Wir danken Dr. Krishanu Ray for Drosophila Aktien, Tarjani Agarwal für die Aufrechterhaltung einer Drosophila Käfig, Peter Juo für nuIs25 und CGC für C. elegans Stämme. SPK gemacht jsIs609 in Michael Nonett Labor. Wir danken Arpan Agnihotri (BITS Pilani) für seine Hilfe bei Zeitraffer-Aufnahmen von Mitochondrien Transport von jsIs609 Tiere in mikrofluidischen Bauteilen. Wir sind dankbar, dass Dr. Vatsala Thirumalai und Surya Prakash, die uns mit Zebrafischembryonen. Wir danken Herrn Dr. Krishna und CIFF am NCBS für die Nutzung des Spinning Disc konfokalen Mikroskop durch das Department of Science and Technology-Centre for Nanotechnology (No. SR/55/NM-36-2005) unterstützt. Wir danken auch Kaustubh Rau, V. Venkatraman und Chetana Sachidanand für Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der DBT Postdoc-Stipendium (SM), DST Fast-Track-System (SM) und DBT Zuschuss (SPK) finanziert. SA wurde von DST und CSIR Zuschüsse SPK unterstützt.

Ein. SU8 Meister Fabrication <ol><li> Entwerfen Sie die mikrofluidischen Strukturen mit Clewin Software und drucken Sie es mit 65.024 DPI Laser Plotter mit minimalen Strukturgröße von 8 um auf der Leiterplatte Film. </li><li> Reinigen 2 cm X 2 cm Siliciumscheiben mit nativem Oxid in 20% KOH für 1 min und Spülen in deionisiertem Wasser; einem Wafer jeweils für die Strömung Schicht und ihrer entsprechenden Steuerschicht. </li><li> Föhnen Sie die Stücke mit Stickstoffgas und austrocknend auf einer Heizplatte bei 120 ° C für 4 Stunden. Lassen Sie die Teile abkühlen auf Raumtemperatur, bevor Sie den nächsten Schritt. </li><li> Ort Siliciumstücke nacheinander auf der Spinnvorrichtung Spannfutter und Einschalten des Vakuums. Bedecken Sie die Silizium-Oberflächen mit ~ 20 ul Hexamethyldisilazan (HMDS) und überziehen sie mit ein SPIN150 spinner bei 500 rpm für 5 sec, gefolgt von 3.000 rpm für 30 sec. </li><li> Titelbild Silizium-Wafer vollständig mit ~ 1,5 ml SU8-2025 ( <a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm" target="_blank">http://</a>www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) und Mantel Wafer mit SPIN150 spinner bei 500 rpm für 5 sec, gefolgt von 2.000 rpm für 30 sec. Dieses Spinnverfahren Protokoll erzeugt ein Photoresist Dicke von ~ 40 um, die geeignet für die Steuerung und für die frühe Strömungsschichten Larvenstadien C beträgt elegans. </li><li> Spin ~ 1,5 ml SU8-2050 unter Verwendung SPIN150 Schleudereinrichtung bei 500 UpM für 5 sec, gefolgt von 2000 UpM für 30 Sekunden, um eine Photoresist Dicke von ~ 80 um, die sich für Durchfluss Schicht Herstellung ist für späte Larvenstadien von C zu erhalten elegans, basal Flow Schicht für Drosophila / Zebrafischlarven und deren entsprechende Steuerung Schichten. </li><li> Legen Sie die Silizium-Stücke auf heißer Platte mit dem SU8 aufgetragene Schicht an der Spitze. Weichbacken die beschichteten Siliciumstücke bei 65 ° C für 1 min bei 95 ° C für 10 min folgte. Lassen Sie die Teile abkühlen auf Raumtemperatur, bevor Sie den nächsten Schritt. </li><li> Legen Sie die Soft-gebackene Silizium-Stücke auf die Exposition der Bühne mit SU8-2025 beschichteten surFläche auf der Oberseite gegenüber der UV-Lampe. Verwenden der Photomaske mit Design I (L1, 1B) und Design II (L2, 1B) für die Strömung Schicht und Steuerschicht Muster jeweils für frühe Larvenstadien von C. elegans. Legen Sie das Foto-Maske auf der Oberseite des SU8 Schicht und sicherzustellen, dass die Maske ist flach gegen die aufgetragene Schicht. Öffnen Sie den Verschluss der UV-Lampe und setzen die Soft-gebackene SU8 Wafern bis 200 Watt UV-Lampe durch die Photomaske für 15 sec. </li><li> Verwenden Sie die Photomaske mit Design I (L1, 1B) und Design II (L2, 1B) auf SU8-2050 beschichteten Stücke (hergestellt in Schritt 1,6), um den Fluss Schicht und Control Layer für den späten Larvenstadien von C. herzustellen elegans. Verwenden der Photomaske mit dem Motiv I (L1, 1C) und Design II (L2, 1C) für das basale Strömungsschicht und Steuerschicht jeweils für Drosophila / Zebrafischlarven auf Wafern mit SU8-2050 beschichtet (hergestellt in Schritt 1,6). Setzen Sie die SU8 Oberflächen durch das Foto Maske auf die 200 Watt UV-Lampe für 15 Sekunden. </li><li> Legen der freigelegten Siliciumstücke auf einer heißen Platte mit der beschichteten Schicht auf die Oberseite. Stellen die Wafer backen bei 65 ° C für 1 min bei 95 ° C für 10 min folgte. Lassen Sie die Teile abkühlen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt. </li><li> Entwickeln Sie die Stücke mit dem SU8 Entwicklerlösung für 20 min. Spülen Sie die Stücke in Isopropylalkohol (IPA) und Föhnen mit Hilfe von Stickstoff. </li><li> Legen Sie die Silizium-Stücke in einem Exsikkator mit dem SU8 Muster auf. Beschichtung der Stücke mit 50 ul tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl) silan Dampf im Exsikkator für 2 Stunden. </li></ol> Vorsichtsmaßnahmen: Nehmen Sie Sicherheitsvorkehrungen für den Umgang mit Chemikalien in KOH Behandlung Photoresistbeschichtung und Entwicklung. Silan Bedampfung sollte in einem Exsikkator in einem belüfteten Bereich durchgeführt werden. Schützen SU8 aus über Belichtung zu widerstehen. Eine Schutzbrille mit einem UV light Quelle. 2. PDMS Mold Fabrication <ol><li> Bereiten 10.01 PDMS durch die Kombination von 50 g Sylgard 184 Sockel mit 5 g Härter in einem Plastikbecher. Mischen Sie den Inhalt manuell für ca. 3 min. Degas die Mischung in einem Exsikkator auf alle Luftblasen beim Mischen gebildet entfernen. </li><li> Gießen einer 5 mm dicken PDMS-Gemisch in den Siliziumwafer mit SU8 Muster des Designs II, für Steuerschicht, sanft um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Bei Blasen während des Gießens, entgasen PDMS auf der SU8 Muster in geringem Vakuum, um alle Luftblasen zu entfernen gebildet. </li><li> Legen Sie die Silizium-Wafer mit SU8-2025-Muster von Design I, für den Fluss Schicht, auf spinner Spannfutter und schalten Sie das Vakuum, um sie zu halten. Decken die Wafer mit ~ 1 ml PDMS Mischung und Beschichtung der Wafer mit Hilfe SPIN150 Schleudereinrichtung bei 500 UpM für 5 sec, gefolgt von 1500 UpM für 30 sek. </li><li> Mantel ~ 1 ml PDMS Mischung auf Siliziumwafern mit dem 80 um SU8-2050 Muster Motiv I (L1, 1B), für dieFlow-Schicht für den späten Larvenstadien von C. elegans mit der Schleudereinrichtung SPIN150 bei 500 UpM für 5 sec, gefolgt von 1000 UpM für 30 sek. Coat eine dicke Schicht von PDMS-Mix auf den Silizium-Stücke mit SU8-2050 Strömungsmuster Layer-Design I (L1, 1C) für Drosophila / Zebrafischlarven mit SPIN150 spinner bei 500 rpm für 35 sec. </li><li> Bake PDMS beschichteten Silizium Stücke von Design I und Wafer mit entsprechenden Gestaltung II zur Steuerung Schicht PDMS für C. elegans und / oder Drosophila / Zebrafischlarven in einem Heißluft Ofen bei 50 ° C für 6 Stunden. </li><li> Herausschneiden des PDMS Stück aus dem Siliziumsubstrat mit dem Muster SU8 II für C. elegans und / oder Drosophila / Zebrafischlarven mit einer scharfen Klinge. Stanzen ein kleines Loch von ~ 1 mm Durchmesser auf der Oberseite des Reservoirs Verbindung der Haupt-Falle in der PDMS-Form unter Verwendung einer Harris Puncher. </li><li> Legen Sie die gestanzten PDMS-Block (mit der 40 um dicke Form zur SteuerungSchicht L2) auf einer Kunststoffwanne, mit dem geformten Seite der Steuerschicht nach oben weist. Legen Sie die PDMS beschichteten Silizium-Wafer mit der 40 um dicken SU8 Design Ich auf dem gleichen Tablett, mit dem PDMS beschichtete Oberfläche nach oben zeigt. Setzen Sie das Fach in der Kammer von Plasma cleaner und schalten Sie das Vakuum für 2 min. Anschließend auf dem Plasma-Gerät einzuschalten und senken den Kammerdruck, bis die Kammer sich hellrosa Farbe. Setzen beider Oberflächen bis 18 Watt Luftplasma unter niedrigem Vakuum für 2 min. </li><li> Legen Sie die gestanzten PDMS-Block aus den 80 um dicke SU8 Master haltigen Muster II entfernt für den späten Larvenstadien von C. elegans oder Drosophila / Zebrafischlarven auf einer Kunststoffwanne, mit dem geformten Seite der Steuerschicht nach oben weist. Platzieren Sie das entsprechende gebackenen PDMS-Schicht Spin auf dem Silizium-Wafer mit 80 um dicken Entwurf, den ich für eine spätere C. beschichtet elegans Stufen oder Drosophila / Zebrafischlarven gleichzeitig auf dem gleichen Blech mit der flachen PDMS beschichteten surface nach oben. Das gleiche Protokoll oben erwähnt, um sie Luftplasma freizulegen. </li><li> Legen Sie die beiden Plasma-behandelten Oberflächen für C. elegans und / oder Drosophila / Zebrafischlarven gemeinsam mit sanftem Druck und backen sie in Heißluft Ofen bei 50 ° C für 2 Stunden. </li><li> Ausschneiden der verknüpften Geräte aus dem Silizium-Substrat mit SU8 Motiv I für C. elegans und / oder Drosophila / Zebrafisch-Larven. Stempel Zugang Löcher an den Einlass und Auslass des Reservoirs Strömungskanals. </li><li> Legen Sie die gebundene PDMS Schimmel auf einer Plastikschale für C. elegans, mit dem geformten Seite der Strömung Schichtaufbau nach oben weist. Saubere Deckglas (22 x 22 mm, Nr. 1 Dicke) und legen Sie es auf dem gleichen Kunststoff-Fach. Legen Sie das Fach mit PDMS Schimmel und Deckglas innerhalb der Plasmakammer. Freilegen unteren PDMS Oberfläche der Vorrichtung und Deckglas bis 18 Watt Luftplasma bei niedrigem Druck für 2 min. Legen Sie die beiden Plasma-behandelten Flächen mit Gen-tle Druck und backen sie in Heißluft Ofen bei 50 ° C für 2 Stunden. </li><li> Lagern Sie das Gerät in einer sauberen Umwelt für zukünftige Verwendung. </li></ol> 3. Zusätzliche Schritte für Drosophila / Zebrafisch Geräte <ol><li> Freizulegen sauberen Glasoberfläche der Größe 2 cm X 2 cm mit 50 ul tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl) silan Dampf im Exsikkator für 2 Stunden. </li><li> Spin ~ 1 ml 10.01 PDMS Mischung in Schritt 2.1 auf der silanisierten Glasoberfläche unter Verwendung SPIN150 Schleudereinrichtung bei 500 Upm für 35 sec hergestellt. Backen die PDMS beschichteten Glassubstrate in einem Heißluftofen bei 50 ° C für 6 Stunden mit der beschichteten Oberfläche nach oben weist. Lassen Sie die PDMS-Schicht abkühlen auf Raumtemperatur, bevor Sie den nächsten Schritt. </li><li> Stanze die beschichtete Schicht unter Verwendung eines speziell angefertigten scharfe Metallspitze Locher in der Mitte des PDMS, die PDMS Abstandsschicht bilden. Die Form des Metalls Stanzer ausgebildet ist ähnlich der Strömung Design für Drosophila / Zebrafisch (L1, 1C </strong&gt;). </li><li> Freilegen PDMS Abstandsschicht und die einzelne gebundene Block (Strömungsschicht und Control-Schicht, im Schritt 2.9 für Drosophila / Zebrafischlarven gemacht) bis 18 Watt Luftplasma Verwendung von Plasma-Reiniger bei niedrigen Vakuum. Platzieren Sie die zwei Plasma behandelten Oberflächen zusammen und backen sie in einem Heißluftofen bei 50 ° C für 2 Stunden. </li><li> Ausschneiden der verbundenen Gerät aus dem Glas, Stempel Zugang Löcher an den Einlass und Auslass Reservoirs und Bindung an einen Deckglas (22 x 22 mm, Dicke Nr. 1) unter Verwendung eines Plasma-Reiniger nach Schritt 2,11 erwähnt. Dies würde eine Vorrichtung zur Immobilisierung ersten Larvenstadium Drosophila-Larven mit einer Kanalhöhe von ~ 500 um erzeugen. Für Zebrafischlarven, duplizieren Sie die PDMS Abstandsschicht Herstellungsprozess mit einer zusätzlichen Verklebung Schritt. Die Doppelschicht aus PDMS-S produziert eine Kanalhöhe von 900 um für 30 hfp Zebrafisch-Larven. </li></ol> Vorsichtsmaßnahmen: Vermeiden Sie Staub Partikel während der Herstellung der Vorrichtung. Zwei Plasma gereinigte Oberfläches brauchen, um vollständig Staub frei für die richtige Bindung. Bewahren Sie die Geräte in einem Exsikkator in Situationen, in denen eine spezielle Reinraum ist nicht verfügbar, um die Ansammlung von Staubpartikeln in Geräten zu minimieren. 4. Mit PDMS Membrane <ol><li> Das eine Ende eines Mikro-flex (Innendurchmesser ca. 1,6 mm, Außendurchmesser ~ 4,8 mm) zu einem unter Druck stehenden Stickstoff Gaszufuhr Regler und dem anderen Ende mit dem Haupt-Falle Reservoir durch eine 18-Gauge-Nadel (Außendurchmesser ~ 1,25 mm) geklebt, um die Röhre. Ein 3-Wege-Hahn in der Mitte der Rohrverbindung verwendet wird, erlaubt Anwendung oder Freisetzung von Druck auf der Membran. </li><li> Das Rohr wird mit dem PDMS-Gerät mit einer 10 cm Säule von destilliertem Wasser vor dem Anschließen an das Reservoir des Haupt-Falle eines C. elegans und / oder Drosophila / Zebrafischlarven Gerät. </li><li> Schalten des Ventils der Stickstoffversorgung 14 psi gelesen und überwachen die Membran des Haupt-Falle Ablenken Richtung the Strömungskanal bei geringer Vergrößerung eines invertierten Mikroskops. Länge der Wassersäule in der Mikro-flex Rohr zusammengedrückt wird, wenn das 3-Wege-Hahn geöffnet ist. Kanten des abgelenkten Membran sind im Durchlicht sichtbaren (Abbildung 1I und 1J). Membranauslenkung eine Verschiebung von Staubpartikeln / Blasen unter der PDMS-Membran und drückt sie an den Kanal hinweg. </li><li> Warten Sie, bis die Flüssigkeit Frontfills den Mikrokanal ganz ohne Lufteinschlüsse. </li><li> Lassen Sie den Druck mit Hilfe der 3-Wege-Hahn, um die Membran in ihre Ruheposition entspannen. </li></ol> 5. Einsetzen C. elegans, Drosophila und Zebrafisch Larven in das Gerät und Immobilisierung sie unter dem Flexible PDMS Membrane <ol><li> Füllen Sie den Strömungskanal mit M9-Puffer [3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O auf 1 l, mit aut sterilisierenoclaving] für C. elegans 18 oder 1X PBS für Drosophila / Zebrafischlarven 19 für 10 min, bevor ein [8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, 0,24 g KH 2 PO 4, H 2 O auf 1 L, durch Autoklavieren sterilisieren] Experiment. </li><li> Suchen Sie ein einzelnes C. elegans der erforderlichen Stufe auf einem NGM Platte 18 (oder im ersten Larvenstadium Drosophila-Larven aus Agar Ei Platte oder manuell dechorionated 30 hpf Zebrafischlarven in flüssigem Medium 20) mit einer geringen Vergrößerung Stereomikroskop. Pick ein einzelnes Tier mit einem kleinen Volumen der Pufferlösung in eine Mikrospitze. Verwenden Sie ein Mikro-Spitze mit ihrem Ende geschnitten, um die größeren Drosophila oder Zebrafisch-Larven in Puffer unterzubringen. </li><li> Schieben Sie den einzigen Organismus durch den Strömungskanal Einlass. Einstellen der Pipettiervorrichtung Druck, um das einzelne Tier unter dem Haupt-Falle zu positionieren. </li><li> Erhöhen des Drucks des PDMS-Membran langsam, um das Tier gegen die chan positionierennel Grenze und immobilisieren mit 14 psi Druck für C. elegans, 7 psi für Drosophila und 3 psi Zebrafisch-Larven. </li><li> Positionieren des immobilisierten Tier in der Mitte des mikroskopischen Sichtfeld. Verwenden Sie einen umgekehrten Mikroskop bei gewünschten Einstellungen für Hochauflösung Hellfeld-oder Fluoreszenz-Bildgebung. Erwerben Sie Einzel-oder Zeitraffer-Fluoreszenz-Aufnahmen in vordefinierten Frame-Rate. </li><li> Lassen Sie die Trap Druck und Überwachung der Fortbewegung des Tieres für 5-10 min bei niedriger Vergrößerung. </li><li> Spülen Sie das Tier und eine neue Tier die obigen Schritte wiederholen. </li><li> Waschen Sie alle Tiere aus dem Abfallreservoir mit destilliertem Wasser unter Verwendung einer Spritze. Trocknen Sie den Kanal, indem Luft mit einer Spritze für die spätere Wiederverwendung. </li></ol> Vorsichtsmaßnahmen: Tiere, die höhere Pipettieren Druck Strömung innerhalb des Hauptkanals dazu neigen, schlechte Fortbewegung / Gesundheit nach der Entlassung aus der Falle zeigen, und sollte für ima vermieden werdenGing. Reinigen des Strömungskanals für jede Spur von Puffer zu Verstopfung des Kanals durch Kristalle zu verhindern. Wenn Öl für hochauflösende Bildgebung verwendet wird, reinigen Sie das Deckglas in der Lage sein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten für nachfolgende Experimente.

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-related+gene+unc-104+is+required+for+axonal+transport+of+synaptic+vesicles+in+C.+elegans.">Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans.</a> Cell. 65, 837-847 (1991).</li><li>Kumar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104/KIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo.">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).</li><li>Ou, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+cell+migration+in+C.+elegans+Q+neuroblasts.">Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts.</a> J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).</li><li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+bidirectional+mitochondrial+transport+is+coordinated+with+axonal+outgrowth.">The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth.</a> J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).</li><li>Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+imaging+conditions+on+mitochondrial+transport+and+length+in+larval+motor+axons+of+Drosophila.">Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).</li><li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons.">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

PDMS Mikrofluidik-Geräte sind optisch transparent daher kann für hochauflösende in vivo Bildgebung von jedem transparente / transluzente Modellorganismus verwendet werden. Unser Design ist geeignet für hohe Vergrößerung räumlich-zeitliche Darstellung von zellulären und sub-zellulären Ereignissen in intakten lebenden Tieren. Microfabrication mit weichen Lithographie-Techniken ermöglicht eine leichte Handhabung des Gerätes Abmessungen für verschiedene Größen von Modell-Organismen. Geräte in verschi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Silizium-Wafer </td><td> Universität Wafer </td><td> 150 mm (100) Mech Grade SSP Si </td><td></td></tr><tr><td> Clewin Software </td><td> WieWeb Software </td><td> Version 2.90 </td><td></td></tr><tr><td> Laser-Plotter </td><td> Fine Line Imaging </td><td> 65.024 DPI </td><td></td></tr><tr><td> HMDS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 440.191-100ML </td><td></td></tr><tr><td> SU8 </td><td> Microchem </td><td> SU8-2025, SU8-2050 </td><td></td></tr><tr><td> Entwickler </td><td> Microchem </td><td> SU8 Entwickler </td><td></td></tr><tr><td> Silane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448.931-10G </td><td></td></tr><tr><td> PDMS </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> UV-Lampe </td><td> Erker </td><td> 66943 </td><td> 200W Hg Oriel </td></tr><tr><td> Heißluftofen </td><td> Ultra-Instruments </td><td> Maßgeschneiderte </td><td> Stellen Sie bei 50 ° C </td></tr><tr><td> Kochplatte </td><td> IKA Labortechnik </td><td> 3810000 </td><td> <a href="http://www.ika.com" target="_blank">http://www.ika.com</a> </td></tr><tr><td> Plasma cleaner </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td></td></tr><tr><td> Spinner </td><td> Semiconductor Production Systems </td><td> SPIN150-NPP </td><td> <a href="http://www.SPS-Europe.com" target="_blank">www.sps-Europe.com</a> </td></tr><tr><td> Deckglas </td><td> Gold Seal </td><td> 22 X 22 mm, Nr. 1 Dicke </td><td></td></tr><tr><td>C. elegans </td><td> Caenorhabditis Genetics Center (CGC) </td><td> e1265, ayIs4 </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila </td><td> Bloomington </td><td> P {chaGAL4} / cyo, UAS-syt.eGFP </td><td></td></tr><tr><td> Zebrafisch </td><td> Indian Wildtyp </td><td> Wildtyp </td><td></td></tr><tr><td> Tygon Schlauch </td><td> Sigma </td><td> Z279803 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Nadel </td><td> Sigma </td><td> Z118044 </td><td> Cut in 1 cm große Stücke </td></tr><tr><td> 3-Wege-Hahn </td><td> Sigma </td><td> S7521 </td><td></td></tr><tr><td> Harris Puncher </td><td> Sigma </td><td> Z708631 </td><td></td></tr><tr><td> Komprimierte Stickstoffgas </td><td> Örtliche Gasversorger </td><td></td><td> Verwenden Sie einen Regler, um den Druck zu kontrollieren </td></tr><tr><td> Stereo-Mikroskop &lt;/ Td&gt; <td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop </td><td> Andor &amp; Olympus </td><td> Yokogawa drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> National Institutes of Health </td><td> <a href="http://www.rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">www.rsbweb.nih.gov / ij</a> </td><td> Java-basierte Bildverarbeitungs-Programm </td></tr></tbody></table>

simple microfluidic devices for in vivo imaging of c. elegans, drosophila and zebrafish

Micro hergestellt fluidischen Geräten bereitzustellen ein zugängliches Mikroumgebung für in vivo Studien an kleinen Organismen. Einfache Fertigungsprozesse sind für mikrofluidischen Bauteilen mit weichen Lithographietechniken 1-3. Mikrofluidik-Geräte wurden für sub-zellulären Bildgebung 4,5, wurde in vivo Laser-Mikrochirurgie 2,6 und zelluläre Bildgebung 4,7 verwendet. In-vivo-Bildgebung Immobilisierung von Organismen erfordert. Dies wurde erreicht mit Absaugung 5,8, konische Kanäle 6,7,9, verformbaren Membranen 2-4,10, Saug mit zusätzlicher Kühlung 5, Narkosegas 11, Temperatur empfindliche Gele 12, Sekundenkleber 13 und Anästhetika wie Levamisol 14 , 15. Häufig verwendete Anästhetika beeinflussen synaptischen Transmission 16,17 und sind dafür bekannt, schädliche Auswirkungen auf sub-zellulären neuronalen Transport 4 haben. In dieser Rundeudy zeigen wir eine Membran auf Basis von Poly-Dimethyl-Siloxan (PDMS)-Gerät, das Narkosemittel free Immobilisierung intakter genetischen Modellorganismen wie Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila-Larven und Zebrafisch-Larven können. Diese Modellorganismen sind für in-vivo-Studien in mikrofluidischen Vorrichtungen aufgrund ihrer geringen Durchmessern und optisch transparenten oder transluzenten Körper. Körper Durchmesser reichen von ~ 10 um bis ~ 800 um für die frühen Larvenstadien von C. elegans und Zebrafisch-Larven und erfordern mikrofluidischen Bauteilen verschiedener Größen, um eine vollständige Immobilisierung für Hochauflösung Zeitraffer-Aufnahmen zu erzielen. Diese Organismen werden immobilisiert durch Druck mittels komprimierter Stickstoffgas durch eine Flüssigkeitssäule aufgebracht und abgebildet unter Verwendung eines invertierten Mikroskops. Tiere aus der Falle freigegeben normalen Fortbewegung zurück innerhalb von 10 min. Wir zeigen vier Anwendungen von Zeitraffer-Aufnahmen in C. elegansnämlich Bildgebung mitochondrialen Transport in Neuronen, pre-synaptischen Vesikel Transport in einem Transport-Mutante, Glutamat-Rezeptor-Transport-und Q Neuroblast Zellteilung. Daten aus solchen Filmen erhalten zeigen, dass mikrofluidischen Immobilisierung ein nützliches und genaues Mittel zum Erwerb von in vivo-Daten der zellulären und subzellulären Ereignissen wann narkotisierten Tieren (Abb. 1J und 3C-F 4) verglichen wird. Geräteabmessungen wurden verändert, um Zeitraffer-Aufnahmen der verschiedenen Stadien von C. ermöglichen elegans, im ersten Larvenstadium Drosophila-Larven und Zebrafisch-Larven. Transport von Vesikeln mit Synaptotagmin mit GFP (syt.eGFP) in sensorischen Neuronen markiert markiert zeigt gerichtete Bewegung der synaptischen Vesikel Marker in cholinergen sensorischen Neuronen im intakten ersten Larvenstadium Drosophila-Larven ausgedrückt. Eine ähnliche Vorrichtung wurde verwendet, um durchzuführen Zeitraffer-Bildgebung von Herzschlag in ~ 30 Stunden nach der Befruchtung (HPF)Zebrafischlarven. Diese Daten zeigen, dass die einfache Geräte wir entwickelt haben, zu einer Vielzahl von Modellsystemen, mehrere zellbiologische und Entwicklungsstörungen Phänomene in vivo zu untersuchen angewendet werden kann.

Die Immobilisierung Vorrichtung eine Doppelschicht PDMS Block durch Verbinden von zwei Schichten hergestellt: einer Strömung Schicht (Schicht 1) und eine Steuereinheit (Schicht 2), wie in Abbildung 1 gezeigt. Die wichtigste Falle an eine Stickstoffgas Zylinder durch einen Regler und einen 3-Wege-Hahn, notwendige (3-14 psi) Druck auf die Membran durch eine Flüssigkeitssäule (1A) gelten verbunden. Der abgelenkte Membran immobilisiert C. elegans, Drosophila oder Zebrafisch-Larv...

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Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Eine einfache Mikrofluidikvorrichtung wurde entwickelt, um Anästhetikum frei durchführen<em&gt; In vivo</em&gt; Bildgebung<em&gt; C. elegans</em&gt;, Intakten<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Zebrafisch-Larven. Das Gerät verfügt über eine verformbare PDMS-Membran, um diese Modell-Organismen immobilisieren, um Zeitraffer-Imaging zahlreiche Prozesse wie Herzschlag, Zellteilung und sub-zellulären neuronalen Transport durchzuführen. Wir zeigen die Verwendung dieser Vorrichtung und zeigen Beispiele von verschiedenen Arten von Daten aus verschiedenen Modellsystemen gesammelt.

Einfache mikrofluidischen Systemen für<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging der<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Und Zebrafisch

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

simple-microfluidic-devices-for-vivo-imaging-c-elegans-drosophila

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

17.0K Aufrufe.  NCBS-TIFR. Eine einfache Mikrofluidikvorrichtung wurde entwickelt, um Anästhetikum frei durchführen In vivo Bildgebung C. elegans, Intakten Drosophila Larven und Zebrafisch-Larven. Das Gerät verfügt über eine verformbare PDMS-Membran, um diese Modell-Organismen immobilisieren, um Zeitraffer-Imaging zahlreiche Prozesse wie Herzschlag, Zellteilung und sub-zellulären neuronalen Transport durchzuführen. Wir zeigen die Verwendung dieser...

Serie: Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting and counting cells. However, manipulating the cell within the fluidic domain remains a challenge and requires complicated fabrication protocols for forming valves and electrodes, or demands specialty equipment like optical tweezers. Here, we demonstrate that conventional printed circuit boards (PCB) can be used for the non-contact manipulation of cells by employing dielectrophoresis (DEP) for bead and cell manipulation in laminar flow fields for bioactuation, and for cell and bead separation in multichannel microfluidic devices. First, we present the protocol for assembling the DEP electrodes and microfluidic devices, and preparing the cells for DEP. Then, we characterize the DEP operation with polystyrene beads. Lastly, we show representative results of bead and cell separation in a multichannel microfluidic device. In summary, DEP is an effective method for manipulating particles (beads or cells) within microfluidic devices.

Dielectrophoresis (DEP) is an effective method to manipulate cells. Printed circuit boards (PCB) can provide inexpensive, reusable and effective electrodes for contact-free cell manipulation within microfluidic devices. By combining PDMS-based microfluidic channels with coverslips on PCBs, we demonstrate bead and cell manipulation and separation within multichannel microfluidic devices.

Die Trennung Beads und Zellen in Multi-Kanal-Mikrofluidiksysteme Mit Dielektrophorese und Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Forschung

Biotechnik

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Schicht-für-Schicht der Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zum Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electro Studium der Lungenkrebszellen unter Verwendung eines Mehrkanal-Zwei elektrischen Feldes Mikrofluidik-Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Mit Adhesive Patterning 3D Paper Mikrofluidik-Vorrichtungen bauen

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Mehrstufige Höhenverstellbarem Lithografie für Valved Mehrschichtige Mikrofluidiksysteme

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

Herstellung von dreidimensionalen Papierbasis Microfluidic Devices für Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Polydimethylsiloxanhaltigen Polycarbonat Mikrofluidiksysteme für Zellmigrationsstudien unter Perpendicular Chemische und Sauerstoff Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices cannot be worn under everyday conditions. Therefore, textiles are commonly considered the best substrate to accommodate electronic devices in wearable use. In this paper, we describe how to selectively pattern organic electroactive materials on textiles from a solution in an easy and scalable manner. This versatile deposition technique enables the fabrication of wearable organic electronic devices on clothes.

In this paper, we present a protocol to selectively deposit organic materials on textiles, which allows for the direct integration of organic electronic devices with wearables. The fabricated devices can be fully integrated in textiles, respecting their mechanical appearance and enabling sensing capabilities.

Eine einfache und skalierbare Herstellungsverfahren für organische elektronische Vorrichtungen auf Textilien

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...