Zellen aus Schritt 1.3.3 bei 200 × g für 5 min. Zellpellet mit PBS und zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. </li><li> Waschen der Zellen zweimal mit FACS-Puffer und Pelletierung der Zellen bei 200 xgfür 5 min. </li><li> Beschriften fünf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit der Nummer 1, 2, 3, 4, 5 auf. Resuspendieren der Zellen mit 100 &amp; mgr; l FACS-Puffer pro 10 6 Zellen (10 6 Zellen pro Röhrchen). </li><li> In 1 ug Anti-Maus-CD34 FITC-Antikörper in Röhrchen 1 und Rohr 2 und die Röhrchen vorsichtig mischen. </li><li> Alle Röhrchen bei 4 ° C inkubieren für 1 h in der Dunkelheit. </li><li> In 0,25 ug PE-konjugierten Anti-Sca1 Antikörper und 20 ul APC-konjugierten Lineage Cocktail Antikörper in Röhrchen 1, 0,25 ug PE-konjugierten Anti-Sca1 Antikörper gegen Rohr 3 und 20 ul APC-konjugierten Lineage Cocktail Antikörpern gegen Rohr 4. </li><li> Mischen Sie alle Röhrchen vorsichtig und Inkubation der Zellen bei 4 ° C für weitere 30 min im Dunkeln. </li><li> Hinzufügen von 300 &amp; mgr; l FACS-Puffer zu den Zellen und Spin-down werden die Zellen bei 200 g für 5 min. </li><li> Mit 500 &amp; mgr; l FACS-Puffer dreimal Waschen der Zellen. </li><li> Zellpellet in 500 ul FACS buffer. </li><li> Verwenden Sie die Zellen in Röhrchen 2, 3, 4 und 5 für die Einrichtung Entschädigung. Isolieren Lin-SCA + CD34 + und Lin-SCA-CD34- Zellen in Rohr 1 mittels FACS Aria. </li></ol></li></ol> 2. RNA Präparation und Library Construction für Hochdurchsatz-Sequenzierung <ol><li> Isolation, Qualitätsanalyse und Quantifizierung von RNA: <ol><li> Auszug Gesamt-RNA aus Lin-CD34 + und Lin-CD34- Zellen jeweils mit TRIzol nach fertigt &#39;Protokoll. </li><li> Entfernen Sie die kontaminierten DNA unter Verwendung Desoxyribonuclease I (DNase I) folgende Protokoll des Herstellers. Gegebenenfalls, speichern die RNA bei -80 ° C bei diesem Schritt für die weitere Verwendung. </li><li> Bewerten Sie die Qualität der Gesamt-RNA mit Bioanalyzer gemäß den Anweisungen des Lieferanten angeboten. Verwenden RNA-Probe mit RNA Integrity Number (RIN) lager als 9. </li></ol></li><li> Library Construction und Hochdurchsatz-Sequenzierung: HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt RNA-Seq mit Illumina-Plattform. Fürandere Sequenzierungsplattformen werden verschiedene Bibliothekspräparationsmethoden erforderlich. <ol><li> Verwenden 0,1-4 ug hochwertige Gesamt-RNA pro Probe für Bibliotheks Vorbereitung. Regel 2 ug Gesamt-RNA aus 10 5 EML Zellen extrahiert werden. </li><li> Verwenden einer RNA-Sequenzierungsprobenvorbereitungssystem für RNA-Reinigung und Fragmentierung, ersten und zweiten Strang der cDNA-Synthese Ende Reparatur, 3&#39;-Enden Adenylierungs, Adapter-Ligation und PCR-Amplifikation, nach den Standardverfahren von detaillierten Instruktionen des Anbieters. <ol><li> Günstig wählen PolyA-mRNA mit Oligo-dT-magnetischen Kügelchen und Zersplitterung des mRNA. </li><li> Zuführen reverse Transkription unter Verwendung von Zufallsprimern, um die cDNA zu erhalten, und anschließend die Synthese des zweiten Strangs der cDNA, um doppelsträngige cDNA zu erzeugen. </li><li> Entfernen Sie die 3&#39;-Überhänge und die 5 zu füllen &#39;Überhänge durch DNA-Polymerase. Adenylat 3&#39;-Enden von cDNA-Fragmenten aus Ligation miteinander zu verhindern.</li><li> Hinzufügen Multiplexschalt Adapter an beide Enden der dscDNA. Zuführen PCR zur Anreicherung von DNA-Fragmenten. </li></ol></li><li> Messung der A260 / A280, um Informationen über die Konzentration der Bibliothek unter Verwendung eines Spektrophotometers erhalten. </li><li> Beurteilen Sie die Bibliothek Qualität und messen den Größenbereich von DNA-Fragmenten mit einem Bioanalyzer. </li></ol></li></ol> 3. Datenanalyse Als Referenz der Software in diesem Teil verwendet wird, finden Sie in (Tabelle 2). <ol><li> Datendateiverarbeitung für Downstream-Analyse: <ol><li> Konvertieren .bcl (Basis Call-Datei) Datei zu Datei .fastq Verwendung casava Software (Illumina, Version 1.8.2). <ol><li> Starten Sie den &#39;Terminal&#39; im Linux-System. Gehen Sie auf die Datenordner, die die Datendatei von einem Illumina HiSeq2000 Sequenzierungsmaschine enthält. Angenommen das Ergebnis Ordner &#39;NASboy1 / JiaqianLabData / HiSeq_RUN / 2013_07_11 / 130627_SN860_0309_A_2013-166_H0PW9ADXX /&#39;, Typim Befehl in Abbildung S1A, und geben Sie den Datenordner. </li><li> Installieren casava 1.8.2 in das Linux-System. Angenommen, der output ist &#39;Unaligned&#39;, verwenden Sie den Befehl in Abbildung S1B, die Konfigurationsdatei für die Umwandlung vorzubereiten. Verwenden Sie die Option --fastq-Cluster-count 0, um sicherzustellen, nur eine .fastq Datei wird für jede Probe erstellt. Die erzeugte .fastq Datei im .gz-Format. Entpacken Sie es für Downstream-Analyse (Abbildung S1B). </li><li> Nachdem der &#39;Unaligned&#39; Ordner erzeugt wurde, gehen Sie zum &#39;Unaligned&#39; Ordner (Abbildung S1C). </li><li> Verwenden Sie den Befehl in Abbildung S1D um den Konvertierungsprozess zu beginnen. Der Parameter &#39;-j&#39; liefert die CPU-Nummer, die verwendet werden. </li><li> Nachdem das System abgeschlossen Umwandlungsprozess, gehen Sie zu dem Ergebnis, Ordner unter &#39;Unaligned&#39; Ordner (Abbildung S1E). </li><li> Verwenden Sie den Befehl in Abbildung S1F &lt;/ Strong&gt;, um die Datei in .fastq.gz .fastq Datei unter jeder Probe Ordner entpacken. </li></ol></li></ol></li><li> Detect neuer Transkripte und bewerten das Expressionsniveau mit Tuxedo Suite 26: <ol><li> Ordnen Sie die Paired-End-RNA-Seq liest zur Maus Referenzgenom (UCSC Version MM9, erhalten aus <a href="http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html" target="_blank">http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html</a> ) mit Tophat-Software (Version 1.3.3) 27, die verwendet die Bowtie lesen Mapper (Version 0.12.7) 28. Tophat mit der Option &quot;-no-Roman-juncs&quot;, um die Schätzgenauigkeit der Expressionsniveau verbessern geliefert. <ol><li> Setzen Sie die .fastq Dateien in einem Ordner, in dem die Mapping-Prozess umgesetzt werden. Angenommen, es gibt zwei .fastq Dateien (umbenennen Example1.read1, Example1.read2) für eine Paired-End-Sequenzierung Probe, verwenden Sie den Befehl in Abbildung S2, um die Zuordnung (passen Sie die Parameter entsprechend der Systemeinstellung) zu tun.Der Parameter &quot;-p&quot; liefert die CPU-Nummer, die verwendet werden. Die &quot;-r&quot; und &quot;-mate-STD-dev&quot; Parameter können aus der Bibliothek QC erhalten oder aus einer Teilmenge ausgerichtet gefolgert liest (Abbildung S2) werden. </li></ol></li><li> Montieren Sie den abgebildeten liest in RNA-Transkripte mit der Manschettenknöpfe-Software (Version 1.3.0) 29. Führen Manschettenknöpfe mit der Anmerkungsdatei von bekannten Genen (gleiche .GTF Datei Tophat verwendet) und .bam Datei Tophat produziert. <ol><li> Nach dem Ausführen Tophat abgeschlossen, im selben Ordner, verwenden Sie den Befehl in Abbildung S3A um Manschettenknöpfe laufen Transkriptom und Schätzung Transkript Expressionsniveau zu konstruieren. Die &#39;mm9_repeatMasker.gtf&#39; und Genomsequenz-Dateien im Ordner &quot;GenomeSeqMM9 &#39;kann von UCSC Genome Browser erreicht werden. </li><li> Die resultierenden genes.expr und transcripts.expr Dateien enthalten den Ausdruckswert der Gene und Transkripte (Isoformen). Kopieren und Einfügender Inhalt der Datei in eine Excel-Datei mit Tabellenkalkulationsprogramm (Abbildung S3B) zu manipulieren. </li><li> Verwenden Sie den Befehl in Abbildung S3C die resultierende Datei &#39;transcripts.gtf&#39; zu dem Aktenzeichen &quot;mm9_genes.gtf &#39;um neue Transkripte identifizieren zu vergleichen. </li><li> Die resultierende Datei enthält .tmap dem Vergleichsergebnis. Kopieren und fügen Sie den Inhalt der Datei in eine Excel-Datei und mit Tabellenkalkulationsprogramm zu bearbeiten. Transkripte mit Klassencode &#39;u&#39; können als &quot;neue&quot; gegenüber dem Referenz .GTF Datei bereitgestellt (Abbildung S3D) berücksichtigt werden. HINWEIS: Für nachgeschaltete Analyse Bequemlichkeit, setzen Sie die FPKM Werte bis 0,1, wenn die Werte unter 0,1. HINWEIS: Schritt 3.2.3 - 3.2.6 ist optional für diejenigen, die die Genauigkeit des Ausdrucks Schätzung neuer Transkripte &#39;verbessern möchten. Dadurch wird eine wesentlich längere Zeit in Anspruch nehmen, weil Kartierung und Transkriptom Konstruktion müssen run mehr als einmal. </li></ol></li><li> Führen Tophat mit Default-Parameter und führen Sie Manschettenknöpfe erzeugt .GTF Datei mit dem Befehl in Abbildung S3E. </li><li> Vergleichen Sie die entstandene .GTF Datei in das Referenzgenom .GTF Datei mit dem Befehl in Abbildung S3F. </li><li> Analysieren Sie die in Folge .tmap Datei wie in Schritt 3.2.2.4 beschrieben. Kopieren und fügen Sie den Inhalt der Datei in eine Excel-Datei und mit Tabellenkalkulationsprogramm zu bearbeiten. Transkripte mit Klassencode &#39;u&#39; kann als betrachtet werden &quot;Roman&quot; im Vergleich zum Referenz .GTF Datei zur Verfügung gestellt. </li><li> Nach dem Schritt 3.2.5 gibt es eine .combined.gtf Datei in dem Ordner, der als Referenz .GTF Datei verwendet werden kann. Eine zweite Auflage von Tophat und Manschettenknöpfe können wie in Schritt 3.2.1 und 3.2.2 beschrieben, um eine genauere FPKM Abschätzung neuer Transkripte zu erhalten durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Detect differentially exprimierten Gene mit DESeq Paket 30. <ol><li> Der Eingang des DESeq ist eine rohe Lese zählt Tisch. Um eine solche Tabelle zu erhalten, verwenden Sie die htseq-count Skript mit dem HTSeq Python-Paket, das aus HTSeq Website heruntergeladen werden kann verteilt ( <a href="http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html" target="_blank">http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html</a> ) . <ol><li> Stellen Sie sicher, dass samtools, Python und htseq-count programsare im System installiert. Erhalten rohen Lesezählung Zahlen von tophat Ausgabe mit dem Befehl in Abbildung S4A. </li><li> Bereiten &#39;Raw_Count_Table.txt&#39;, &#39;ExperimentDesign.txt&#39; Dateien mit Excel. Kopieren und speichern Sie den Inhalt in TXT-Format für die DESeq R-Paket (Abbildung S4B). </li><li> Installieren R Programm im System. Im Terminal, zeigten Typ &#39;R&#39; und drücken ENTER.A Bildschirmmeldung wird appearas in Abbildung S4C. </li><li> Lesen Sie &#39;Raw_Count_Table.txt &#39;,&#39; ExperimentDesign.txt &#39;in R mit dem Befehl in Abbildung S4D. </li><li> Legen DESeq Paket mit dem Befehl in Abbildung S4E. </li><li> Factorize Bedingungen in R (Abbildung S4F). </li><li> Verwenden Sie den Befehl in Abbildung S4G negative Binominal Test auf dem normalisierten Zähltabelle laufen. </li><li> Verwenden Sie den Befehl in Abbildung S4H ausgegeben signifikante Differenz exprimierten Genen in einer CSV-Datei. </li></ol></li></ol></li><li> Lookup Transkriptionsfaktoren &quot;(TFS) FPKM Werte über Proben mit Hilfe von Excel. Intersect DE Gen Tisch und TFs Tisch. Gene gehören beiden Tabelle sind differentiell exprimiert Transkriptionsfaktoren. <ol><li> Besuchen Sie die Website <a href="http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php" target="_blank">http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php</a> und laden Sie die Transkriptionsfaktoren. Dann Lookup der DE-Transkriptionsfaktoren in der Excel (&lt;<html> strong&gt; Abbildung S5). </li></ol></li><li> Erzeugen .bigwig Datei für UCSC Genome Browser Visualisierung. <ol><li> Download &#39;bedtools&#39; Softwarepaket von der Website <a href="https://github.com/arq5x/bedtools2" target="_blank">https://github.com/arq5x/bedtools2</a> und installieren Sie die Software im System 31. Laden Sie die UCSC Tools &#39;bedGraphToBigWig&#39; von der Website <a href="http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/" target="_blank">http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/</a> und installieren Sie die Software im System. </li><li> In dem Ordner mit dem .bam Datei, verwenden Sie den Befehl in Abbildung S6A zu .bam Datei tophat in .bed Datei generiert konvertieren. </li><li> Nachdem die .bed Datei erzeugt wird, verwenden Sie den Befehl in Abbildung S6B zu .bigwig Datei zu generieren. Die Datei &#39;ChromInfo.txt&#39; kann von folgender URL erhältlich:Arget = &quot;_blank&quot;&gt; http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/chromInfo.txt.gz. </li><li> Beachten Sie eine benutzerdefinierte Spur auf UCSC Genome Browser. Siehe die Website <a href="http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html</a> auf, wie eine benutzerdefinierte Spur mit UCSC Genom-Browser anzuzeigen. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung S1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig1.jpg" /> Abbildung S1: Konvertieren .bcl Datei Datei auf .fastq Verwendung casava Software. <img alt="Abbildung S2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig2.jpg" /> Abbildung S2: Mapping liest Genom Referenz mit Tophat. <img alt="Abbildung S3" fo:conZelt-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52104 / 52104supplementalfig3.jpg&quot; /&gt; Abbildung S3: Nachweis von neuer Transkripte und Expressionsniveau Schätzung. <img alt="Abbildung S4" fo:content-width="3.4in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig4.jpg" /> Abbildung S4: Aufruf Differential exprimierte Gen mit DESeq Paket. <img alt="Abbildung S5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig5.jpg" /> Abbildung S5: Bezeichnung des differentiell exprimierten Transkriptionsfaktoren. <img alt="Abbildung S6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig6.jpg" /> Abbildung S6: Konvertieren Mapping-Ergebnis für die Datenvisualisierung.

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C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays.">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome research. 18, 1509-1517 (2008).</li><li>Ramskold, D., Kavak, E., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+analyze+gene+expression+using+RNA-sequencing+data.">How to analyze gene expression using RNA-sequencing data.</a> Methods in molecular biology. 802, 259-274 (2012).</li><li>Glenn, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+guide+to+next-generation+DNA+sequencers.">Field guide to next-generation DNA sequencers.</a> Mol Ecol Resour. 11, 759-769 (2011).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nature protocols. 7, 562-578 (2012).</li><li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat:+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq.">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome biology. 10, 25 (2009).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nature. 28, 511-515 (2010).</li><li>Anders, S., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+for+sequence+count+data.">Differential expression analysis for sequence count data.</a> Genome biology. 11, 106 (2010).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li><li>Cheranova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+of+transcriptomes+in+thrombin-treated+and+control+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells.">RNA-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells.</a> J Vis Exp. , (2013).</li><li>Zhang, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnimalTFDB:+a+comprehensive+animal+transcription+factor+database.">AnimalTFDB: a comprehensive animal transcription factor database.</a> Nucleic acids research. 40, 144-149 (2012).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+transcribed+loci+in+ENCODE+regions+using+RACE+sequencing+reveals+extensive+transcription+in+the+human+genome.">Systematic analysis of transcribed loci in ENCODE regions using RACE sequencing reveals extensive transcription in the human genome.</a> Genome Biol. 9, 3 (2008).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+RT-PCR+recovery+of+full-length+cDNA+clones.">Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones.</a> Biotechniques. 36, 690-696 (2004).</li><li>Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+rat+genes+by+TWINSCAN+gene+prediction,+RT-PCR,+and+direct+sequencing.">Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing.</a> Genome Res. 14, 665-671 (2004).</li><li>Dewey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+novel+human+genes+through+simultaneous+gene+prediction+in+human,+mouse,+and+rat.">Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat.</a> Genome Res. 14, 661-664 (2004).</li><li>Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Characterize Mammalian Transcriptome Complexity. , (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Mammalian Transkriptom ist sehr komplex 34-38. RNA-Seq-Technologie spielt eine immer wichtigere Rolle in den Untersuchungen der Transkriptomanalyse, neuer Transkripte Erkennung und single nucleotide Variation Entdeckung etc. Es hat viele Vorteile gegenüber anderen Methoden zur Genexpressionsanalyse. Wie in der Einleitung erwähnt, überwindet sie die Hybridisierung Artefakte der Mikroarray und kann verwendet werden, um neue Transkripte de novo zu identifizieren. Eine Einschränkung d...

Hämatopoetische Stammzellen sind selten Blutzellen, die vor allem in der Knochenmark Erwachsener Nische befinden. Sie sind für die Produktion von Zellen erforderlich ist, um das Blut wieder aufzufüllen und das Immunsystem 1 verantwortlich. Als eine Art von Stammzellen, HSK sind in der Lage, sowohl die Selbsterneuerung und Differenzierung. Erforschung von Prozessen, die das Schicksal Entscheidung des HSK zu steuern, entweder in Richtung Selbsterneuerung oder Differenzierung, werden wertvolle Hinweise auf die Manipulation von HSCs für Blutkrankheit Forschungen und klinische Nutzung 2 bieten. Ein Problem von den Forschern konfrontiert ist, dass HSCs aufrechterhalten und in vitro in einem sehr begrenzten Ausmaß erweitert werden; die überwiegende Mehrheit ihrer Nachkommen sind teilweise in der Kultur 2 differenziert. Um Schlüsselregulatoren, die die Prozesse der Selbsterneuerung und Differenzierung in einer genomweiten Maßstab steuern zu identifizieren, haben wir eine Maus primitiven hämatopoetischen Vorläuferzelllinie EML als Modellsystem. Thwird Zelllinie wurde von murinen Knochenmark 3,4 abgeleitet. Wenn mit verschiedenen Wachstumsfaktoren zugeführt wird, kann EML Zellen in erythroiden, myeloiden und lymphoiden Zellen in vitro 5 unterscheiden. Wichtig ist, dass diese Zelllinie in großer Menge in Kulturmedium, das Stammzellfaktor (SCF) und Beibehaltung ihrer multipotentiality vermehrt werden. EML Zellen in Subpopulationen von sich selbst erneuernden Lin-SCA + CD34 + getrennt und teilweise differenziert Lin-SCA-CD34- Zellen auf Oberflächenmarker CD34 und SCA 6. Ähnlich wie bei kurzfristigen HSCs, SCA + CD34 + Zellen sind in der Lage sich selbst zu erneuern. Wenn sie mit SCF, Lin-SCA + CD34 + Zellen, behandelt schnell regenerieren einer gemischten Population von Lin-SCA + CD34 + und Lin-SCA-CD34- Zellen und weiter zu vermehren 6. Die beiden Populationen ähnliche Morphologie und haben ähnliche Niveaus der c-kit-mRNA und Protein-6. Lin-SCA-CD34- Zellen können Vermehrungsmedium, das IL-3 anstelle von SCF 3. Unveiling die Schlüsselregulatoren in der EML Zellschicksal Entscheidung besseres Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen in frühen Entwicklungs Übergang während der Hämatopoese bieten. Um die zugrunde liegenden molekularen Unterschiede zwischen den sich selbst erneuernden Lin-SCA + CD34 + und teilweise differenziert Lin-SCA-CD34- Zellen zu untersuchen, RNA-Seq wir differentiell exprimierte Gene zu identifizieren. Insbesondere konzentrieren wir uns auf Transkriptionsfaktoren, wie Transkriptionsfaktoren sind entscheidend bei der Bestimmung des Zellschicksals. RNA-Seq ist eine kürzlich entwickelte Ansatz, der die Fähigkeiten der nächsten Generation Sequenzierung verwendet (NGS) -Technologien zum Profil und zu quantifizieren RNAs aus Genom 7,8 transkribiert. Kurz, Gesamt-RNA poly-A ausgewählt und fragmentiert wie die anfängliche template.The RNA-Matrize wird dann in cDNA unter Verwendung von reverser Transkriptase umgewandelt. Um Volllängen-RNA-Transkripte der Karte unter Verwendung intakter, nicht abgebauter RNA zur Konstruktion von cDNA-Bibliothek ist wichtig. Für die purHaltung der Sequenzierung werden spezifische Adaptersequenzen an beiden Enden der cDNA addiert. Dann wird in den meisten Fällen, cDNA-Moleküle werden durch PCR amplifiziert und in einem Hochdurchsatz Weise sequenziert. Nach der Sequenzierung, liest der resultiert, kann zu einem Referenzgenom und Transkriptom-Datenbank ausgerichtet werden. Die Anzahl der Lesevorgänge, die Karte an die Referenz-Gen wird gezählt, und diese Information kann verwendet werden, um die Genexpression Pegel abzuschätzen. Das liest kann auch zusammengebaut werden de novo ohne Referenzgenom, so dass das Studium der Transkriptomen in Nicht-Modellorganismen 9. RNA-seq Technik wurde auch verwendet, um Spleiß-Isoformen 10-12, neuer Transkripte 13 und Genfusionen 14 erfassen. Zusätzlich zum Nachweis von Protein-codierenden Genen kann RNA-Seq auch verwendet, um neuartige erfassen und zu analysieren Transkriptionsniveau des nicht-kodierenden RNAs, wie lange werden nicht-kodierende RNA 15,16, MikroRNA 17, 18 usw. siRNA. Wegen tEr Genauigkeit dieser Methode wurde zum Nachweis von single nucleotide Variationen 19,20 verwendet. Vor dem Aufkommen der RNA-Seq-Technologie, Mikroarray war die wichtigste Methode für die Analyse von Genexpressionsprofil verwendet. Vorgefertigte Sonden synthetisiert und anschließend an einer festen Oberfläche befestigt ist, um einen Mikroarray-Objektträger 21 zu bilden. mRNA extrahiert und in cDNA umgewandelt. Während der reversen Transkription Verfahren werden fluoreszenzmarkierte Nukleotide in die cDNA eingebaut, und die cDNA kann auf die Mikroarray-Objektträger hybridisiert werden. Die Intensität des von einer bestimmten Stelle gesammelt Signals hängt von der Menge an cDNA-Bindung an die spezifische Sonde an dieser Stelle 21. Verglichen mit RNA-Seq-Technologie, hat Microarray mehrere Einschränkungen. Zunächst setzt Microarray auf dem bereits bestehenden Wissen der Gen-Annotation, während RNA-Seq-Technologie ist in der Lage, neue Transkripte bei relativen hohen Hintergrundkonzentration, die seine Verwendung, wenn begrenzt erkennen gene Expressionsniveau ist niedrig. Außerdem hat das RNA-Seq-Technologie viel höheren Dynamikbereich der Erfassungs (8000-fach) 7, wobei aufgrund der Hinter und Sättigung von Signalen, ist die Genauigkeit der Mikroarray sowohl von hoch und niedrig exprimierten Genen 7,22 begrenzt. Schließlich unterscheiden sich Mikroarray-Sonden in ihren Hybridisierungseffizienzen, die bei einem Vergleich relativen Expressionslevel der verschiedenen Transkripte innerhalb einer Probe 23 die Ergebnisse weniger zuverlässig machen. Obwohl RNA-Seq hat viele Vorteile gegenüber Mikroarray ist ihre komplexe Datenanalyse. Dies ist einer der Gründe, warum viele Forscher Mikroarray verwenden noch immer statt RNA-Seq. Verschiedene Methoden der Bioinformatik für RNA-Seq Datenverarbeitung und -analyse 24 erforderlich. Unter mehreren Next-Generation-Sequencing (NGS) Plattformen, 454, sind Illumina, solide und Ion Torrent die am häufigsten benutzten. 454 war der erste kommerzielle NGS-Plattform. Im Gegensatz zu den anderen Sequenzierplattformenwie Illumina und SOLID erzeugt der 454-Plattform mehr gelesen Länge (durchschnittlich 700 Basis liest) 25. Länger liest sich besser für erstmalige Beschreibung transcriptiome aufgrund ihrer höheren Effizienz montieren 25. Der Hauptnachteil des 454-Plattform ist die hohe Kosten pro Megabasen der Sequenz. Die Illumina und SOLID-Plattformen erzeugen liest mit erhöhten Zahlen und kurze Längen. Die Kosten pro Megabasen-Sequenz ist viel niedriger als die Plattform 454. Aufgrund der großen Zahl von kurzen liest die Illumina und SOLID-Plattformen ist die Datenanalyse viel rechenintensiver. Der Preis des Gerätes und Reagenzien für die Sequenzierung der Ion Torrent Plattform ist billiger und die Sequenzierung Zeit kürzer 25. Allerdings ist die Fehlerrate und die Kosten pro Megabasen der Sequenz sind höher als in der Illumina und SOLID Plattformen. Unterschiedliche Plattformen haben ihre eigenen Vor- und Nachteile und erfordern unterschiedliche Methoden zur Datenanalyse. Die plaTForm sollten auf der Grundlage der Sequenzierung Zweck und der Verfügbarkeit der Mittel gewählt werden. In diesem Beitrag nehmen wir Illumina RNA-Seq-Plattform als Beispiel. Wir verwendeten EML Zelle als Modellsystem, um die Schlüsselregulatoren in EML Zellselbsterneuerung und Differenzierung zu untersuchen, und eine detaillierte Methoden der RNA-Seq Bibliothekskonstruktion und Datenanalyse für Expressionsniveau Berechnung und neuartige Transkript Erkennung. Wir haben in unserer früheren Veröffentlichung, dass RNA-seq Studie in EML Modellsystem 2, wenn sie mit Funktionsprüfung (zB shRNA Zuschlags) bieten eine leistungsfähige Ansatz zum Verständnis des molekularen Mechanismus der frühen Stadien von hämatopoetischen Differenzierung gezeigt und kann als dienen Modell für die Analyse der Zellselbsterneuerung und Differenzierung im Allgemeinen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD34 FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-81</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5981-81</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Lineage Antibody Cocktail</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558074</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Special offer sysmtem</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell Culture Treated Flasks 75cm2</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>430641</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell Culture Treated Flasks 25cm2</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>430639</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I, Amplification Grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068-015</td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI FBS&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140071</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-122</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30228.02</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage Cell Depletion Kit, mouse&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td>Isolation of lineage negative cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoVue Plus spectrophotometer&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9569-62</td>
			<td>Quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#8482; Napco&#8482; 8000 Water-Jacketed CO2 Incubators</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15-497-002&#160;</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol&#174; Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>RNA exraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq&#8482; RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48rxn)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2002</td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-2545</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of key factors regulating self-renewal and differentiation in eml hematopoietic precursor cells by rna-sequencing analysis

Hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) werden klinisch zur Behandlung Transplantation verwendet, um blutbildende System des Patienten in vielen Krankheiten, wie Leukämie und Lymphom aufzubauen. Aufklärung der Mechanismen, die HSK Selbsterneuerung und Differenzierung ist wichtig, für die Anwendung der HSK für Forschung und klinische Anwendungen. Jedoch ist es nicht möglich, große Mengen von HSZ erhalten aufgrund ihrer Unfähigkeit, in vitro zu proliferieren. Um diese Hürde zu überwinden, verwendeten wir eine Knochenmark der Maus abgeleitete Zelllinie, die EML (Erythroid, myeloische und lymphatische) Zelllinie, als Modellsystem für diese Studie. RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) wurde zunehmend zur Microarray für Genexpressionsstudien zu ersetzen. Wir berichten hier über eine detaillierte Verfahren zur Verwendung von RNA-Seq-Technologie, um die potenziellen Schlüsselfaktoren bei der Regulation der EML Zellselbsterneuerung und Differenzierung zu untersuchen. Die in diesem Papier Protokoll ist in drei Teile unterteilt. Das erste Part erklärt, wie man Kultur EML Zellen und separaten Lin-CD34 + und Lin-CD34- Zellen. Der zweite Teil des Protokolls bietet detaillierte Verfahren für Gesamt-RNA Vorbereitung und die anschließende Konstruktion der Bibliothek für Hochdurchsatz-Sequenzierung. Der letzte Teil beschreibt die Methode für die RNA-Seq Datenanalyse und erklärt, wie die Daten verwenden, um differentiell exprimierte Transkriptionsfaktoren zwischen Lin-CD34 + und Lin-CD34- Zellen zu identifizieren. Die signifikant differentiell exprimiert Transkriptionsfaktoren wurden identifiziert, um die potenziellen Schlüsselregulatoren steuern EML Zellselbsterneuerung und Differenzierung. Im Diskussionsteil dieser Arbeit unterstreichen wir die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Entwicklung dieses Experiments. Dieses Papier Zusammengefasst bietet ein Verfahren zur Verwendung von RNA-Seq-Technologie, um potentielle Regulatoren der Selbsterneuerung und Differenzierung in EML-Zellen zu identifizieren. Die Schlüsselfaktoren identifiziert werden, um nachgeschaltete Funktionsanalyse in vitro und i unterzogenn vivo.

Um differenziell exprimierte Gene in Lin-CD34 + und Lin-CD34- EML Zellen zu analysieren, haben wir RNA-Seq-Technologie. Abbildung 1 zeigt den Workflow der Verfahren. Nach der Isolierung von Lineage-negativen Zellen durch magnetische Zellsortierung, trennten wir Lin-SCA + CD34 + und Lin-SCA-CD34- Zellen mittels FACS Aria. Lin angereicherte EML-Zellen wurden mit anti-CD34, anti-Sca1 und Abstammung cocktail Antikörpern gefärbt. Nur Lin- Zellen wurden für die Analyse von Sca1 und CD34 Expression gated. Z...

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Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

RNA-Sequenzierung und Bioinformatik-Analysen wurden verwendet, um deutlich und differentiell exprimiert Transkriptionsfaktoren in Lin-CD34 + und Lin-CD34- Subpopulationen von Maus EMLcells identifizieren. Diese Transkriptionsfaktoren könnten eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Wechsel zwischen Selbsterneuerung Lin-CD34 + und teilweise differenziert Lin-CD34- Zellen spielen.

Identifizierung von Schlüsselfaktoren Regelselbsterneuerung und Differenzierung in EML hämatopoetischen Vorläuferzellen durch RNA-Sequenzierungsanalyse

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

identification-key-factors-regulating-self-renewal-differentiation

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Aufrufe.  The University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences at Houston.  RNA-Sequenzierung und Bioinformatik-Analysen wurden verwendet, um deutlich und differentiell exprimiert Transkriptionsfaktoren in Lin-CD34 + und Lin-CD34- Subpopulationen von Maus EMLcells identifizieren. Diese Transkriptionsfaktoren könnten eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Wechsel zwischen Selbsterneuerung Lin-CD34 + und teilweise differenziert Lin-CD34- Zellen spielen. 

Serie: Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Forschung

Biologie

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

Die Verwendung von SC1 (Pluripotin) zu MESC Self-Erneuerung in der Abwesenheit von LIF-Support

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will greatly facilitate the use of ES cells for developmental biology studies, disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine (reviewed in 1,2).
To expedite the identification and characterization of novel regulators of ES cell maintenance and self-renewal, we developed a fluorescence reporter-based assay to quantitatively measure the self-renewal status in mouse ES cells using the Oct4GiP cells 3. The Oct4GiP cells express the green fluorescent protein (GFP) under the control of the Oct4 gene promoter region 4,5. Oct4 is required for ES cell self-renewal, and is highly expressed in ES cells and quickly down-regulated during differentiation 6,7. As a result, GFP expression and fluorescence in the reporter cells correlates faithfully with the ES cell identity 5, and fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis can be used to closely monitor the self-renewal status of the cells at the single cell level 3,8.
Coupled with RNAi, the Oct4GiP reporter assay can be used to quickly identify and study regulators of ES cell maintenance and self-renewal 3,8. Compared to other methods for assaying self-renewal, it is more convenient, sensitive, quantitative, and of lower cost. It can be carried out in 96- or 384-well plates for large-scale studies such as high-throughput screens or genetic epistasis analysis. Finally, by using other lineage-specific reporter ES cell lines, the assay we describe here can also be modified to study fate specification during ES cell differentiation.

We describe a fluorescence reporter assay to quickly identify and characterize genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal.

Oct4GiP Reporter Assay auf Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Self-Study Erneuerung Regulate

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired factors are introduced into cold-liquid ECM-mimic gel which, after subcutaneous injection, solidifies to form an environment mimicking the cancer milieu. This matrix permits the penetration of host cells, such as endothelial cells, and therefore, the formation of vasculature.
Herein we propose a new modified matrigel plug assay, which can be exploited to illustrate the angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells, as opposed to a specific factor (e.g., bFGF and VEGF) or agent. The plug containing ECM-mimic gel is utilized to introduce the host (i.e., mouse) with a pool of factors secreted to the C.M. of fast-growing tumor-generating glioblastoma cells. We have previously described an extensive comparison of the angiogenic potential of U-87 MG human glioblastoma and its dormant-derived clone, in this system model, showing induced angiogenesis in the U-87 MG parental cells. The C.M. is prepared by filtering collected media from confluent tissue culture plates of either cell line following 48 hr incubation. Hence, it contains only factors secreted by the cells, without the cells themselves. Described here is the combination of two imaging modalities, microbubbles contrast-enhanced ultrasound imaging and intravital fibered-confocal endomicroscopy, for an accurate, real-time characterization of the extent, morphology and functionality of newly-formed blood vessels within the plugs.

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

Überwachungsfunktionen und Morphologie der Gefäßversorgung von Faktoren durch schnell wachsende Tumor erzeugende Zellen sezerniert rekrutiert

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

Retrovirale Infektion von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitete Embryoidkörper Zellen für die Analyse von hämatopoetischen Differenzierung

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...