Wir danken Dr. Krishanu Ray for Drosophila Aktien, Tarjani Agarwal für die Aufrechterhaltung einer Drosophila Käfig, Peter Juo für nuIs25 und CGC für C. elegans Stämme. SPK gemacht jsIs609 in Michael Nonett Labor. Wir danken Arpan Agnihotri (BITS Pilani) für seine Hilfe bei Zeitraffer-Aufnahmen von Mitochondrien Transport von jsIs609 Tiere in mikrofluidischen Bauteilen. Wir sind dankbar, dass Dr. Vatsala Thirumalai und Surya Prakash, die uns mit Zebrafischembryonen. Wir danken Herrn Dr. Krishna und CIFF am NCBS für die Nutzung des Spinning Disc konfokalen Mikroskop durch das Department of Science and Technology-Centre for Nanotechnology (No. SR/55/NM-36-2005) unterstützt. Wir danken auch Kaustubh Rau, V. Venkatraman und Chetana Sachidanand für Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der DBT Postdoc-Stipendium (SM), DST Fast-Track-System (SM) und DBT Zuschuss (SPK) finanziert. SA wurde von DST und CSIR Zuschüsse SPK unterstützt.

Ein. SU8 Meister Fabrication <ol><li> Entwerfen Sie die mikrofluidischen Strukturen mit Clewin Software und drucken Sie es mit 65.024 DPI Laser Plotter mit minimalen Strukturgröße von 8 um auf der Leiterplatte Film. </li><li> Reinigen 2 cm X 2 cm Siliciumscheiben mit nativem Oxid in 20% KOH für 1 min und Spülen in deionisiertem Wasser; einem Wafer jeweils für die Strömung Schicht und ihrer entsprechenden Steuerschicht. </li><li> Föhnen Sie die Stücke mit Stickstoffgas und austrocknend auf einer Heizplatte bei 120 ° C für 4 Stunden. Lassen Sie die Teile abkühlen auf Raumtemperatur, bevor Sie den nächsten Schritt. </li><li> Ort Siliciumstücke nacheinander auf der Spinnvorrichtung Spannfutter und Einschalten des Vakuums. Bedecken Sie die Silizium-Oberflächen mit ~ 20 ul Hexamethyldisilazan (HMDS) und überziehen sie mit ein SPIN150 spinner bei 500 rpm für 5 sec, gefolgt von 3.000 rpm für 30 sec. </li><li> Titelbild Silizium-Wafer vollständig mit ~ 1,5 ml SU8-2025 ( <a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm" target="_blank">http://</a>www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) und Mantel Wafer mit SPIN150 spinner bei 500 rpm für 5 sec, gefolgt von 2.000 rpm für 30 sec. Dieses Spinnverfahren Protokoll erzeugt ein Photoresist Dicke von ~ 40 um, die geeignet für die Steuerung und für die frühe Strömungsschichten Larvenstadien C beträgt elegans. </li><li> Spin ~ 1,5 ml SU8-2050 unter Verwendung SPIN150 Schleudereinrichtung bei 500 UpM für 5 sec, gefolgt von 2000 UpM für 30 Sekunden, um eine Photoresist Dicke von ~ 80 um, die sich für Durchfluss Schicht Herstellung ist für späte Larvenstadien von C zu erhalten elegans, basal Flow Schicht für Drosophila / Zebrafischlarven und deren entsprechende Steuerung Schichten. </li><li> Legen Sie die Silizium-Stücke auf heißer Platte mit dem SU8 aufgetragene Schicht an der Spitze. Weichbacken die beschichteten Siliciumstücke bei 65 ° C für 1 min bei 95 ° C für 10 min folgte. Lassen Sie die Teile abkühlen auf Raumtemperatur, bevor Sie den nächsten Schritt. </li><li> Legen Sie die Soft-gebackene Silizium-Stücke auf die Exposition der Bühne mit SU8-2025 beschichteten surFläche auf der Oberseite gegenüber der UV-Lampe. Verwenden der Photomaske mit Design I (L1, 1B) und Design II (L2, 1B) für die Strömung Schicht und Steuerschicht Muster jeweils für frühe Larvenstadien von C. elegans. Legen Sie das Foto-Maske auf der Oberseite des SU8 Schicht und sicherzustellen, dass die Maske ist flach gegen die aufgetragene Schicht. Öffnen Sie den Verschluss der UV-Lampe und setzen die Soft-gebackene SU8 Wafern bis 200 Watt UV-Lampe durch die Photomaske für 15 sec. </li><li> Verwenden Sie die Photomaske mit Design I (L1, 1B) und Design II (L2, 1B) auf SU8-2050 beschichteten Stücke (hergestellt in Schritt 1,6), um den Fluss Schicht und Control Layer für den späten Larvenstadien von C. herzustellen elegans. Verwenden der Photomaske mit dem Motiv I (L1, 1C) und Design II (L2, 1C) für das basale Strömungsschicht und Steuerschicht jeweils für Drosophila / Zebrafischlarven auf Wafern mit SU8-2050 beschichtet (hergestellt in Schritt 1,6). Setzen Sie die SU8 Oberflächen durch das Foto Maske auf die 200 Watt UV-Lampe für 15 Sekunden. </li><li> Legen der freigelegten Siliciumstücke auf einer heißen Platte mit der beschichteten Schicht auf die Oberseite. Stellen die Wafer backen bei 65 ° C für 1 min bei 95 ° C für 10 min folgte. Lassen Sie die Teile abkühlen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt. </li><li> Entwickeln Sie die Stücke mit dem SU8 Entwicklerlösung für 20 min. Spülen Sie die Stücke in Isopropylalkohol (IPA) und Föhnen mit Hilfe von Stickstoff. </li><li> Legen Sie die Silizium-Stücke in einem Exsikkator mit dem SU8 Muster auf. Beschichtung der Stücke mit 50 ul tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl) silan Dampf im Exsikkator für 2 Stunden. </li></ol> Vorsichtsmaßnahmen: Nehmen Sie Sicherheitsvorkehrungen für den Umgang mit Chemikalien in KOH Behandlung Photoresistbeschichtung und Entwicklung. Silan Bedampfung sollte in einem Exsikkator in einem belüfteten Bereich durchgeführt werden. Schützen SU8 aus über Belichtung zu widerstehen. Eine Schutzbrille mit einem UV light Quelle. 2. PDMS Mold Fabrication <ol><li> Bereiten 10.01 PDMS durch die Kombination von 50 g Sylgard 184 Sockel mit 5 g Härter in einem Plastikbecher. Mischen Sie den Inhalt manuell für ca. 3 min. Degas die Mischung in einem Exsikkator auf alle Luftblasen beim Mischen gebildet entfernen. </li><li> Gießen einer 5 mm dicken PDMS-Gemisch in den Siliziumwafer mit SU8 Muster des Designs II, für Steuerschicht, sanft um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Bei Blasen während des Gießens, entgasen PDMS auf der SU8 Muster in geringem Vakuum, um alle Luftblasen zu entfernen gebildet. </li><li> Legen Sie die Silizium-Wafer mit SU8-2025-Muster von Design I, für den Fluss Schicht, auf spinner Spannfutter und schalten Sie das Vakuum, um sie zu halten. Decken die Wafer mit ~ 1 ml PDMS Mischung und Beschichtung der Wafer mit Hilfe SPIN150 Schleudereinrichtung bei 500 UpM für 5 sec, gefolgt von 1500 UpM für 30 sek. </li><li> Mantel ~ 1 ml PDMS Mischung auf Siliziumwafern mit dem 80 um SU8-2050 Muster Motiv I (L1, 1B), für dieFlow-Schicht für den späten Larvenstadien von C. elegans mit der Schleudereinrichtung SPIN150 bei 500 UpM für 5 sec, gefolgt von 1000 UpM für 30 sek. Coat eine dicke Schicht von PDMS-Mix auf den Silizium-Stücke mit SU8-2050 Strömungsmuster Layer-Design I (L1, 1C) für Drosophila / Zebrafischlarven mit SPIN150 spinner bei 500 rpm für 35 sec. </li><li> Bake PDMS beschichteten Silizium Stücke von Design I und Wafer mit entsprechenden Gestaltung II zur Steuerung Schicht PDMS für C. elegans und / oder Drosophila / Zebrafischlarven in einem Heißluft Ofen bei 50 ° C für 6 Stunden. </li><li> Herausschneiden des PDMS Stück aus dem Siliziumsubstrat mit dem Muster SU8 II für C. elegans und / oder Drosophila / Zebrafischlarven mit einer scharfen Klinge. Stanzen ein kleines Loch von ~ 1 mm Durchmesser auf der Oberseite des Reservoirs Verbindung der Haupt-Falle in der PDMS-Form unter Verwendung einer Harris Puncher. </li><li> Legen Sie die gestanzten PDMS-Block (mit der 40 um dicke Form zur SteuerungSchicht L2) auf einer Kunststoffwanne, mit dem geformten Seite der Steuerschicht nach oben weist. Legen Sie die PDMS beschichteten Silizium-Wafer mit der 40 um dicken SU8 Design Ich auf dem gleichen Tablett, mit dem PDMS beschichtete Oberfläche nach oben zeigt. Setzen Sie das Fach in der Kammer von Plasma cleaner und schalten Sie das Vakuum für 2 min. Anschließend auf dem Plasma-Gerät einzuschalten und senken den Kammerdruck, bis die Kammer sich hellrosa Farbe. Setzen beider Oberflächen bis 18 Watt Luftplasma unter niedrigem Vakuum für 2 min. </li><li> Legen Sie die gestanzten PDMS-Block aus den 80 um dicke SU8 Master haltigen Muster II entfernt für den späten Larvenstadien von C. elegans oder Drosophila / Zebrafischlarven auf einer Kunststoffwanne, mit dem geformten Seite der Steuerschicht nach oben weist. Platzieren Sie das entsprechende gebackenen PDMS-Schicht Spin auf dem Silizium-Wafer mit 80 um dicken Entwurf, den ich für eine spätere C. beschichtet elegans Stufen oder Drosophila / Zebrafischlarven gleichzeitig auf dem gleichen Blech mit der flachen PDMS beschichteten surface nach oben. Das gleiche Protokoll oben erwähnt, um sie Luftplasma freizulegen. </li><li> Legen Sie die beiden Plasma-behandelten Oberflächen für C. elegans und / oder Drosophila / Zebrafischlarven gemeinsam mit sanftem Druck und backen sie in Heißluft Ofen bei 50 ° C für 2 Stunden. </li><li> Ausschneiden der verknüpften Geräte aus dem Silizium-Substrat mit SU8 Motiv I für C. elegans und / oder Drosophila / Zebrafisch-Larven. Stempel Zugang Löcher an den Einlass und Auslass des Reservoirs Strömungskanals. </li><li> Legen Sie die gebundene PDMS Schimmel auf einer Plastikschale für C. elegans, mit dem geformten Seite der Strömung Schichtaufbau nach oben weist. Saubere Deckglas (22 x 22 mm, Nr. 1 Dicke) und legen Sie es auf dem gleichen Kunststoff-Fach. Legen Sie das Fach mit PDMS Schimmel und Deckglas innerhalb der Plasmakammer. Freilegen unteren PDMS Oberfläche der Vorrichtung und Deckglas bis 18 Watt Luftplasma bei niedrigem Druck für 2 min. Legen Sie die beiden Plasma-behandelten Flächen mit Gen-tle Druck und backen sie in Heißluft Ofen bei 50 ° C für 2 Stunden. </li><li> Lagern Sie das Gerät in einer sauberen Umwelt für zukünftige Verwendung. </li></ol> 3. Zusätzliche Schritte für Drosophila / Zebrafisch Geräte <ol><li> Freizulegen sauberen Glasoberfläche der Größe 2 cm X 2 cm mit 50 ul tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl) silan Dampf im Exsikkator für 2 Stunden. </li><li> Spin ~ 1 ml 10.01 PDMS Mischung in Schritt 2.1 auf der silanisierten Glasoberfläche unter Verwendung SPIN150 Schleudereinrichtung bei 500 Upm für 35 sec hergestellt. Backen die PDMS beschichteten Glassubstrate in einem Heißluftofen bei 50 ° C für 6 Stunden mit der beschichteten Oberfläche nach oben weist. Lassen Sie die PDMS-Schicht abkühlen auf Raumtemperatur, bevor Sie den nächsten Schritt. </li><li> Stanze die beschichtete Schicht unter Verwendung eines speziell angefertigten scharfe Metallspitze Locher in der Mitte des PDMS, die PDMS Abstandsschicht bilden. Die Form des Metalls Stanzer ausgebildet ist ähnlich der Strömung Design für Drosophila / Zebrafisch (L1, 1C </strong&gt;). </li><li> Freilegen PDMS Abstandsschicht und die einzelne gebundene Block (Strömungsschicht und Control-Schicht, im Schritt 2.9 für Drosophila / Zebrafischlarven gemacht) bis 18 Watt Luftplasma Verwendung von Plasma-Reiniger bei niedrigen Vakuum. Platzieren Sie die zwei Plasma behandelten Oberflächen zusammen und backen sie in einem Heißluftofen bei 50 ° C für 2 Stunden. </li><li> Ausschneiden der verbundenen Gerät aus dem Glas, Stempel Zugang Löcher an den Einlass und Auslass Reservoirs und Bindung an einen Deckglas (22 x 22 mm, Dicke Nr. 1) unter Verwendung eines Plasma-Reiniger nach Schritt 2,11 erwähnt. Dies würde eine Vorrichtung zur Immobilisierung ersten Larvenstadium Drosophila-Larven mit einer Kanalhöhe von ~ 500 um erzeugen. Für Zebrafischlarven, duplizieren Sie die PDMS Abstandsschicht Herstellungsprozess mit einer zusätzlichen Verklebung Schritt. Die Doppelschicht aus PDMS-S produziert eine Kanalhöhe von 900 um für 30 hfp Zebrafisch-Larven. </li></ol> Vorsichtsmaßnahmen: Vermeiden Sie Staub Partikel während der Herstellung der Vorrichtung. Zwei Plasma gereinigte Oberfläches brauchen, um vollständig Staub frei für die richtige Bindung. Bewahren Sie die Geräte in einem Exsikkator in Situationen, in denen eine spezielle Reinraum ist nicht verfügbar, um die Ansammlung von Staubpartikeln in Geräten zu minimieren. 4. Mit PDMS Membrane <ol><li> Das eine Ende eines Mikro-flex (Innendurchmesser ca. 1,6 mm, Außendurchmesser ~ 4,8 mm) zu einem unter Druck stehenden Stickstoff Gaszufuhr Regler und dem anderen Ende mit dem Haupt-Falle Reservoir durch eine 18-Gauge-Nadel (Außendurchmesser ~ 1,25 mm) geklebt, um die Röhre. Ein 3-Wege-Hahn in der Mitte der Rohrverbindung verwendet wird, erlaubt Anwendung oder Freisetzung von Druck auf der Membran. </li><li> Das Rohr wird mit dem PDMS-Gerät mit einer 10 cm Säule von destilliertem Wasser vor dem Anschließen an das Reservoir des Haupt-Falle eines C. elegans und / oder Drosophila / Zebrafischlarven Gerät. </li><li> Schalten des Ventils der Stickstoffversorgung 14 psi gelesen und überwachen die Membran des Haupt-Falle Ablenken Richtung the Strömungskanal bei geringer Vergrößerung eines invertierten Mikroskops. Länge der Wassersäule in der Mikro-flex Rohr zusammengedrückt wird, wenn das 3-Wege-Hahn geöffnet ist. Kanten des abgelenkten Membran sind im Durchlicht sichtbaren (Abbildung 1I und 1J). Membranauslenkung eine Verschiebung von Staubpartikeln / Blasen unter der PDMS-Membran und drückt sie an den Kanal hinweg. </li><li> Warten Sie, bis die Flüssigkeit Frontfills den Mikrokanal ganz ohne Lufteinschlüsse. </li><li> Lassen Sie den Druck mit Hilfe der 3-Wege-Hahn, um die Membran in ihre Ruheposition entspannen. </li></ol> 5. Einsetzen C. elegans, Drosophila und Zebrafisch Larven in das Gerät und Immobilisierung sie unter dem Flexible PDMS Membrane <ol><li> Füllen Sie den Strömungskanal mit M9-Puffer [3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O auf 1 l, mit aut sterilisierenoclaving] für C. elegans 18 oder 1X PBS für Drosophila / Zebrafischlarven 19 für 10 min, bevor ein [8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, 0,24 g KH 2 PO 4, H 2 O auf 1 L, durch Autoklavieren sterilisieren] Experiment. </li><li> Suchen Sie ein einzelnes C. elegans der erforderlichen Stufe auf einem NGM Platte 18 (oder im ersten Larvenstadium Drosophila-Larven aus Agar Ei Platte oder manuell dechorionated 30 hpf Zebrafischlarven in flüssigem Medium 20) mit einer geringen Vergrößerung Stereomikroskop. Pick ein einzelnes Tier mit einem kleinen Volumen der Pufferlösung in eine Mikrospitze. Verwenden Sie ein Mikro-Spitze mit ihrem Ende geschnitten, um die größeren Drosophila oder Zebrafisch-Larven in Puffer unterzubringen. </li><li> Schieben Sie den einzigen Organismus durch den Strömungskanal Einlass. Einstellen der Pipettiervorrichtung Druck, um das einzelne Tier unter dem Haupt-Falle zu positionieren. </li><li> Erhöhen des Drucks des PDMS-Membran langsam, um das Tier gegen die chan positionierennel Grenze und immobilisieren mit 14 psi Druck für C. elegans, 7 psi für Drosophila und 3 psi Zebrafisch-Larven. </li><li> Positionieren des immobilisierten Tier in der Mitte des mikroskopischen Sichtfeld. Verwenden Sie einen umgekehrten Mikroskop bei gewünschten Einstellungen für Hochauflösung Hellfeld-oder Fluoreszenz-Bildgebung. Erwerben Sie Einzel-oder Zeitraffer-Fluoreszenz-Aufnahmen in vordefinierten Frame-Rate. </li><li> Lassen Sie die Trap Druck und Überwachung der Fortbewegung des Tieres für 5-10 min bei niedriger Vergrößerung. </li><li> Spülen Sie das Tier und eine neue Tier die obigen Schritte wiederholen. </li><li> Waschen Sie alle Tiere aus dem Abfallreservoir mit destilliertem Wasser unter Verwendung einer Spritze. Trocknen Sie den Kanal, indem Luft mit einer Spritze für die spätere Wiederverwendung. </li></ol> Vorsichtsmaßnahmen: Tiere, die höhere Pipettieren Druck Strömung innerhalb des Hauptkanals dazu neigen, schlechte Fortbewegung / Gesundheit nach der Entlassung aus der Falle zeigen, und sollte für ima vermieden werdenGing. Reinigen des Strömungskanals für jede Spur von Puffer zu Verstopfung des Kanals durch Kristalle zu verhindern. Wenn Öl für hochauflösende Bildgebung verwendet wird, reinigen Sie das Deckglas in der Lage sein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten für nachfolgende Experimente.

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-related+gene+unc-104+is+required+for+axonal+transport+of+synaptic+vesicles+in+C.+elegans.">Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans.</a> Cell. 65, 837-847 (1991).</li><li>Kumar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104/KIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo.">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).</li><li>Ou, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+cell+migration+in+C.+elegans+Q+neuroblasts.">Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts.</a> J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).</li><li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+bidirectional+mitochondrial+transport+is+coordinated+with+axonal+outgrowth.">The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth.</a> J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).</li><li>Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+imaging+conditions+on+mitochondrial+transport+and+length+in+larval+motor+axons+of+Drosophila.">Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).</li><li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons.">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

PDMS Mikrofluidik-Geräte sind optisch transparent daher kann für hochauflösende in vivo Bildgebung von jedem transparente / transluzente Modellorganismus verwendet werden. Unser Design ist geeignet für hohe Vergrößerung räumlich-zeitliche Darstellung von zellulären und sub-zellulären Ereignissen in intakten lebenden Tieren. Microfabrication mit weichen Lithographie-Techniken ermöglicht eine leichte Handhabung des Gerätes Abmessungen für verschiedene Größen von Modell-Organismen. Geräte in verschi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Silizium-Wafer </td><td> Universität Wafer </td><td> 150 mm (100) Mech Grade SSP Si </td><td></td></tr><tr><td> Clewin Software </td><td> WieWeb Software </td><td> Version 2.90 </td><td></td></tr><tr><td> Laser-Plotter </td><td> Fine Line Imaging </td><td> 65.024 DPI </td><td></td></tr><tr><td> HMDS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 440.191-100ML </td><td></td></tr><tr><td> SU8 </td><td> Microchem </td><td> SU8-2025, SU8-2050 </td><td></td></tr><tr><td> Entwickler </td><td> Microchem </td><td> SU8 Entwickler </td><td></td></tr><tr><td> Silane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448.931-10G </td><td></td></tr><tr><td> PDMS </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> UV-Lampe </td><td> Erker </td><td> 66943 </td><td> 200W Hg Oriel </td></tr><tr><td> Heißluftofen </td><td> Ultra-Instruments </td><td> Maßgeschneiderte </td><td> Stellen Sie bei 50 ° C </td></tr><tr><td> Kochplatte </td><td> IKA Labortechnik </td><td> 3810000 </td><td> <a href="http://www.ika.com" target="_blank">http://www.ika.com</a> </td></tr><tr><td> Plasma cleaner </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td></td></tr><tr><td> Spinner </td><td> Semiconductor Production Systems </td><td> SPIN150-NPP </td><td> <a href="http://www.SPS-Europe.com" target="_blank">www.sps-Europe.com</a> </td></tr><tr><td> Deckglas </td><td> Gold Seal </td><td> 22 X 22 mm, Nr. 1 Dicke </td><td></td></tr><tr><td>C. elegans </td><td> Caenorhabditis Genetics Center (CGC) </td><td> e1265, ayIs4 </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila </td><td> Bloomington </td><td> P {chaGAL4} / cyo, UAS-syt.eGFP </td><td></td></tr><tr><td> Zebrafisch </td><td> Indian Wildtyp </td><td> Wildtyp </td><td></td></tr><tr><td> Tygon Schlauch </td><td> Sigma </td><td> Z279803 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Nadel </td><td> Sigma </td><td> Z118044 </td><td> Cut in 1 cm große Stücke </td></tr><tr><td> 3-Wege-Hahn </td><td> Sigma </td><td> S7521 </td><td></td></tr><tr><td> Harris Puncher </td><td> Sigma </td><td> Z708631 </td><td></td></tr><tr><td> Komprimierte Stickstoffgas </td><td> Örtliche Gasversorger </td><td></td><td> Verwenden Sie einen Regler, um den Druck zu kontrollieren </td></tr><tr><td> Stereo-Mikroskop &lt;/ Td&gt; <td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop </td><td> Andor &amp; Olympus </td><td> Yokogawa drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> National Institutes of Health </td><td> <a href="http://www.rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">www.rsbweb.nih.gov / ij</a> </td><td> Java-basierte Bildverarbeitungs-Programm </td></tr></tbody></table>

simple microfluidic devices for in vivo imaging of c. elegans, drosophila and zebrafish

Micro hergestellt fluidischen Geräten bereitzustellen ein zugängliches Mikroumgebung für in vivo Studien an kleinen Organismen. Einfache Fertigungsprozesse sind für mikrofluidischen Bauteilen mit weichen Lithographietechniken 1-3. Mikrofluidik-Geräte wurden für sub-zellulären Bildgebung 4,5, wurde in vivo Laser-Mikrochirurgie 2,6 und zelluläre Bildgebung 4,7 verwendet. In-vivo-Bildgebung Immobilisierung von Organismen erfordert. Dies wurde erreicht mit Absaugung 5,8, konische Kanäle 6,7,9, verformbaren Membranen 2-4,10, Saug mit zusätzlicher Kühlung 5, Narkosegas 11, Temperatur empfindliche Gele 12, Sekundenkleber 13 und Anästhetika wie Levamisol 14 , 15. Häufig verwendete Anästhetika beeinflussen synaptischen Transmission 16,17 und sind dafür bekannt, schädliche Auswirkungen auf sub-zellulären neuronalen Transport 4 haben. In dieser Rundeudy zeigen wir eine Membran auf Basis von Poly-Dimethyl-Siloxan (PDMS)-Gerät, das Narkosemittel free Immobilisierung intakter genetischen Modellorganismen wie Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila-Larven und Zebrafisch-Larven können. Diese Modellorganismen sind für in-vivo-Studien in mikrofluidischen Vorrichtungen aufgrund ihrer geringen Durchmessern und optisch transparenten oder transluzenten Körper. Körper Durchmesser reichen von ~ 10 um bis ~ 800 um für die frühen Larvenstadien von C. elegans und Zebrafisch-Larven und erfordern mikrofluidischen Bauteilen verschiedener Größen, um eine vollständige Immobilisierung für Hochauflösung Zeitraffer-Aufnahmen zu erzielen. Diese Organismen werden immobilisiert durch Druck mittels komprimierter Stickstoffgas durch eine Flüssigkeitssäule aufgebracht und abgebildet unter Verwendung eines invertierten Mikroskops. Tiere aus der Falle freigegeben normalen Fortbewegung zurück innerhalb von 10 min. Wir zeigen vier Anwendungen von Zeitraffer-Aufnahmen in C. elegansnämlich Bildgebung mitochondrialen Transport in Neuronen, pre-synaptischen Vesikel Transport in einem Transport-Mutante, Glutamat-Rezeptor-Transport-und Q Neuroblast Zellteilung. Daten aus solchen Filmen erhalten zeigen, dass mikrofluidischen Immobilisierung ein nützliches und genaues Mittel zum Erwerb von in vivo-Daten der zellulären und subzellulären Ereignissen wann narkotisierten Tieren (Abb. 1J und 3C-F 4) verglichen wird. Geräteabmessungen wurden verändert, um Zeitraffer-Aufnahmen der verschiedenen Stadien von C. ermöglichen elegans, im ersten Larvenstadium Drosophila-Larven und Zebrafisch-Larven. Transport von Vesikeln mit Synaptotagmin mit GFP (syt.eGFP) in sensorischen Neuronen markiert markiert zeigt gerichtete Bewegung der synaptischen Vesikel Marker in cholinergen sensorischen Neuronen im intakten ersten Larvenstadium Drosophila-Larven ausgedrückt. Eine ähnliche Vorrichtung wurde verwendet, um durchzuführen Zeitraffer-Bildgebung von Herzschlag in ~ 30 Stunden nach der Befruchtung (HPF)Zebrafischlarven. Diese Daten zeigen, dass die einfache Geräte wir entwickelt haben, zu einer Vielzahl von Modellsystemen, mehrere zellbiologische und Entwicklungsstörungen Phänomene in vivo zu untersuchen angewendet werden kann.

Die Immobilisierung Vorrichtung eine Doppelschicht PDMS Block durch Verbinden von zwei Schichten hergestellt: einer Strömung Schicht (Schicht 1) und eine Steuereinheit (Schicht 2), wie in Abbildung 1 gezeigt. Die wichtigste Falle an eine Stickstoffgas Zylinder durch einen Regler und einen 3-Wege-Hahn, notwendige (3-14 psi) Druck auf die Membran durch eine Flüssigkeitssäule (1A) gelten verbunden. Der abgelenkte Membran immobilisiert C. elegans, Drosophila oder Zebrafisch-Larv...

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Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Eine einfache Mikrofluidikvorrichtung wurde entwickelt, um Anästhetikum frei durchführen<em&gt; In vivo</em&gt; Bildgebung<em&gt; C. elegans</em&gt;, Intakten<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Zebrafisch-Larven. Das Gerät verfügt über eine verformbare PDMS-Membran, um diese Modell-Organismen immobilisieren, um Zeitraffer-Imaging zahlreiche Prozesse wie Herzschlag, Zellteilung und sub-zellulären neuronalen Transport durchzuführen. Wir zeigen die Verwendung dieser Vorrichtung und zeigen Beispiele von verschiedenen Arten von Daten aus verschiedenen Modellsystemen gesammelt.

Einfache mikrofluidischen Systemen für<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging der<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Und Zebrafisch

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

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Bioengineering

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

17.0K Aufrufe.  NCBS-TIFR. Eine einfache Mikrofluidikvorrichtung wurde entwickelt, um Anästhetikum frei durchführen In vivo Bildgebung C. elegans, Intakten Drosophila Larven und Zebrafisch-Larven. Das Gerät verfügt über eine verformbare PDMS-Membran, um diese Modell-Organismen immobilisieren, um Zeitraffer-Imaging zahlreiche Prozesse wie Herzschlag, Zellteilung und sub-zellulären neuronalen Transport durchzuführen. Wir zeigen die Verwendung dieser...