Diese Arbeit wurde von Burroughs Wellcome Career Award in der Biomedical Sciences (AKM) unterstützt, die Whitehall Foundation Research Grant (AKM), Sloan Foundation Fellowship (AKM), NIH EY019277 (AKM) und eine NEI finanziert Vision Training Grant, EY013319 ( EAK).

<ol><li> Zur Visualisierung Neuronen im intakten Gehirn über Zwei-Photonen-Mikroskopie, ein Präparat, wo Nervenzellen mit fluoreszierenden Markern versehen werden wird. In den Experimenten stellte hier benutzen wir die GFP-M transgenen Maus Linie, die Schicht Etiketten 5 Pyramidenzellen 1. Layer 5 Pyramidenzellen Projekt dendritischen Prozesse in oberflächlichen Schichten, so dass die Visualisierung von Dendriten und dendritischen Dornen bis zu einer Tiefe von 300 um unter dem Niveau der Pia. Ein alternativer Ansatz besteht darin, Label-Zellen unter Verwendung von viralen Markern (siehe Lowery et al., Eingereicht JOVE). </li><li> Sterilisieren der Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und Autoklav-Tools für die aseptische Chirurgie. Decken die Oberfläche mit klarem Dressing. </li><li> Anesthetize Mäuse mit einem Fentanyl-Cocktail (Fentanyl 0,05 mg / kg; Midazolam 5 mg / kg; metatomadin 0,5 mg / kg) um ein Viertel Dosis Avertin (0,0075 mg / ml) mit IACUC genehmigten Verfahren folgten. Vorbehandeln Mäuse mit dem Analgetikum Buprenorphin (0,5 mg / kg) subkutan (SQ) verabreicht. Überwachen Sie den Grad der Narkose Ebene, die durch Tests Reaktion auf tail / toe kneifen. </li><li> Behalten Tier bei 37,5 ° C mit Heizdecke mit angeschlossenem Rektalthermometer. </li><li> Bewerben Augensalbe die Augen, die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern. Hood Augen mit kleinen Blatt Papier die Augen von der Lichtquelle zu schützen während der Operation. </li><li> Mit einer Schere entfernen Haare von der Rückseite des Kopfes (hinter den Ohren) auf die Augen. </li><li> Reinigen Sie die Spitze der Kopf des Tieres mit sequentieller Anwendung von 70% Ethanol, gefolgt von betadine schrubben und betadine Lösung. </li><li> Machen Sie einen L-Schnitt Schnitt hinter den Ohren und entlang der rechten oder linken Seite der Mittellinie (je nachdem, welcher Hemisphäre abgebildet wird), um die Augen. Falten Sie die Haut über und weg von der Operation vor Ort. Entfernen Sie nicht Haut, da die Haut nach dem Imaging-Sitzung vernäht werden. </li><li> Mit feinen Pinzette vorsichtig die Haut nach oben und weg von Ihrem Bereich des Interesses. </li><li> Vorsichtig abkratzen der Knochenhaut aus dem exponierten Bereich des Schädels mit sauberen Pinzette oder mikrochirurgischen Klinge. Mit Wattestäbchen, eine kleine Menge von 10% Eisen-III-Chlorid auf den Schädel vollständig trocknen, das Periost Membran und sicherzustellen, dass sie vollständig entfernt worden ist. Es ist wichtig, dass der Schädel völlig trocken, um die ordnungsgemäße Einhaltung der Leim zu gewährleisten (siehe 11). Mit einer Pinzette oder mikrochirurgischen Klinge sanft weg kratzen getrocknet Periost Membran. </li><li> Tragen Sie eine dünne Schicht von Sekundenkleber um die Imaging-Fenster des Edelstahl Kopfplatte (siehe Abbildung 1) und bringt die Platte auf den Schädel. </li><li> Mit dem hölzernen Ende eines Baumwoll-Tupfer-Stick, Leim, um Nähte innen der Imaging-Fenster; achten Sie darauf, alle Lücken zwischen den Imaging-Plate und Krümmung des Schädels zu füllen. </li><li> Geben Sie einen Tropfen Leim Beschleuniger in das Fenster. Schnell abwischen überschüssigen Leim-Beschleuniger mit einem Wattestäbchen oder kim wischen. Der Kleber muss vollständig vor dem Bohren verfestigt werden. </li><li> Beginnen Sie den Schädel in der Imaging-Fenster mit einem zahnärztlichen Bohrer mit 0,7 mm Edelstahl Grat angebracht dünn. Alternate Bohren mit gelegentlichem Auftragen von 0,9% steriler Kochsalzlösung zu vermeiden, erzeugen zu viel Hitze auf dem Schädel. </li><li> Thin einem 4x4 mm Fenster auf den Schädel mit kleinen Schlägen auf den Schädel Oberfläche mit dem zahnärztlichen Bohrer. Testen Sie die Schlankheit des Schädels mit stumpfen Ende einer Pinzette. Der Schädel Oberfläche wird leicht Gedankenstrich mit sanftem Druck. Die optimale Schädel Dicke für die Bildgebung ist zwischen 10 und 30 um. </li><li> Wenn der Schädel dünn ist und das Fenster von allen Verunreinigungen gereinigt, statt Kochsalzlösung auf dem Schädel. Fotografieren Sie die Imaging-Fenster mit einer digitalen Kamera, montiert auf eine Binokular. Fotografie und die Nutzung des Gehirns Gefäßsystem wird bei der Ortung der Lage, die Imaging-Plate für die anschließende Bildgebung Sitzungen statt zu helfen. </li><li> Transport des Tieres auf die 2-Photonen-rig. Das Tier sollte auf der Heizdecke (mit rektalen Sonde) während der gesamten Imaging-Sitzung bleiben. Hinweis: Während unter Sedierung, das Tier Körperkerntemperatur wird stark schwanken in der Abwesenheit einer Heizeinheit was in kortikalen Schäden oder sogar Tod. </li><li> Ein Zwei-Photonen-Mikroskop mit einem Mai Tai Laser, ein 10W Solid-State-Pumpe für maximale Leistung und ein modifiziertes Olympus FluoView konfokalen Einheit verwendet wird. Das System ist für tiefe Tissue Imaging optimiert und externen Detektoren sind so nah an das Ziel installiert wie möglich, um eine maximale Detektion von Fluoreszenz aus dem Gehirn ermöglichen. Eine Olympus LUMPlan fl / IR 20X/0.95NA Objektiv verwendet wird. 0,9% iger Kochsalzlösung wird während der Bildgebung für die objektive Untertauchen verwendet. </li><li> Mit diesem Mikroskop und niedrige digitaler Zoom (x1) identifizieren eine Fläche, die hell markierten Neuronen. </li><li> Mit einer digitalen Kamera angebracht, um das Mikroskop-Okular, nehmen Sie ein Foto von den Imaging-Bereich. Alternativ skizzieren das Blut Gefäßsystem Muster. Dies ist notwendig, um wiederwiederum die gleichen bildgebenden Lage zu einem späteren Zeitpunkt. </li><li> Besorgen Sie sich ein geringer Vergrößerung Stack (x20 Ziel, 512x512 Pixel, 5 um Schritt) durch das gesamte sichtbare Ausmaß des Gehirns (in der Regel Spanning ~ 200 pm) zeigt das Ausmaß der dendritischen Verzweigung. Hinweis: Diese geringe Vergrößerung Bild wird verwendet, um den Imaging-Bereich bei späteren Zeitpunkt zu lokalisieren, da beide Blutgefäße und Dendriten ihrer Struktur in jungen und erwachsenen Tieren zu erhalten. </li><li> Mit Bildbearbeitungs-Software (FluoView, v. 5.0, FV300), erhöhen die digitale Vergrößerung 8-fach. Passen Sie den X-, Y-Koordinaten (pan-Koordinaten), wenn notwendig und sammeln eine hohe Vergrößerung Stapel, die detaillierte dendritische Morphologie mit den Standorten und die Struktur der dendritischen Dornen zeigen. Nehmen Sie detaillierte Hinweise jedem Stapel Sammlung, dh pan-Koordinaten, den Bereich der Sammlung, die z-Schritt-Größe und die Anzahl der Schritte in Ihrem Stack. Diese Notizen werden genommen, wenn sie auf diese Dendriten oder Axonen zu einem späteren Zeitpunkt sein. </li><li> Nach Bildgebung, entfernen Sie die Kopfplatte durch vorsichtiges Trennplatte aus Kopfoberfläche. Mit einer Pinzette entfernen Sie alle Klebereste übrigen am Schädel und wischen Kopfoberfläche mit 0,9% steriler Kochsalzlösung. Suture die Haut über den Schädel zusammen mit Nr. 6 Nähfaden. Wischen Sie mit 70% Ethanol. Um Schmerzen zu lindern während der postoperativen Erholung, verwalten 0,1 mg / kg Buprenorphin analgetisch, SQ. </li><li> Tier in den Käfig sauber unter einer Wärmelampe, bis sie aufwacht und ist mobil. Zurück Tier ursprünglichen Käfig. </li><li> Um reimage Tier zu einem späteren Zeitpunkt (unsere Imaging Zeitpunkten kann irgendwo zwischen 2 Tagen und mehreren Monaten auseinander), zu entfernen Stiche oder öffnen Sie die Haut an Kopf mit aseptischen Verfahren wie oben. Verwenden Sie das digitale Bild des Gehirns Gefäßsystem (aufgenommen bei der ersten OP-Termin), um den ursprünglichen Imaging-Standort zu lokalisieren. Wiederanzubringen Edelstahl Kopfplatte (Schritte 10-12). Verwenden Sie einen mikrochirurgischen Klinge sanft dünne entfernt alle Knochen, der möglicherweise zwischen Bildgebung Zeitpunkten wieder gewachsen sind. Wenn nötig, dünn mit Dentalbohrers. Klare Imaging-Fenster von Schmutz und einen Tropfen 0,9% steriler Kochsalzlösung. </li><li> Carry Tier zu Zwei-Photonen-Mikroskop und suchen ursprünglichen Imaging-Bereich. Verwenden Sie die digitale Fotografie im ersten abbildenden Sitzung um Hilfe genommen. </li><li> Öffnen Sie die FluoView Programm und öffnen Sie die ursprüngliche geringer Vergrößerung Bild. Bringen Sie eine Transparenz Blatt auf dem Computer-Bildschirm und skizzieren die wichtigsten Blutgefäße Muster mit einer Transparenz Stift. </li><li> Öffnen Sie das Live-Bild und richten Sie die Blut-Gefäßsystem an die skizzierten Muster auf der Folie aus. </li><li> Um reimage die 8x in Strukturen vergrößert haben, öffnen Sie die gewünschte gesammelten Stapel aus der vorherigen Abbildung Sitzung. Skizzieren Sie die Struktur (dh axonale, dendritische, Gliazellen) auf eine transparente Folie, angebracht auf den Bildschirm. </li><li> Zoom in 8x aus dem Live-Bild und stellen Sie die Pfanne Koordinaten auf den ersten Tag Aufnahmeparameter. Je nach Genauigkeit der Ausrichtung der geringer Vergrößerung Lage, kann es notwendig sein, um auch den Winkel des Bildes leicht. Sobald die gewünschte Struktur gefunden wird, passen die Struktur Ihrer skizziert hoher Vergrößerung Muster. Sammeln Sie die z-Stapel mit den gleichen Schritt Größe und Anzahl der Z-Stapel-Bildern für die spätere Analyse. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 29 und 30, bis alle die hohe Vergrößerung Bilder wieder abgeholt werden. </li><li> Bei der Abbildung abgeschlossen ist, wiederholen Sie die Schritte 22-24. Re-imaging kann wiederholt werden, bis zu 2 separate Zeitpunkten. </li><li> Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch das Vivarium und Division of Laboratory Animal Medicine der University of Rochester School of Medicine and Dentistry Satz durchgeführt, in voller Akkreditierung durch die Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International (AAALAC) und sind in Übereinstimmung mit den staatlichen Gesetzen, Bundesgesetz und NIH-Politik. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse In GFP-M zum Ausdruck Mäuse, kann eine Teilmenge der Schicht 5 Pyramidenzellen und der entsprechenden dendritischen Prozesse einfach visualisieren mittels 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (2PLSM) 1. Hier zeigte eine ausgedünnte Schädel Vorbereitung, in der die Schädel über die gewünschte Bildgebung Lage auf ~ 10-30 um ausgedünnt ist. Korrekt ausgeführt, erlaubt unser Protokoll uns klar zu visualisieren kortikalen Dendriten und Dornen in der intakten visuellen Kortex für akute oder chronische Analyse (Abbildung 2). <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Benutzerdefinierte Kopf-und Bodenplatte. (A) Draufsicht custom made ​​Kopf und Grundplatte für ausgedünnte Schädel-Operation der Herstellung verwendet. (B) Seitenansicht von maßgeschneiderten Kopf-und Bodenplatte. (C, D) Detaillierte schematische und das Image der Kopfplatte. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> <strong&gt; Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus 2PLSM folgenden dünne Schädeldecke Vorbereitung. (A) Dendriten in vivo in der Sehrinde einer transgenen GFP-M-Maus mit zwei-Photonen-Mikroskopie abgebildet. Das Bild ist eine Projektion des einzelnen Bildes erhalten alle 5 um von der pia eine Endteufe von 175 um. Die boxed-Bereich in A repräsentiert den vergrößerten Bereich in (B) und (C) am Tag abgebildet 0 (D0) und vier Tage später (D4). (D, E) Höhere Vergrößerung von dendritischen Zweig boxed in B und C zeigen stabile Stacheln (weißer Pfeil Köpfe), verloren / Zurückziehen Stacheln (rote Pfeilspitzen) und neue Stacheln (grüne Pfeilspitzen). Maßstabsbalken = A. 200 um, B, C. 20 mu m, D, E. 5 um.

<ol>
	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo.">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li></ol>

Chronische Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ist ein zunehmend beliebtes Verfahren, um morphologische Veränderungen während der Plastizität 2-5 ausgelöst studieren. Hier zeigen wir eine ausgedünnte Schädel Vorbereitung auf die identifizierten dendritischen Dornen im intakten Gehirn der Maus auf verschiedenen bildgebenden Tagen folgen. In diesem Protokoll wird der Schädel intakt gelassen, wodurch minimale Schäden an der Rinde und was zu einem sehr niedrigen Niveau von Neuroinflammation die F...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Medetomindine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Midazolam HCL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>2,2,2-tribromoethanol </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
</td>
</tr>
<tr>
<td>2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
</td>
</tr>
<tr>
<td>TC-1000 Temp. Control System for Mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CWE, Inc.</td>
<td>TC-1000 Mouse</td>
<td>Body Temp. Regulation</td>
</tr>
<tr>
<td>Toberadex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eye Ointment</td>
</tr>
<tr>
<td>10% Ferric Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical, Inc.</td>
<td>3120-32</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microsurgical Blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Industries</td>
<td>S-6400</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 404,401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 46551</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 40140</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Zip Kicker Glue Accelerator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pacer Technology</td>
<td>PT-29</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ram Products, Inc.</td>
<td>TECH2000ON/OFF</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>#6-0 (0.7 metric ) silk suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>K8894H</td>
<td>Taper C-1</td>
</tr>
<tr>
<td>Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14084-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation

In-vivo-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (2PLSM) ermöglicht die Untersuchung von lebenden Zellen und neuronalen Prozesse im intakten Gehirn. Die hier vorgestellte Technik ermöglicht die Abbildung des gleichen Bereich des Gehirns zu verschiedenen Zeitpunkten (chronische Imaging) mit mikroskopischer Auflösung ermöglicht die Verfolgung von dendritischen Dornen, die die kleinen Strukturen, die die Mehrheit der postsynaptischen exzitatorischen Seiten im ZNS darstellen. Die Fähigkeit, klar zu lösen feinen kortikalen Strukturen über mehrere Zeitpunkte hat viele Vorteile, insbesondere bei der Untersuchung der Plastizität des Gehirns, in denen morphologische Veränderungen an den Synapsen und Schaltung Umbau erklären helfen, zugrunde liegenden Mechanismen können. In diesem Video-und Zusatzmaterial, zeigen wir ein Protokoll für chronischen in vivo-Bildgebung des intakten Gehirn mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung. Die ausgedünnten Schädel Präparat ist ein minimal-invasiven Ansatz, der mögliche Schäden an der Dura und / oder Cortex vermeidet, wodurch die Entstehung einer entzündlichen Reaktion. Wenn dieses Protokoll korrekt durchgeführt wird, ist es möglich, deutlich Überwachung von Änderungen in dendritischen Dorn Eigenschaften im intakten Gehirn über einen längeren Zeitraum.

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Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In diesem Video-und ergänzendes Material zeigen wir ein Protokoll für die chronische<em&gt; In vivo</em&gt; Abbildung des intakten Gehirn mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung.

Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

chronic-imaging-mouse-visual-cortex-using-thinned-skull

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Aufrufe.  University of Rochester. In diesem Video-und ergänzendes Material zeigen wir ein Protokoll für die chronische In vivo Abbildung des intakten Gehirn mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung.

Serie: Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Maus Neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Vorbereitung der Synaptoneurosomen von Maus Cortex mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Verdünnt-skull Kortikale Fenster-Technik für<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Funktionelle Bildgebung Auditory Cortex bei erwachsenen Katzen mit Hochfeld-fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed as candidate sites for misrouting. Since a correlation between the number of lateral geniculate nucleus (LGN) relay neurons and LGN size has been shown, and based on previously reported reductions in LGN volumes in human albinism, we suggest that fiber projections from LGN to the primary visual cortex (V1) are also reduced. Studying structural differences in the visual system of albinism can improve the understanding of the mechanism of misrouting and subsequent clinical applications. Diffusion data and tractography are useful for mapping the OR (optic radiation). This manuscript describes two algorithms for OR reconstruction in order to compare brain connectivity in albinism and controls.An MRI scanner with a 32-channel head coil was used to acquire structural scans. A T1-weighted 3D-MPRAGE sequence with 1 mm3 isotropic voxel size was used to generate high-resolution images for V1 segmentation. Multiple proton density (PD) weighted images were acquired coronally for right and left LGN localization. Diffusion tensor imaging (DTI) scans were acquired with 64 diffusion directions. Both deterministic and probabilistic tracking methods were run and compared, with LGN as the seed mask and V1 as the target mask. Though DTI provides relatively poor spatial resolution, and accurate delineation of OR may be challenging due to its low fiber density, tractography has been shown to be advantageous both in research and clinically. Tract based spatial statistics (TBSS) revealed areas of significantly reduced white matter integrity within the OR in patients with albinism compared to controls. Pairwise comparisons revealed a significant reduction in LGN to V1 connectivity in albinism compared to controls. Comparing both tracking algorithms revealed common findings, strengthening the reliability of the technique.

This manuscript describes deterministic and probabilistic algorithms for white matter (WM) reconstruction, used to examine differences in optic radiation (OR) connectivity between albinism and controls. Although probabilistic tractography follows the true course of nerve fibers more closely, deterministic tractography was run to compare the reliability and reproducibility of both techniques.

Mess Konnektivität im primären Sehbahn im Bereich Human Albinismus Diffusion Tensor-Bildgebung und Traktographie

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Bildgebung des primären Hirnrinde Zellen unter Verwendung einer 2D Kultursystem zu leben

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. Several recent studies have demonstrated the effectiveness of chronic VNS in enhancing central nervous system plasticity to improve motor rehabilitation, extinction learning, and sensory discrimination. Construction of chronically implantable devices for use in such studies is challenging due to rats&#8217; small size, and typical protocols require extensive training of personnel and time-consuming microfabrication methods. Alternatively, commercially available implantable cuff electrodes can be purchased at a significantly higher cost. In this protocol, we present a simple, low-cost method for construction of small, chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in rats. We validate the short and long-term reliability of our cuff electrodes by demonstrating that VNS in ketamine/xylazine anesthetized rats produces decreases in breathing rate consistent with activation of the Hering-Breuer reflex, both at the time of implantation and up to 10 weeks after device implantation. We further demonstrate the suitability of the cuff electrodes for use in chronic stimulation studies by pairing VNS with skilled lever press performance to induce motor cortical map plasticity.

Existing approaches for constructing chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in small rodents often require specialized equipment and/or highly trained personnel. In this protocol we demonstrate a simple, low-cost approach for fabricating chronically implantable cuff electrodes, and demonstrate their effectiveness for vagus nerve stimulation (VNS) in rats.

Vorbereitung von peripheren Nervenstimulationselektroden für die chronische Implantation bei Ratten

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...