Diese Arbeit wurde durch Bewilligungen von DOE Großen Seen Bioenergy Research Center (DOE Office of Science BER DE-FC02-07ER64494) unterstützt. Wir danken Dr. Xudong Zhang und seine Gruppenmitglieder für hilfreiche technische Diskussionen und wertvolle Anmerkungen zur Fertigstellung des Protokolls.

1. Probenvorbereitung und-Extraktion <ol><li> Freeze-Dry Bodenproben nach Feldauflistung. </li><li> Grind und homogenisieren Bodenproben mit einer Kugelmühle, Boden-Schleifmaschine, oder einen Mörser und Stößel. </li><li> Wiegen Bodenproben (mit&gt; 0,3 mg N) in einen 25 ml Kolben Hydrolyse. </li><li> Fügen Sie 10 ml 6M HCl in jeder Hydrolyse Kolben, füllen N 2-Gas in den Kolben, und fest verschließen. </li><li> Hydrolysieren bei 105 ° C in einem Inkubator für 8 Stunden mit einem Auto-Zeitschaltuhr. </li></ol> 2. Reinigung der Probe <ol><li> Entfernen Sie die Flaschen aus dem Inkubator, auf Zimmertemperatur abkühlen lassen. </li><li> Geben Sie 100 ul interner Standard myo-Inosit (1 mg mL -1 in Wasser) in jeden Kolben, durch Umschwenken mischen. </li><li> Richten Kunststoff Trichter Entleerung in 200 ml Spitzkolben mit ST / NS 24/40 Gelenke, auf Plastikbecher für Stabilität gesetzt. </li><li> Falten Sie Whatman Nr. 2 Qualitative Circles (11 cm Durchmesser) in Viertel-und Set in Trichtern. </li&gt; <li> Swirl jeder Hydrolyse Kolben und gieße Schlamm in Trichter zu filtern (Sie können weiter spülen jede Flasche mit ~ 3 ml Wasser). </li><li> Trocknen des Filtrats mit einem Rotationsverdampfer bei ~ 45 ° C, unter Vakuum. </li><li> Resuspendieren Sie das getrocknete Rückstand aus jeder Birne Kolben mit 3 ~ 5 ml Wasser (benutzen Ultraschallbad falls gewünscht), und gießen Sie in einem 40 ml Teflon-Rohr, spülen Sie den Kolben, der mit einem zweiten Aliquot von Wasser. </li><li> PH-Wert auf 6,6 bis 6,8 mit 1 M KOH-Lösung zu präzipitieren Metallionen und andere organische Moleküle. </li><li> Entfernen der Niederschläge durch Zentrifugation bei 2000 xg für 10 Minuten. </li><li> Gießen Sie den Überstand in ein 40 mL Glasröhrchen, decken Sie die Rohröffnung mit Parafilm bei -20 ° C, dann stechen Löcher in den Parafilm. </li><li> Gefrierzutrocknen den gefrorenen Überstand, um alle Flüssigkeit zu entfernen. </li><li> Der Rückstand wird mit 3 ml trockenem Methanol, Vortexen gründlich reinigen (Ultraschallbad verwenden, wenn gewünscht); Kappe das Rohr, und dann bei 2000 rcf zentrifugieren für 10 Minuten zu begleichenSalze aus. </li><li> Übertragen Sie den Überstand in ein 3 ml konischen Röhrchen Reaktion, verdampft zur Trockene RapidVap Maschine bei 45 ° C (oder unter einem leichten Strom von trockenem Stickstoff falls gewünscht). </li><li> Zu jeder Ampulle, fügen Sie 100 ul Erholung Standard N-Methyl-(1 mg mL -1 in Wasser) und 1 ml H 2 O, decken Sie die Fläschchen Münder mit Parafilm bei -20 ° C, perforieren den Parafilm, und dann einfrieren trocken . </li><li> Machen Standards: add 100 ul Muraminsäure (0,5 mg mL -1 in Methanol) wurden 100 ul Glucosamin (1 mg mL -1 in Wasser), 100 ul myo-Inosit (1 mg mL -1 in Wasser), 100 ul N- Methylglucamin (1 mg mL -1 in Wasser), und 1 ml H 2 O, Parafilm jedes Fläschchen bei -20 ° C, perforieren den Parafilm, dann gefriergetrocknet trocken. </li></ol> 3. Derivatisierung <ol><li> Planen Derivatisierungsreagenz mit 32 mg L -1 Hydroxylaminhydrochlorid und 40 mg ml -1 4-Dimethylamino-pypiperidin in Pyridin-Methanol (4:1 v / v). </li><li> Dann werden 300 ul der Derivatisierungsreagenz zu jedem der reactivials, fest verschließen und gründlich vortexen. </li><li> Setzen Sie die Fläschchen in 75-80 ° C warmen Wasserbad für 35 Minuten (gut verschlossen die Fläschchen zu vermeiden, dass kein Wasser die Fläschchen geben). </li><li> Entfernen Fläschchen aus dem Wasserbad, und auf Zimmertemperatur abkühlen lassen. </li><li> 1 ml Acetanhydrid zu jedem der 3 mL reactivials, fest verschließen und gründlich vortexen, dann in 75-80 ° C warmen Wasserbad für 25 Minuten aufwärmen. </li><li> Entfernen Fläschchen aus dem Wasserbad, und auf Zimmertemperatur abkühlen lassen. </li></ol> 4. Trennung und Messung <ol><li> 1,5 ml Dichlormethan zu jedem Fläschchen, fest verschließen und gründlich vortexen. </li><li> 1 ml 1 M HCl zu jedem Fläschchen, fest verschließen und gründlich vortexen, damit die Lösungen zu sitzen, bis die zwei Sätze getrennt ungestört, absaugen und entsorgen Sie die obere (wässrige) Phase mit 1000 ul Pipette. </li><li> Im gleichen fashion, extrahieren Sie die organische Phase 3 mal aber mit 1 ml H 2 O (mit dem letzten Waschschritt, besondere Sorgfalt walten lassen, um sicherzustellen, dass alle von der wässrigen oberen Phase wurde entfernt). </li><li> Trocknen Sie die endgültige Lösung mit RapidVap bei 45 ° C (trocken oder mit Stickstoffgas wenn gewünscht). </li><li> Man löst in 300 ul Ethylacetat-Hexan (1:1 v / v) und Transfer zu 2 ml Bernstein Schraubverschluss Durchstechflaschen mit einer kleinen Volumen-Einsatz und fest verschließen. </li><li> Zur Quantifizierung mittels GC-FID analysiert unter Verwendung eines unpolaren Fused-Silica-Kapillarsäule: 30 m lang, 0,25 mm ID, 0,25 um Filmdicke; stationäre Phase 5% Phenyl-, 95% Methyl-Polysiloxan (DB-5 oder gleichwertig) mit Wasserstoff oder Helium als Trägergas, bei 0,5 ml min -1 konstanten Durchfluss. Die Chromatographie ist besser auf Premium &quot;inert&quot; Phasen-und Wasserstoff-Trägergas, sondern ist auf die häufigsten Sorten und mit Helium akzeptabel. Die Einstellungen sind Detektor 300 ° C, 400 ml min -1 Luft und 30 ml min -1 sowohl für den Stickstoff undWasserstoff-Make-up-Gase. Die Injektion und Backofen Parameter lauten wie folgt: 1 ul-Split-Einspritzung (30:1) mit dem GC-Einlass bei 250 ° C eingestellt; anfängliche Ofentemperatur, 120 ° C; 1 min halten, erhöhen die Ofentemperatur bei 10 ° C min. -1 bis 250 ° C; 2,5 min halten;. Rampe bis 270 ° C bei 20 ° C min -1; halten 2 Minuten; Rampe auf 290 ° C bei 20 ° C min -1, halten 5 min. Einstellen der Durchflussgeschwindigkeit des Trägergases, so dass das Inositol, Glucosamin und Muraminsäure Derivate eluieren bei 250 ° C, und die N-Methylglucamin eluiert bei 270 ° C </li></ol> 5. Derivative Validation <ol><li> Verwendung weicher Ionisation LC-ESI-TOF-MS, um die molekulare Ionen zu identifizieren und die molekularen Gewichts des Derivats. </li><li> Verwenden GC-EI-MS-SIM-oder GC-EI-MSMS für Empfindlichkeitsanhebung zu gezielten Ionen des Derivats zu untersuchen. </li><li> Verwenden Sie mehrere isotopenmarkierten Reagenzien für die Herstellung der Derivate, und verwenden Sie dann die Masse Verschiebungdieser isotopenmarkierten Derivate in MS zu untersuchen, Molekül-Ion und Fragment-Ionen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Das Protokoll der Methode umfasst im Wesentlichen vier Schritte: Säureaufschluss, Probenaufbereitung, Derivatisierung und GC-Bestimmung (Abbildung 1). Ein Beispiel für die Analyse für Glucosamin und Muraminsäure von Standardmaterial und aus einer Bodenprobe ist in 2 gezeigt. Neben und Muraminsäure Glucosamin, Mannosamin und Galactosamin (zwei Isomeren von Glucosamin) gleichzeitig auch bestimmt werden unter Verwendung des Verfahrens. Basierend auf Response-Faktoren von Standards in Bezug auf den internen Standard myo-Inosit, können wir diese Biomarker in Bodenproben zu quantifizieren. Die Erholung Standard wurde verwendet, um qualitativ überwacht die Derivatisierung. Die Regelungen für die Bildung des aldononitrile Acetat derivatisierte Glucosamin und Muraminsäure sind in Abbildung 3 gezeigt </strong&gt;. Die vorgeschlagenen Strukturen der Derivate wurden durch GC-EI-MS-SIM für Empfindlichkeitsanhebung, oder weiche Ionisation LC-ESI-TOF-MS-8 bestimmt, die vorgeschlagenen Strukturen der Ionen-Fragmenten auf Elektronenionisation gebildet wurden, indem die Ionen-Spektren der untersuchten Proben mit verschiedenen Isotopen Eingemeindungen 11 hergestellt. Die Abbildung 4 zeigt die Masse Verschiebung der dominanten Ionen m / z 187 von aldononitrile Acetat derivatisierte Glucosamin in drei Szenarien, mit nicht-markierten Wirkstoffen, D-Essigsäure Anhydrit, und U -13 C-Glucosamin vorbereitet. Weitere Informationen und Erklärungen können in unseren aktuellen Publikationen 8, 11 bezeichnet werden. Diese Strategie könnte als Modell zur Ableitung dienen Chemie zu studieren. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig1.jpg" /> 1. Messung Flußdiagramm des Protokolls für die Analyse von Glucosamin und Muraminsäure im BodenProben. Das Protokoll enthält im Wesentlichen vier Schritte: Säureaufschluss, Reinigung, Derivatisierung und GC-Bestimmung. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig2.jpg" /> Abbildung 2. GC-FID-Chromatogramme von aldononitrile Acetate von Inosit, Glucosamin, Muraminsäure, Mannosamin, Galactosamin und Methylglucamin für Normen und Boden. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig3.jpg" /> 3. Schemata zur Bildung der aldononitrile Acetat derivatisierte Glucosamin und Muraminsäure. Die Zahl 1 darstellt Nitril-Reaktion. Die Zahl 2 steht für die Acetylierung. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3767/3767fig4_lg.jpg"><img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig4.jpg" /></a> Abbildung 4. Massenspektren von aldononitrile Acetat derivatisierte Glucosamin mit dem dominanten Ionen strukturell verbundenes unter EI-Modus mit (A) nicht-markierten Wirkstoffen hergestellt, (B) D-Essigsäure Anhydrit, (C) U -13 C-Glucosamin. Stern repräsentiert schwere Isotop Atom oder Isotop-Gruppe.

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	<li>Zelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+patterns+of+phospholipids+and+lipopolysaccharides+in+the+characterisation+of+microbial+communities+in+soil:+a+review.">Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review.</a> Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).</li><li>Kirk, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+studying+soil+microbial+diversity.">Methods of studying soil microbial diversity.</a> Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).</li><li>Joergensen, R. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+of+amino+sugar+aldononitrile+acetate+derivatives+used+for+isotope+enrichment+assessment+of+microbial+residues.">Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).</li><li>Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycoside+antibiotics+may+interfere+with+microbial+amino+sugar+analysis.">Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis.</a> Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die vorliegende GC-basierte Verfahren zur Analyse von aldononitrile Acetat derivatisierte Glucosamin und Muraminsäure eine relativ schnelles Verfahren, um diese Aminozucker, aus dem Boden extrahierten quantifizieren. Die Derivate sind chemisch stabil, und kann in einer Analyse bestimmt werden. Das Verfahren ist nicht auf die Bodenproben beschränkt und kann für Proben aus nicht-Bodenmatrix vereinfacht werden. Die Vakuumpumpe in diesem Verfahren verwendet wird gebaut, dass sie resistent geg...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Muraminsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2503-25mg </td></tr><tr><td> D-(+)-Glucosamin-Hydrochlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1514-100G </td></tr><tr><td> N-Methyl-D-glucamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2004-500G </td></tr><tr><td> Myo-Inosit </td><td> Fisher Scientific </td><td> A307003G025 </td></tr><tr><td> Methanol (trocken) </td><td> Acros Organics </td><td> AC326950010 </td></tr><tr><td> 4-Dimethylamino-pyridin </td><td> Acros Organics </td><td> AC148270050 </td></tr><tr><td> Ethylacetat </td><td> VWR International </td><td> BJGC100-4 </td></tr><tr><td> Hydroxlamine Hydrochlorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> H330-100 </td></tr><tr><td> Pyridin </td><td> Fisher Scientific </td><td> P368-500 </td></tr><tr><td> Essigsäureanhydrid </td> &lt;td&gt; Fisher Scientific </td><td> A10-100 </td></tr><tr><td> Dichlormethan (Methylenchlorid) </td><td> Fisher Scientific </td><td> D37-500 </td></tr><tr><td> Hexan </td><td> Fisher Scientific </td><td> H303-4 </td></tr><tr><td> Salzsäure (6M) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S456-4 </td></tr><tr><td> Hydroxylaminhydrochlorid -15 N </td><td> Icon Dienstleistungen </td><td> IN5280 </td></tr><tr><td> Essigsäureanhydrid -2 H (D 6 C 4 O 3) </td><td> Acros Organics </td><td> AC174670050 </td></tr><tr><td> D-Glucose-U -13 C </td><td> Cambridge Isotopenlabors </td><td> CLM-1396-1 </td></tr><tr><td> Ammonium sufate -15 N </td><td> Cambridge Isotopenlabors </td><td> NLM-713-1 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bezeichnung des Geräts </td><td> Firma </td><td> Typ </td></tr><tr><td> Rapid-Vap </td&gt; <td> Labconco </td><td> 790002 </td></tr><tr><td> Vacum Pumpe </td><td> KNF Neuberger </td><td> D-79112 </td></tr><tr><td> Die Hydrolyse Kolben </td><td> Fisher Scientific </td><td> 06 423A </td></tr><tr><td> Derivatisierung Mikroampulle </td><td> Fisher Scientific </td><td> 06-100E </td></tr><tr><td> GC </td><td> Hewlett-Packard </td><td> 6890 </td></tr><tr><td> MS </td><td> Hewlett-Packard </td><td> 5972 </td></tr><tr><td> LC-ESI-TOF-MS </td><td> Agilent </td><td> Ein Agilent Serie 1200 HPLC-System zu einem Agilent LC / MSD TOF-gekoppelt </td></tr></tbody></table>

gc-based detection of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid for microbial residue determination in soil

Quantitative Ansätze zur Charakterisierung von Mikroorganismen sind von entscheidender Bedeutung für ein breiteres Verständnis der mikrobiellen Status und Funktion in den Ökosystemen. Aktuelle Strategien zur mikrobiellen Analyse umfassen sowohl traditionelle Labor-Kultur-abhängigen Techniken und diese auf direkte Extraktion und die Bestimmung bestimmter Biomarker 1, 2 basiert. Wenige unter der Vielfalt der Mikroben-Spezies bewohnen Boden kann kultiviert werden, so Kultur-abhängigen Methoden einführen signifikante Verzerrungen, eine Einschränkung fehlt bei Biomarker-Analyse. Das Glucosamin, Mannosamin, Galactosamin und Muraminsäure wurden auch Maßnahmen sowohl der lebenden und toten mikrobielle Masse diente, von diesen die Glucosamin (häufigste) und Muraminsäure (eindeutig von bakteriellen Zelle) sind die wichtigsten Bestandteile in den Boden-Systeme 3 , 4. Allerdings schränkt der Mangel an Wissen über die Analyse der breiten Popularisierung wissenschaftlicher unter Gleichaltrigen. Unter allen ExiStachel Analyseverfahren, Derivatisierung zu aldononitrile Acetaten gefolgt von GC-Analyse als eine gute Option bezüglich optimal Auswuchten Präzision entwickelt, Empfindlichkeit, der Einfachheit, gute chromatographische Trennung und Stabilität bei Lagerung 5 Probe. Hier stellen wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für eine zuverlässige und relativ einfachen Analyse von Glucosamin und Muraminsäure aus dem Boden nach ihrer Bekehrung zum aldononitrile Acetate. Das Protokoll umfasst im Wesentlichen vier Schritte: Säureaufschluss, Probenaufbereitung, Derivatisierung und GC-Bestimmung. Die Schritt-für-Schritt-Verfahren wird nach früheren Veröffentlichungen 6, 7 modifiziert. Darüber hinaus präsentieren wir Ihnen eine Strategie, um strukturell validiert die Molekül-Ion des Derivats und dessen Ionen-Fragmenten auf Elektronenionisation gebildet. Wir wendeten GC-EI-MS-SIM-, LC-ESI-TOF-MS und isotopisch markierten Reagenzien, um das Molekulargewicht des aldononitrile Acetat derivatisierte Glucosamin und mur zu bestimmenAmidsäure, benutzten wir die Masse Verschiebung der isotopenmarkierten Derivaten in der Ionen-Spektrum zu Ionen-Fragmenten eines jeden Derivate 8 zu untersuchen. Neben der theoretischen Aufklärung, wird die Validierung von molekularen Ionen des Derivats und dessen Ionen-Fragmenten nützlich sein, um Forscher mit δ 13 C-oder Ionen-Fragmente dieser Biomarker in biogeochemischen Studien 9, 10.

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GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Wir beschreiben ein Verfahren Protokoll für die GC-Analyse der aldonitrile Acetat-Derivate von Glucosamin und Muraminsäure aus dem Boden extrahiert. Für Aufklärung der chemischen Mechanismus, präsentieren wir auch eine Strategie, um die Struktur des Derivats und den Ionen-Fragmenten auf Elektronenionisation gebildet bestätigen.

GC-basierte Erkennung von Aldononitrile Acetat Derivatisierte Glucosamin und Muraminsäure für Mikrobielle Rückstandsbestimmung im Boden

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

gc-based-detection-aldononitrile-acetate-derivatized-glucosamine

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K Aufrufe.  University of Wisconsin, Madison. Wir beschreiben ein Verfahren Protokoll für die GC-Analyse der aldonitrile Acetat-Derivate von Glucosamin und Muraminsäure aus dem Boden extrahiert. Für Aufklärung der chemischen Mechanismus, präsentieren wir auch eine Strategie, um die Struktur des Derivats und den Ionen-Fragmenten auf Elektronenionisation gebildet bestätigen.

Serie: GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Mikrobielle Gemeinschaften in Natur und Labor - Interview

Forschung

Biologie

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

Direkter Nachweis der Acetat-bildenden Aktivität des Enzyms Acetat-Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

Der Einsatz von Chemostate in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Isolation of Native Soil Microorganisms with Potential for Breaking Down Biodegradable Plastic Mulch Films Used in Agriculture

Fungi native to agricultural soils that colonized commercially available biodegradable mulch (BDM) films were isolated and assessed for potential to degrade plastics. Typically, when formulations of plastics are known and a source of the feedstock is available, powdered plastic can be suspended in agar-based media and degradation determined by visualization of clearing zones. However, this approach poorly mimics in situ degradation of BDMs. First, BDMs are not dispersed as small particles throughout the soil matrix. Secondly, BDMs are not sold commercially as pure polymers, but rather as films containing additives (e.g. fillers, plasticizers and dyes) that may affect microbial growth. The procedures described herein were used for isolates acquired from soil-buried mulch films. Fungal isolates acquired from excavated BDMs were tested individually for growth on pieces of new, disinfested BDMs laid atop defined medium containing no carbon source except agar. Isolates that grew on BDMs were further tested in liquid medium where BDMs were the sole added carbon source. After approximately ten weeks, fungal colonization and BDM degradation were assessed by scanning electron microscopy. Isolates were identified via analysis of ribosomal RNA gene sequences. This report describes methods for fungal isolation, but bacteria also were isolated using these methods by substituting media appropriate for bacteria. Our methodology should prove useful for studies investigating breakdown of intact plastic films or products for which plastic feedstocks are either unknown or not available. However our approach does not provide a quantitative method for comparing rates of BDM degradation.

Plastic films labeled "biodegradable" are commercially available for agricultural use as mulches. Tillage represents an attractive disposal method, but degradation under field conditions is poorly understood. The purpose of this study was to develop methods for isolating native soil fungi and bacteria that colonize plastic mulch films after field burial.

Isolation der Native Soil Mikroorganismen mit Potenzial für den Abbau von biologisch abbaubaren Kunststoff Mulch Films in der Landwirtschaft eingesetzt

Fungi native to agricultural soils that colonized commercially available biodegradable mulch (BDM) films were isolated and assessed for potential to ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. The advantages of pyrosequencing for microbiology applications include rapid and reliable high-throughput screening and accurate identification of microbes and microbial genome mutations. Pyrosequencing involves sequencing of DNA by synthesizing the complementary strand a single base at a time, while determining the specific nucleotide being incorporated during the synthesis reaction. The reaction occurs on immobilized single stranded template DNA where the four deoxyribonucleotides (dNTP) are added sequentially and the unincorporated dNTPs are enzymatically degraded before addition of the next dNTP to the synthesis reaction. Detection of the specific base incorporated into the template is monitored by generation of chemiluminescent signals. The order of dNTPs that produce the chemiluminescent signals determines the DNA sequence of the template. The real-time sequencing capability of pyrosequencing technology enables rapid microbial identification in a single assay. In addition, the pyrosequencing instrument, can analyze the full genetic diversity of anti-microbial drug resistance, including typing of SNPs, point mutations, insertions, and deletions, as well as quantification of multiple gene copies that may occur in some anti-microbial resistance patterns.

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains, and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. In this video, the procedure for microbial amplicon generation, amplicon pyrosequencing, and DNA sequence analysis will be demonstrated.

Pyrosequencing für Mikrobielle Identifizierung und Charakterisierung

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

Bestimmung der Fettsäureoxidation und Lipogenese in Maus primären Hepatozyten

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Methoden zur Bestimmung von Preisen von Glucose und die Oxidation von Fettsäuren in der isolierten Arbeitsrattenherz

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against soilborne fungus Rhizoctonia solani. R. solani is a pathogen of a wide range of plant hosts worldwide. The fungus survives in soils as a saprophyte and grows rapidly on simple water agar media. The plate assay is a rapid method to compare composts for their ability to slow the growth of R. solani. The assay also correlates well with suppression of other soilborne fungal pathogens that survive as saprophytes in soils such as Alternaria early blights, Fusarium wilt, Phytophthora root rot, and Pythium root rot.

Presented is a protocol for a plate competition assay to identify whether a specific compost is likely to contain bacteria and fungi that suppress growth of Rhizoctonia solani.

Eine Platte-Wettbewerb-Assay als eine schnelle vorläufige Beurteilung der Krankheit Unterdrückung

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.