Name: analysis of n-glycans from raphanus sativus cultivars using pngase h+
Uploaded: 2018-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
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Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch den Natural Science Foundation of China (Zuschuss Zahlen 31471703, A0201300537 und 31671854, j.v. und l.l., Anzahl 31470435 gewähren, G.Y.), und die 100 ausländische Talente Plan (Grant-Nummer JSB2014012, j.v.).

1. die Probenahme
<ol><li>Verschiedene Sorten von frischem Rettich (Raphanus Sativus L.) zu erwerben.</li>
</ol>2. Isolierung von Proteinen aus Rettich
<ol><li>Ca. 100 g frische Radieschen mit einem Küche Mixer für 10 min zu homogenisieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Gülle 50 mL Zentrifugenröhrchen, Zentrifuge bei 14.000 × g bei 4 ° C für 20 min die unlösliche Material zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen des Überstands vorsichtig in eine neue 50 mL Zentrifugenröhrchen und fügen Sie ein gleiches Volumen 2 M Trichloressigsäure Säure (TCA) Lösung. Hinweis: Hinzufügen von TCA wird löslich (Glyco) Proteine ausgefällt.</li>
	<li>Bei 14.000 × g bei 4 ° C für 30 min zentrifugieren und den überstand von gebeizte (Glyco) Proteine zu entfernen.</li>
	<li>Waschen Sie die Pellets mit 20 mL entionisiertem Wasser und Zentrifuge bei 14.000 × g bei 4 ° C für 5 min, lösliche Oligosaccharide und Polysaccharide zu entfernen.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.5. vier Mal.</li>
	<li>Wieder aussetzen Sie, die Pellets in 1 mL entionisiertem Wasser und Übertragung auf eine frische 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
</ol>3. Vorbereitung der N- Glykane
<ol><li>Mix 50 µL Proteinlösung aus Schritt 2.7. (Dies entspricht 5 g frische Radieschen) mit 0,2 mU von rekombinanten PNGase H+ in 10 mM-Essigsäure.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 37 ° C für 12 h. Zentrifugieren Sie nach der Inkubation bei 14.000 × g für 5 min um die extra-Protein und Enzym zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie den überstand auf eine frische 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
</ol>4. Reinigung des N- Glykane
<ol><li>Vorbereiten der Festphasen-Extraktion (SPE) Spalte zu bereichern die N- Glykane und Salze und andere Verunreinigungen zu entfernen, aus dem Reaktionsgemisch, Erhöhung der Selektivität des Fluorogenic 2-aminobenzamid (2-AB) Kennzeichnung Agenten für N- glycan Derivatisierung.<ol>
<li>Fügen Sie 3 mL deionisiertes Wasser, waschen Sie die Spalte hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie 3 mL 80 % Acetonitril Lösung mit Trifluoroacetic Säure (TFA, 0,1 % V/V), um aktiv die SPE-Spalte hinzu.</li>
		<li>Hinzugeben Sie 3 mL deionisiertes Wasser für den SPE-Säulen equilibrate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Probe von Schritt 3.3 auf die Säule übertragen und die Durchströmung zu verwerfen.</li>
	<li>Hinzugeben Sie 1,5 mL deionisiertes Wasser, waschen Sie die Spalte und entsorgen Sie den Durchfluss.</li>
	<li>Eluieren freigegeben N- Glykane aus der Spalte mit 1,5 mL 20 % Acetonitril Wasserlösung mit 0,1 % TFA (V/V) in ein 2 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Lösungsmittel durch zentrifugale verdunsten bei Raumtemperatur. Verdampfen Sie, bis die Probe vollständig trocken ist.</li>
</ol>(5) Fluoreszenz Derivatisierung von N- Glykanen
<ol><li>Bereiten Sie 1 mL 2-AB-Lösung, bestehend aus 35 mM 2-AB und 0,1 M-Natrium-Cyanoborohydride in Dimethyl Sulfoxid/Essigsäure Säurelösung (7:3, V/V).</li>
	<li>Fügen Sie sechs verschiedene Radieschen 5 µL 2-AB-Lösung für die getrockneten Proben (Schritt 4.5.) abgeleitet. Vortex: jede Probe, bis Sie vollständig aufgelöst.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mischung für 2 h bei 65 ° c</li>
	<li>Lassen Sie die Probe auf Raumtemperatur für 5 min abkühlen, und fügen Sie 5 µL deionisiertes Wasser und 40 µL Acetonitril. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 14.000 x g für 3 min.</li>
	<li>Übertragen Sie 48 µL aus der Überstand in ein 300 µL High-Erholung-HPLC-Fläschchen. Speichern Sie die derivatisierte N- Glycan Proben bei-20 ° C bis zu einem Monat.</li>
</ol>6. HILIC-UPLC Profilierung der N- Glykane
<ol><li>Analysieren Sie die Proben unter Verwendung eines Standardsystems UPLC bzw. an eine Online-Fluoreszenz-Detectorset bei der Anregung/Emission Wellenlängen von 330 nm/420 nm, angeschlossen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine hydrophobe Wechselwirkung Flüssigkeitschromatographie (HILIC)-UPLC Glycan Spalte an eine Spalte Temperatur von 60 ° C für die Analyse.</li>
	<li>Bereiten Sie Lösungsmittel A durch Verdünnung 50 mL der Stammlösung (1 M Ammonium-Formiat Lösung, pH 4,5) mit 950 mL flüssige Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LCMS)-Wasser zu benoten. Bereiten Sie die Stammlösung wie folgt:<ol>
<li>700 mL LCMS-Klasse H2O. 43 mL Ameisensäure hinzufügen</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 4,5 durch tropfenweise Zugabe von wässrigen Ammoniaklösung (25 % w/w).</li>
		<li>Das Lösungsmittel auf ein Messzylinder übertragen und LCMS-Klasse H2O. Store bei 4-6 ° C für bis zu 3 Monaten bis zu 1000 mL einfüllen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie LCMS-Grade Acetonitril als Lösungsmittel B.</li>
	<li>N- Glykane mit folgenden Farbverlauf Elution zu trennen:<ol>
<li>Durch das Hinzufügen von 95 % der Lösungsmittel B in Lösungsmittel A. Set die Durchflussmenge bei 0,5 mL/min von 0 bis 44,5 min starten.</li>
		<li>Von 0 min bis 6 min verringern Sie allmählich den Anteil des Lösungsmittels B mit einem linearen Farbverlauf to78 %.</li>
		<li>Von 6 min bis 44,5 min verringern Sie allmählich den Anteil des Lösungsmittels B mit einem linearen Farbverlauf auf 55,9 %.</li>
		<li>Von 44,5 min bis 46,5 min schnell verringern Sie den Anteil des Lösungsmittels B mit einem linearen Farbverlauf von 55,9 % auf 0 % bei 0 % für 2 min halten Sie und initiieren Sie Waschen der Spalte zu. Reduzieren Sie die Durchflussmenge auf 0,25 mL/min von 44,5 auf 55 min.</li>
		<li>Waschen Sie die Spalte weiter durch Lösungsmittel B auf 95 % von 48,5 min bis 50,5 min erhöhen und bei 95 % für 4,5 min halten.</li>
		<li>Re equilibrate der Spalte um die Startbedingungen des 95 % Lösungsmittel B mit 0,5 mL/min von 50,5 auf 57 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injizieren Sie 45 µL der Probe in der UPLC-System.</li>
	<li>Eluieren Sie die N- Glykane von UPLC mit Retentionszeiten zwischen 15 und 40 min.</li>
	<li>Jeder beobachteten UPLC Peak Bruch mit 2 mL Zentrifuge Röhren sammeln und Trocknen der Proben durch zentrifugale verdampfen.</li>
	<li>Injizieren Sie ungefähr 1 Pmol 2-AB mit der Bezeichnung Dextran standard (2−20 Glucose-Einheiten), die Pflanze -N- Glycan Profilierung zu kalibrieren und ihre Elution Zeiten in standardisierten Glucose-Einheiten zuweisen.</li>
</ol>(7) MALDI-TOF-MS-Analyse
<ol><li>Auflösen der Proben aus Schritt 6,8 in 5 µL LCMS-Wasser zu benoten. Mix 1 µL der Probenlösung und 1 µL 6-Aza-2-Thiothymine (ATT) Lösung (0.3 % w/V in wässrigem Acetonitril 70 % V/V) und die Mischung auf die MALDI-TOF-Probenträger Pipette.</li>
	<li>Analysieren Sie die Proben mit einem MALDI-TOF Massenspektrometer Instrument im positiven Ionen-Modus durch Drücken der Schaltfläche " starten ".</li>
	<li>Analysieren Sie die Massenspektren mithilfe der begleitenden MALDI-TOF-MS-Analyse-Software.</li>
	<li>Interpretieren Sie die Spektren, die mit einer open-Source Glycan Auslegung Software19. Legen Sie die Suchparameter für 2-AB Kennzeichnung [M + Na]+, und legen Sie den Parameter Genauigkeit 2.0 da.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Altmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Protein+Glycosylation+in+Allergy.">The Role of Protein Glycosylation in Allergy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).</li><li>Van Ree, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;+(1,+2)-xylose+and+&#945;+(1,+3)-fucose+residues+have+a+strong+contribution+in+IgE+binding+to+plant+glycoallergens.">&#946; (1, 2)-xylose and &#945; (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).</li><li>Biswas, H., Chattopadhyaya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+Curcuma+longa+rhizome+lectin:+Role+of+N-linked+glycosylation.">Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation.</a> Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).</li><li>Lefebvre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+N-glycosylation+sites+and+CXC+motifs+in+trafficking+of+Medicago+truncatula+Nod+factor+perception+protein+to+plasma+membrane.">Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).</li><li>Severino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+glycan+moiety+on+the+structure-function+relationships+of+PD-L1,+type+1+ribosome-inactivating+protein+from+P.+dioica+leaves.">The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves.</a> Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).</li><li>Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. 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Q., Lee, Y. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+sample+preparation+methodology+for+plant+N-.glycan+analysis+using+acid-stable+PNGase+H+.">Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).</li><li>Wang, T., Hu, X. -. C., Cai, Z. -. P., Voglmeir, J., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+Quantitative+Analysis+of+Carbohydrate+Modification+on+Glycoproteins+from+seeds+of+Ginkgo+biloba.">Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).</li><li>Ceroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GlycoWorkbench:+a+tool+for+the+computer-assisted+annotation+of+mass+spectra+of+glycans.">GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans.</a> Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Protokoll, die, das wir hier vorgestellt haben, erlaubt den Vergleich der N- Glycan Profile von verschiedenen Sorten von Rettich. Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode im Vergleich zu bestehenden Protokolle ist, dass keine Puffer Änderungen zwischen die enzymatische Freisetzung von N- Glykanen und der Derivatisierung Reaktion mit 2-AB erforderlich sind. Der wichtigste Schritt dieses Verfahrens ist die Reinigung von N- Glykanen mit der Spalte "SPE" als Verstoß gegen Salze zu entfernen od...

N- Glykane in Pflanzen haben erhöhte Aufmerksamkeit in den letzten Jahren gezogen, wie die bisherige Forschung N- Glykane als eine potenzielle Quelle für immunologische Kreuzreaktionen hervorhob, die allergische Reaktionen1,2 provozieren kann . Es nachweislich bereits, dass N- Glykane auf Pflanze Glykoproteine katalytische Aktivität3,4, Thermostabilität und klappbare5,6 oder subzelluläre Lokalisierung beeinflussen kann und Sekretion7. Um die Glycan-Strukturen mit ihren jeweiligen Funktionen zu korrelieren, muss N- Glykane zuerst aus Glykoproteinen entweder chemisch oder enzymatisch entlassen werden. Die klassische chemische Methode für die Freigabe von N- und O- Glykanen ist β-Eliminierung, in denen alkalische Probenbehandlung durch Reduktion mit Natriumborhydrid ein Alditol8weichen begleitet wird. Jedoch dieses Verfahren schließt mit einem Fluorophore beschriften und verursacht erhebliche Verfall der Monosaccharid-Einheiten aus der reduzierenden Ende der Glycan Struktur. Chemische Deglycosylation basierend auf Ammonium Hydroxid/Carbonat Behandlung ist auch eine häufig verwendete alternative Methode9. Keines dieser Verfahren chemische Freisetzung verschlechtert intakte Proteine, die massenspektrometrische Analyse der unbeschrifteten Glycan Pools ohne die Einmischung von Peptid-Fragmente in den gleichen Massenbereich ermöglicht. Ein Nachteil dieser Methoden ist jedoch die erhöhte Abbaurate von α1, 3-Fucosylated N- Glykane, eine gemeinsame Struktur der Kohlenhydrate in Pflanzen10gefunden. Alternativ, enzymatischen Freisetzung von Methoden mit Peptid:N- Glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) werden auch eingesetzt. Rekombinante PNGase F (von Flavobacterium Meningosepticum) ist die häufigste Wahl und erlaubt die Freigabe aller Arten von N- Glykanen, außer die Strukturen mit einem Kern α1, 3 Fucose11,12. PNGase A (isoliert aus Mandel Samen) ist daher in der Regel für die Analyse der Anlage N- Glykane13verwendet. Jedoch dieses Enzym Deglycosylates nur proteolytisch abgeleitete Glykopeptide, und ist nicht in der Lage, Deglycosylate native Glykoproteine14. Daher ist eine mehrstufige Probe Aufarbeitung vor weiteren Analyse erforderlich, die umfangreichen Verlust von Glykoproteinen, insbesondere der niedrige Fülle15führt. Das übergeordnete Ziel der Methode ist, einen optimierten Arbeitsfluss für N- Glycan Release und Fluoreszenz-Beschriftung in eine einfache und robuste Art und Weise zu präsentieren. Die zugrunde liegende Logik ist, dass PNGase H+, das war vor kurzem in Terriglobus Roseus entdeckt und in E. Colirekombinant ausgedrückt werden kann, können N- Glykane direkt aus dem Protein-Gerüst in sauren hydrolyseneigung Bedingungen-16. Ein entscheidender Vorteil der Verwendung von PNGase H+ gegenüber alternativen Methoden ist, dass fluoreszierende Kennzeichnung Reaktionen in der selben Reaktionsgefäß durchgeführt werden können, ohne die Reaktion Puffer17,18. Die einfache Zubereitung Bedingungen und hohe Rückgewinnung von niedrig-Fülle Oligosaccharide machen diese Methode ein wertvolles Werkzeug in der Analyse von N- Glykanen. Dieses Protokoll eignet sich für die Analyse der N- Glykane von verschiedenen Pflanzenarten.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid&amp;nbsp;</td><td>SCR, Shanghai</td><td>80132618</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid glacial</td><td>Huada, Guangzhou</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>General-reagent</td><td>G80988C</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Energy chemical</td><td>W810031</td><td></td></tr><tr><td>2-aminobenzamide</td><td>Heowns, Tianjin</td><td>A41900</td><td></td></tr><tr><td>Sodium cyanoborohydride</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>314162</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Huada, Guangzhou</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol</td><td>Agilent Technologies</td><td>AT-5190-6998</td><td></td></tr><tr><td>6-Aza-2-thiothymine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>275514</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tools/Materials:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kitchen blender</td><td>Bear, Guangzhou</td><td>LLJ-A10T1</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Techcomp</td><td>CT15RT</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal Evaporator</td><td>Hualida, Taicang</td><td>LNG-T120</td><td></td></tr><tr><td>SPE column</td><td>Supelco</td><td>Supelclean ENVI Carb SPE column</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF mass spectrometer</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;HPLC Analysis:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-recovery HPLC vial</td><td>Agilent Technologies</td><td>&amp;nbsp;# 5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>HPLC System</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Detector for HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Column oven</td><td>Hengxin</td><td>CO-2000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Column</td><td>Waters</td><td>Acquity UPLC BEH glycan column</td><td>2.1 &amp;times; 150 mm, 1.7 &amp;mu;m particle size</td></tr><tr><td>LCMS-grade Water</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>LCMS-grade Acetonitrile</td><td>Merck Millipore</td><td># 100029</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Aladdin</td><td>F112034</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia solution</td><td>Aladdin</td><td>A112080</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of n-glycans from raphanus sativus cultivars using pngase h+

In den letzten Jahren haben die Kohlenhydrat-Moieties Pflanzen beträchtliche Aufmerksamkeit empfangen, da sie eine potentielle Quelle von kreuzreaktiven, Allergie provozieren Immunantworten sind. Darüber hinaus auch spielen Kohlenhydrat-Strukturen eine entscheidende Rolle im Stoffwechsel der Pflanze. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und schnelle Methode für die Vorbereitung und Analyse von N- Glykanen aus verschiedenen Sorten von Rettich (Raphanus Sativus) mit einem N- Glycanase speziell für die Freisetzung von pflanzliche Kohlenhydrat-Strukturen. Um dies zu erreichen, wurden grobe Trichloressigsäure Säure Ausscheidungen von Rettich Homogenates mit PNGase H+behandelt und mit 2-aminobenzamid als fluoreszierende Tag gekennzeichnet. Die beschrifteten N- Glycan Proben wurden anschließend durch ultra-Performance liquid Chromatography (UPLC) Trennung und Matrix-assisted Laser Desorption ionisation-Zeit der Massenspektrometrie Flug (MALDI-TOF) für eine detaillierte Struktur-analysiert. Bewertung und die relative Abundancies der Rettich abgeleitet N- Glycan Strukturen zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann auch für die Analyse von N- Glykanen aus verschiedenen anderen Pflanzenarten verwendet werden und kann für weitere Untersuchungen der Funktion und Wirkung von N- Glykanen auf die menschliche Gesundheit nützlich sein.

Abbildung 1 zeigt einen schematischen Überblick über die beschriebene Protokoll, einschließlich der Isolierung von Proteinen (Glyco-) aus Rettich, der Vorbereitung von N- Glykanen, UPLC Analyse und die MALDI-TOF-MS-Analyse dieser Komponenten. Abbildung 2 zeigt repräsentative UPLC Chromatogramme von derivatisierte N- Glykane der analysierten Rettich Sorten. Abbildung 3 zeigt die ...

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Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

Analyse der N- Glykane von Raphanus Sativus Sorten verwenden PNGase H+

Wir beschreiben eine einfache und schnelle Methode für die Aufbereitung und Analyse von N- Glykanen aus verschiedenen Sorten von Rettich (Raphanus Sativus).

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, ...

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Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

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Serie: Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts of purified material. Here, we describe a simple method for gaining detailed polysaccharide structural information, including resolution of structural isomers. For polysaccharide analysis by gel electrophoresis (PACE), plant cell wall material is hydrolyzed with glycosyl hydrolases specific to the polysaccharide of interest (e.g., mannanases for mannan). Large format polyacrylamide gels are then used to separate the released oligosaccharides, which have been fluorescently labeled. Gels can be visualized with a modified gel imaging system (see Table of Materials). The resulting oligosaccharide fingerprint can either be compared qualitatively or, with replication, quantitatively. Linkage and branching information can be established using additional glycosyl hydrolases (e.g., mannosidases and galactosidases). Whilst this protocol describes a method for analyzing glucomannan structure, it can be applied to any polysaccharide for which characterized glycosyl hydrolases exist. Alternatively, it can be used to characterize novel glycosyl hydrolases using defined polysaccharide substrates.

A protocol for the structural analysis of polysaccharides by gel electrophoresis (PACE), using mannan as an example, is described.

Strukturelle Charakterisierung von Mannan Zellwand Polysaccharide in Anlagen, in denen Tempo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Forschung

Biochemie

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define pathways, improve treatment, understand disease, and aid biomarker discovery. N-linked glycosylation is one of the most important and robust post-translational modifications on proteins and regulates critical cell functions such as signaling, adhesion, and enzymatic function. Analytical techniques to purify and analyze N-glycans have remained relatively static over the last decade. While accurate and effective, they commonly require significant expertise and resources. Though some high-throughput purification schemes have been developed, they have yet to find widespread adoption and often rely on the enrichment of glycopeptides. One promising method, developed by Thomas-Oates et al., filter aided N-glycan separation (FANGS), was qualitatively demonstrated on tissues. Herein, we adapted FANGS to plasma and coupled it to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy in order to achieve accurate relative quantification by liquid chromatography mass spectrometry and enhanced electrospray ionization. Furthermore, we designed new functionality to the protocol by achieving tandem, shotgun proteomics and glycosylation site analysis on hen plasma. We showed that N-glycans purified on filter and derivatized by hydrophobic hydrazide tags were comparable in terms of abundance and class to those by solid phase extraction (SPE); the latter is considered a gold standard in the field. Importantly, the variability in the two protocols was not statistically different. Proteomic data that was collected in-line with glycomic data had the same depth compared to a standard trypsin digest. Peptide deamidation is minimized in the protocol, limiting non-specific deamidation detected at glycosylation motifs. This allowed for direct glycosylation site analysis, though the protocol can accommodate 18O site labeling as well. Overall, we demonstrated a new in-line high-throughput, unbiased, filter based protocol for quantitative glycomics and proteomics analysis.

A high-throughput protocol was developed for combined proteomics and glycomics purification and LC-MS/MS quantification in plasma. Deamidation analysis of N-linked glycosylation motifs was specific to deglycosylated sites. Accurate quantitation of N-glycans was achieved by coupling filter aided N-glycan separation to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy.

Eine quantitative Glycomics und Proteomics Kombinierte Reinigungsstrategie

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Chemie

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are commonly found on human glycoproteins. To achieve the desired structural diversity, the strategy began with the chemo-enzymatic synthesis of three kinds of oligosaccharyl fluoride modules, followed by their stepwise &#945;-selective glycosylations at the 3-O and 6-O positions of the mannose residue of the common core trisaccharide having a crucial &#946;-mannoside linkage. We further attached the N-glycans to the surface of an aluminum oxide-coated glass (ACG) slide to create a covalent mixed array for the analysis of hetero-ligand interaction with an HIV antibody. In particular, the binding behavior of a newly isolated HIV-1 broadly neutralizing antibody (bNAb), PG9, to the mixture of closely spaced Man5GlcNAc2 (Man5) and 2,6-di-sialylated bi-antennary complex type N-glycan (SCT) on an ACG array, opens a new avenue to guide the effective immunogen design for HIV vaccine development. In addition, our ACG array embodies a powerful tool to study other HIV antibodies for hetero-ligand binding behavior.

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

A modular approach to the synthesis of N-glycans for attachment to an aluminum oxide-coated glass slide (ACG slide) as a glycan microarray has been developed and its use for the profiling of an HIV broadly neutralizing antibody has been demonstrated.

Chemo-enzymatische Synthese von N- Glykanen für Array-Entwicklung und HIV-Antikörper-Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

Glycosylation is a vital modification found in proteins. N-glycan profiling of glycoproteins is required to detect novel biomarker candidates and determine glycan alterations in diseases. Most commercially available biopharmaceutical proteins are glycoproteins. The efficacy of these drugs is affected by glycosylation patterns. Therefore, an in-depth characterization method for the N-glycans is necessary. Here, we present a comprehensive approach for qualitative and quantitative analysis of N-glycans using hydrophilic interaction liquid chromatography equipped with fluorescence detection and tandem mass spectrometry (HILIC-FLD-MS/MS). N-glycans were released from glycoproteins with a facile method and labeled by a procainamide fluorophore tag in the strategy. Subsequently, the procainamide labeled N-glycans were analyzed by a HILIC-FLD-MS/MS technique. In this approach, N-glycan structures were confirmed by the tandem mass spectrometric analysis, whereas fluorescence detection was used for the quantitative analysis. An application for data analysis of the detected N-glycan peaks is described in the study. This protocol can be applied to any glycoprotein extracted from various species.

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

N-glycan profiling of glycoproteins is essential for discovering novel biomarkers and understanding glycan functions in cellular events. Additionally, N-glycan analysis of protein biopharmaceuticals is very important for human use. In this current article, a high-throughput strategy for identifying and quantifying N-glycan structures was presented using the HILIC-FLD-MS/MS technique.

Glycosylation is a vital modification found in proteins. N-glycan profiling of glycoproteins is required to detect novel biomarker candidates and ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulse-Chase-Analyse von N-verknüpften Zuckerketten von Glykoproteinen in Säugerzellen

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Biologie

Nonspecific Proteolysis-Based Glycomics Strategy for Bacterial Glycoproteins

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the specific roles of glycans, the relationship between their structures and their impact on the functions of proteins. A common method for glycan analysis is to employ exoglycosidase cleavage to release N-linked glycans from glycoproteins or glycopeptides using Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F). However, the glycan-protein linkages in bacteria are different and there is no enzyme available to release glycans from bacterial glycoproteins. In addition, free glycans have also been described in mammalian cells, bacteria, yeast, plants, and fish. In this article, we present a method that can characterize the N-linked glycosylation system in Campylobacter jejuni by detecting asparagine (Asn)-linked and free glycans that are not attached to their target proteins. In this method, total proteins from C. jejuni were digested by Pronase E with a higher enzyme to protein ratio (2:1&#8722;3:1) and a longer incubation time (48&#8722;72 h). The resulted Asn-glycans and free glycans were then purified using porous graphitic carbon cartridges, permethylated, and analyzed by mass spectrometry.

This study presents a method for glycomics analysis of glycoproteins by a combination of pronase E digestion, permethylation, and mass spectrometry analysis. This method is capable of analyzing all types of N-linked glycans, including bacterial N-glycans.

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Profilierung von kolorektalem Krebsgewebe mittels Glykomics-gesteuerter Glykoproteomik

Glycomics-Guided Glycoproteomics Facilitates Comprehensive Profiling of the Glycoproteome in Complex Tumor Microenvironments

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven glycomics and glycoproteomics have emerged as powerful approaches to analyze liberated glycans and intact glycopeptides, respectively, offering a deeper understanding of the heterogeneous glycoproteome in the tumor microenvironment (TME). This protocol details the glycomics-guided glycoproteomics method, an integrated omics technology, which firstly employs porous graphitized carbon-LC-MS/MS-based glycomics to elucidate the glycan structures and their quantitative distribution in the glycome of tumor tissues, cell populations, or bodily fluids being investigated. This allows for a comparative glycomics analysis to identify altered glycosylation across patient groups, disease stages, or conditions, and, importantly, serves to enhance the downstream glycoproteomics analysis of the same sample(s) by creating a library of known glycan structures, thus reducing the data search time and the glycoprotein misidentification rate. Focusing on N-glycoproteome profiling, the sample preparation steps for the glycomics-guided glycoproteomics method are detailed in this protocol, and key aspects of the data collection and analysis are discussed. The glycomics-guided glycoproteomics method provides quantitative information on the glycoproteins present in the TME and their glycosylation sites, site occupancy, and site-specific glycan structures. Representative results are presented from formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissues from colorectal cancer patients, demonstrating that the method is sensitive and compatible with tissue sections commonly found in biobanks. Glycomics-guided glycoproteomics, therefore, offers a comprehensive view into the heterogeneity and dynamics of the glycoproteome in complex TMEs, generating robust biochemical data required to better understand the glycobiology of cancers.

<meta charset="utf8"></head><body>Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik ermöglicht eine umfassende Profilierung des Glykoproteoms in komplexen Tumormikroumgebungen

This protocol details the glycomics-guided glycoproteomics method, an integrated omics technology that offers comprehensive insights into the heterogeneous glycoproteome in complex tumor microenvironments required to better understand the glycobiology of cancers.

Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik ermöglicht eine umfassende Profilierung des Glykoproteoms in komplexen Tumormikroumgebungen 

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven ...

Krebsforschung

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Glykosylierung mit speziellen Endo-und Exoglycosidasen

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Analyse der N- Glykane von Raphanus Sativus Sorten verwenden PNGase H⁺

Zusammenfassung

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Strukturelle Charakterisierung von Mannan Zellwand Polysaccharide in Anlagen, in denen Tempo

Eine quantitative Glycomics und Proteomics Kombinierte Reinigungsstrategie

Chemo-enzymatische Synthese von N- Glykanen für Array-Entwicklung und HIV-Antikörper-Profiling

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

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Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik ermöglicht eine umfassende Profilierung des Glykoproteoms in komplexen Tumormikroumgebungen

Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik ermöglicht eine umfassende Profilierung des Glykoproteoms in komplexen Tumormikroumgebungen

Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik ermöglicht eine umfassende Profilierung des Glykoproteoms in komplexen Tumormikroumgebungen

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Glykosylierung mit speziellen Endo-und Exoglycosidasen