Forschung von der NSF Auszeichnung MCB-1021384 gefördert.

1. Vorbereitung der anaeroben Buffer <ol><li> Planen 1 l 100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5. Gießen 250 ml des Puffers in einen 500 ml Büchner-Kolben mit einem Rührstab. </li><li> Der Kolben wird mit einem Gummistopfen und legen Sie es auf einer Rührplatte. Den kurzen Schlauch von der Flasche in ein Schlenk-Linie. </li><li> Degas der Puffer unter Vakuum für 5 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren. Während dieser Zeit, führen 5 aufeinander folgenden Runden von Vakuumentgasung und Spülen mit Argon jede Stunde. </li><li> Spülen Sie den Kolben mit Argon für 10 Sekunden und trennen Sie ihn von der Vakuumkammer. Der Kolben wird im Handschuhfach. </li><li> Lassen Sie die Flasche offen im Handschuhfach über Nacht unter kräftigem Rühren. </li></ol> 2. Entfernung von Sauerstoff aus der Stopped-Flow-System <ol><li> Planen 1 l 0,1 M Natriumacetat, pH 5,0. Gießen Sie 125 ml dieses Puffers in einen 250-ml-Büchner-Kolben und führen Sie die Schritte von 1,2 bis 1,4. </li><li> Abwiegen 5mg Glucoseoxidase aus Aspergillus niger (181.300 U / g) und 0,9 g Glukose mit einem 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen und 50 ml Falcon konischen Rohr, jeweils. Legen Sie beide Behälter in das Handschuhfach. </li><li> Man löst Glucoseoxidase und Glucose in 50 ml anaeroben 0,1 M Natriumacetat, pH 5,0 (Endkonzentrationen von 18,13 U / ml und 100 mM). Füllen Sie den Behälter Spritzen mit dieser Lösung (Abbildung 1). </li><li> Damit der Antrieb Ventile in der &quot;Load&quot;-Position stehen und füllt das Laufwerk Spritzen (Abbildung 1). Drehen Sie das Ventil auf die F &quot;Drive&quot;-Position. Leeren Sie den Stop-Spritze, indem Sie auf Leere in der Pro-Data Control Software. Schieben Sie den Puffer von Laufwerk F Spritze durch die Strömung Schaltung manuell durch Anheben des entsprechenden Laufwerks-RAM. Wiederholen Sie diesen Schritt zehnmal insgesamt. Gehen Sie ebenso mit den anderen drei Spritzen-Laufwerk. Eine Stunde warten. </li><li> Ersetzen der Lösung des Reservoirs Spritzen mit dem gleichen Puffer ContaiNing Glucoseoxidase und Glucose. Wiederholen Sie den Schritt 2.4. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2,5 und lassen Sie die Lösung in der Flow-System über Nacht stehen. </li><li> Nach Inkubation über Nacht Schrittwiederholung 2.5. </li></ol> 3. Vorbereitung von Sauerstoff gesättigt Buffer <ol><li> Es werden 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) und gießen Sie 50 ml in einem 50-ml-Fläschchen mit einem Rührstab. Verschließe das Röhrchen mit einem Stopfen und einem Wheaton Wheaton Aluminium-Dichtung. </li><li> Stellen Sie die Durchstechflasche auf dem Eis. Tauchen mit einer langen Nadel verbunden ist, um einen Behälter mit 100% Sauerstoff in die Lösung. Legen Sie eine andere kurze Nadel durch den Stopfen der Durchstechflasche als Belüftung. </li><li> Dicke die Lösung mit 100% Sauerstoff für 1 Stunde unter Rühren. </li><li> Entfernen Sie zuerst die kurze Nadel aus der Flasche und 10 Sekunden warten, bevor Sie die lange Nadel. Legen Sie die geschlossene Flasche im Handschuhfach. </li></ol> 4. Herstellung von NADPH Lösung <ol><li> Abwiegen 1 mg NADPH in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und setzen it in das Handschuhfach. </li><li> Lösen Sie die NADPH in 300 ul anaerobe 100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5. Entfernen Sie 30 ul dieser Lösung aus dem Handschuhfach, um die NADPH-Konzentration mit einem Spektralphotometer (340 nm ε = 6270 M -1 cm -1) zu bestimmen. </li></ol> 5. Entfernung von Sauerstoff aus der Enzymlösung <ol><li> Nehmen Sie 400 ul Enzym-Stammlösung aus dem Gefrierschrank und tauen im Handschuhfach. Das Enzym Stammlösung (360 pM) wurde zuvor in 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5), enthaltend 100 mM NaCl, und in flüssigem Stickstoff eingefroren. </li><li> Übertragen Sie die Enzymlösung in einem 25-ml-Fläschchen mit einem Rührstab, verschließe das Röhrchen mit einem Stopfen und einem Wheaton Wheaton Aluminium-Siegel und aus dem Handschuhfach. </li><li> Dazu Küvette auf Eis und verbinden Sie es mit einem Schlenk-Linie durch Einführen einer Nadel durch den Stopfen der Durchstechflasche. </li><li> Degas die Enzymlösung durch Ausführen 5 aufeinander folgenden Runden vonVakuumentgasung und mit Argon gespült alle 20 Minuten für 1 Stunde. </li><li> Spülen Sie das Fläschchen mit Argon für 10 Sekunden und trennen Sie ihn von der Vakuumkammer. Dazu Küvette auf Eis im Handschuhfach. </li></ol> 6. Reduktive Half-Reaktion: Überwachung Flavin Reduction <ol><li> Bereiten Sie die Stopped-Flow-Instrument und die Pro-Data Control Software für Einzel-Mischen-Modus nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Schalten einem zirkulierenden Wasserbad (15 ° C). Entfernen von Sauerstoff aus dem Wasser durch Einleiten von Stickstoff durch sie für 20 Minuten. Dies verhindert die Kontamination durch die Sauerstoff-Flow-Schaltung. </li><li> Daß die Temperatur der Antrieb Spritzen und die Beobachtung Zelle bei 15 ° C durch Verbinden des Wasserbad Gehäuse des Stopped-Flow der zirkulierenden Bad. </li><li> In der Systemsteuerung des Pro-Data-Software wählen Photodiodenarray Externer Trigger (für Stopped-Flow-Betrieb zu aktivieren), und LogaritHMIC Skala. </li><li> Starten Sie das Pro-Data-Viewer-Software und das Verzeichnis an, wo die Daten gespeichert werden sollen. </li><li> Ersetzen der Lösung des Reservoirs Spritzen C und F mit anaeroben 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5). Drehen Sie den C-und F-Ventile an den &quot;Drive&quot;-Position. Leeren Sie den Stop-Spritze, indem Sie in der Pro-Data Control Software Leere. Schieben Sie das Laufwerk Puffer von beiden Spritzen durch die Strömung Schaltung manuell durch Anheben des entsprechenden Antriebs-ram insgesamt fünfmal (klicken Sie vor jeder Bewegung des Stempels Leer). </li><li> Um sicherzustellen, dass Glucose-Oxidase wurde vollständig aus dem Strömungskreislauf entfernt, führen Sie Schritt 6,6 insgesamt viermal. </li><li> Klicken Sie auf Baseline in der Pro-Data Control Software. </li><li> Mischen Sie 100 ul Enzym-Stammlösung mit 1100 uL anaerobe 100 mM Kaliumphosphatpuffer (Endkonzentration nach dem Vermischen in der Stopped-Flow von 15 uM). </li><li> Ersetzen Sie die Lösung von Reservoir syringe F mit der Enzymlösung. Drehen Sie das Ventil auf die F &quot;Drive&quot;-Position. Leeren Sie den Stop-Spritze, indem Sie in der Pro-Data Control Software Leere. Schieben Sie das Laufwerk aus Enzymlösung F Spritze durch die Strömung Schaltung manuell durch Anheben des entsprechenden Antriebs-RAM. Führen Sie diesen insgesamt dreimal. In der Pro-Data-Software, stellen Sie die Aufnahmezeit bis 60 s. </li><li> Sicherstellen, dass beide Laufwerk Spritzen mit den jeweiligen Lösungen und dem Antrieb Stößel gefüllt sind in Kontakt mit den Antriebs Spritzenkolben. Drehen Sie beide Ventile an den &quot;Drive&quot;-Position und klicken Sie in der Pro-Data Control Software erwerben, um das Laufwerk durchzuführen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal, um die Daten in dreifacher Ausfertigung zu erhalten. Dies ergibt Spektren der oxidierten Form des Enzyms. </li><li> Mit dem A 452 nm-Wert aus den Laufwerken erhalten, ermitteln Sie die Enzymkonzentration vor dem Mischen (452 nm ε = 13.700 M -1 cm -1) und bereiten Sie 4 mL einer NADPH solution 1,5-fach konzentrierter. </li><li> Ersetzen Sie die Lösung von C Reservoir Spritze mit der NADPH-Lösung und leer und befüllen Sie die Stop-Spritze dreimal in 6,10 beschrieben. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 6.11. Dies ergibt Spektren während der Reduktion des Enzyms. </li></ol> 7. Oxidativer Half-Reaktion: Überwachung Flavin Oxidation <ol><li> Bereiten Sie die Stopped-Flow-Instrument und die Pro-Data Control Software für Doppel-Misch-Modus nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 6,2 bis 6,5. </li><li> Ersetzen der Lösung in den vier Reservoirs Spritzen mit anaeroben 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5). Drehen Sie das Ventil auf die F &quot;Drive&quot;-Position. Leeren Sie den Stop-Spritze, indem Sie auf Leere in der Pro-Data Control Software. Drücken Sie den Puffer aus der Spritze Laufwerk F durch den Strömungskreislauf durch manuelles Anheben des entsprechenden Antriebs Stößel. Führen Sie diesen Schritt insgesamt fünfmal mit jedem Laufwerk Spritze. </li><li> Führen Sie Schritt 7,3 viermal in total vollständig zu entfernen, den Inhalt von dem Strömungskreislauf. </li><li> Klicken Sie auf Baseline in der Pro-Data Control Software. </li><li> Mischen Sie 200 ul Enzym-Stammlösung mit 1000 ul anaerobe 100 mM Kaliumphosphatpuffer (Endkonzentration nach dem Vermischen in der Stopped-Flow von 15 uM). </li><li> Ersetzen Sie die Lösung von Reservoir Spritze A mit dem Enzym-Lösung. Drehen Sie den ein Ventil, um den &quot;Drive&quot;-Position. Leeren Sie den Stop-Spritze, indem Sie in der Pro-Data Control Software Leere. Schieben Sie das Laufwerk aus Enzymlösung Spritze A durch die Strömung Schaltung manuell durch Anheben des entsprechenden Antriebs-RAM. Führen Sie diesen Schritt insgesamt dreimal. In der Pro-Data Control Software, die Verzögerungszeit bis 0,5 s und Aufnahmezeit bis 60 s. </li><li> Sicherstellen, dass alle Laufwerk Spritzen mit den jeweiligen Lösungen und dem Antrieb Stößel gefüllt sind in Kontakt mit den Antriebs Spritzenkolben. Schalten Sie alle Ventile an den &quot;Drive&quot;-Position und klicken Sie in der Pro-Dat Acquireein Steuerungs-Software, um das Laufwerk durchzuführen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal, um die Daten in dreifacher Ausfertigung zu erhalten. Dies ergibt Spektren der oxidierten Form des Enzyms. </li><li> Ersetzen Sie die Lösung von B Reservoir Spritze mit einer NADPH-Lösung 1,5-fach konzentrierter als der Enzymlösung in Spritze A. Den B Ventil mit dem &quot;Drive&quot;-Position und leer und befüllen Sie die Stop-Spritze dreimal wie in 7.7 beschrieben. </li><li> Ersetzen Sie die Lösung von Reservoir Spritze C mit Sauerstoff angereicherte Puffer. Drehen Sie das Ventil mit dem C &quot;Laufwerk&quot;-Position und leer und befüllen Sie die Stop-Spritze dreimal wie in 7.7 beschrieben. In der Pro-Data Control Software, die Verzögerung und Aufnahmezeit bei 15 und 900 s, beziehungsweise. </li><li> Wiederholen Sie den Schritt 7.8. Dies ergibt Spektren während der Reoxidation des vollständig reduzierten Enzyms. </li></ol> 8. Datenanalyse <ol><li> Starten Sie das Pro-Data-Konverter-Software. Klicken Sie auf das Symbol Optionen und wählen Sie Speichern in ProDataCSV. </li><li> Geöffnetdas Verzeichnis, in dem die Dateien gespeichert wurden. Ziehen Sie die Dateien in das APL-Pro-Data Converter-Fenster. Die Daten werden automatisch als CSV-Format-Dateien im gleichen Verzeichnis gespeichert werden. </li><li> Öffnen Sie die CSV-Format-Dateien mit Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA). Normalisieren der Grundlinie der Stopped-Flow-Spuren durch Subtraktion der entsprechenden Absorption bei 700 nm liegt. </li><li> Analysieren Sie die korrigierten Spuren mit KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) durch Einsetzen der Handlung der Absorption bei der entsprechenden maximalen Abhängigkeit von der Zeit an die entsprechende Exponentialfunktion. Wie in 2B, die Absorption bei 452 nm wurde als eine Funktion der Zeit aufgetragen, um die Geschwindigkeit der Reduktion Flavin nach dem Mischen des Enzyms und NADPH in Stopped-Flow-Instrument zu bestimmen gezeigt. In diesem Fall wurde die beste Anpassung an die Daten unter Verwendung eines doppelt exponentiellen Gleichung und Bewertung von 0,65 und 0,23 s -1 für die erste und zweite Phase der Reduktion, berechnet RESgleichauf. Um die Geschwindigkeit der Bildung des C4a-hydroperoxyflavin Zwischen-und der Reoxidation nach der Umsetzung der reduzierten Enzyms mit Sauerstoff zu bestimmen, analysierten wir die Stopped-Flow-Spuren bei 380 und 452 nm (Abbildung 3B). Mit einem einzigen exponentiellen Gleichung berechneten wir von 1,4 und 0,006 s -1 für die erste und zweite Schritt der oxidativen halben Reaktion. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse Die Ergebnisse der Experimente in den vorherigen Abschnitten beschrieben, wie für die reduktive halbreaktion von A f Sida durch Messen der Änderungen in der Extinktion bei 452 nm, der den Änderungen in der Redox-Zustand des Flavin entsprechen kann überwacht werden. Die Geschwindigkeit dieser Schritt kann durch Anpassen der Daten an die entsprechende Gleichung (; Schritt 8.4 Abbildung 2) bestimmt werden. Die Reduktionsrate erhalten (0,65 s -1) ist ähnlich der k cat-Wert berechnet mitSteady-State-Experimente 2, was darauf hindeutet, dass die Verringerung der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Reaktion ist. Cytos Biotechnology nutzt die Doppel-Misch-Modus der Stopped-Flow, kann die Geschwindigkeit der Oxidation und der Zwischenprodukte in diesem halben Reaktion bestimmt (Abbildung 3; Schritt 8.4) werden. Bei der Umsetzung von A f Sida katalysiert wird die C4a-hydroperoxyflavin eindeutig erkannt (λ max von 380 nm), und die Rate der Bildung und Zerfall berechnet werden kann. Das langsame Tempo der Reoxidation erhalten (0,006 s -1) zeigt, dass die C4a-hydroperoxyflavin sehr stabil ist, in Abwesenheit der Ornithin. <img alt="Schema 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803scheme1.jpg" /> Schema 1. Mechanismus einer f Sida. Die isoallozaxine Ring des FAD-Cofaktor wird angezeigt. Das oxidierte Flavin (A) bindet an NADPH (B) und reagiert auf Flavin und NADP + (C) zu bilden. Nach der Reaktion mit molekularem Sauerstoff und die Bindung vonOrnithin, wird die C4a-hydroperoxyflavin (D) gebildet. Dies ist die Hydroxylierung Arten. Nach Hydroxylierung von Ornithin, muss der hydroxyflavin (E) entwässert werden, um die oxidierte Enzym zu bilden. NADP + gebunden bleibt während des katalytischen Zyklus und ist das letzte Produkt zu entlassen (F) werden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Stopped-Flow-Gerät. A) Bild von den Komponenten der Angewandte Photophysik SX20 Stopped-Flow-Spektralphotometer. B) Bild von der Probe Handling Unit. C) Schema der Strömung Schaltung in Doppel-Mischen-Modus. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig2.jpg" /> Abbildung 2. Anaerobe Reduktion von Sida mit NADPH in der Stopped-Flow-Gerät. A) Spektrale Änderungen nach dem Mischen gleicher Volumina von 30 uM und 45 uM Sida NADPH aufgezeichnet. Das erste Spektrum (oxidiert SIDA) und zuletzt Spektrum (vollständig reduziert SidA) ist in blau bzw. rot hervorgehoben. B) Absorption bei 452 nm Spur als eine Funktion der Zeit aufgezeichnet. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig3.jpg" /> Abbildung 3. Oxidation von Sida in der Stopped-Flow-Gerät. A) Spektrale Änderungen nach dem Mischen gleicher Volumina des vollständig reduzierten SIDA und oxygeniertem Puffer aufgenommen. Die Endkonzentrationen waren 15 uM Sida, 22,5 uM NADPH, und 0,95 mm Sauerstoff. Das Spektrum bei 0,034, 4,268 aufgezeichnet und 727,494 s entspricht dem vollständig reduzierten Enzyms, die C4a-hydroperoxyflavin Zwischenschicht (λ max von 380 nm), und das oxidierte Enzym (λ max von 450 nm) betragen. B) Die Absorption Spur bei 382 und 452 nm als Funktion der Zeit aufgezeichnet.

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	<li>Hissen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aspergillus+fumigatus+siderophore+biosynthetic+gene+sidA,+encoding+L&#45;ornithine+N5&#45;oxygenase,+is+required+for+virulence.">The Aspergillus fumigatus siderophore biosynthetic gene sidA, encoding L&#45;ornithine N5&#45;oxygenase, is required for virulence.</a> Infect. Immun. 73 (9), 5493-5503 (2005).</li><li>Chocklett, S. W., Sobrado, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus+SidA+is+a+highly+specific+ornithine+hydroxylase+with+bound+flavin+cofactor.">Aspergillus fumigatus SidA is a highly specific ornithine hydroxylase with bound flavin cofactor.</a> Biochemistry. 49 (31), 6777-6783 (2010).</li><li>Mayfield, J. 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Wir haben nichts zu offenbaren.

Enzyme, die Redox-Reaktionen katalysieren, enthalten in der Regel Cofaktoren wie Häme und Flavine, die bedeutende Veränderungen erfahren Absorption während des Katalysezyklus. Die oxidierte Form des Flavin zeigt Absorptionsmaxima bei ~ 360 und 450 nm, und seine Reduktion wird typischerweise durch die Absorption nach Abnahme bei 450 nm 7 überwacht. Im Allgemeinen sind einige kurzlebige Zwischenstufen vorliegenden sondern bilden und Zerfall zu schnell, um in regelmäßigen Spektralphotometer gemessen werden. Verwendung des Applied Photophysik SX20 Stopped-Flow-Spektralphotometer (oder ähnliches), ist es möglich, Änderungen in der Extinktion Millisekundenbereich (Totzeit, 2 ms) zu messen. Hier untersuchten wir die reduktive und oxidative Halbreaktionen des Flavin-abhängige Monooxygenase A f Sida, als Modell. Die Geschwindigkeit der Hydrid wurde durch Messen der Veränderung der Absorption bei 452 nm nach dem Mischen des Enzyms mit NADPH unter anaeroben Bedingungen bestimmt. Anschließend, unter advantage der Doppel-Mischen-Modus der Stopped-Flow-Instrument, wurde das Enzym NADPH reagiert zunächst mit, bis zur vollständigen Reduktion wurde erreicht, dann ist die reduzierte Enzym-NADP +-Komplex wurde mit Sauerstoff gemischt. Nach diesem Verfahren ist es möglich, transiente Flavin oxygenierten Zwischenstufen zu erkennen und Raten von Bildung und Zerfall zu messen. Die Identifizierung dieser Zwischenprodukte bietet experimentellen Daten über die Art der reagierenden Spezies in der Katalyse. Im Fall von A f Sida, die Bildung des C4a-hydroperoxyflavin (typischerweise bei 370 bis 380 nm überwacht), die die Hydroxylierung von Spezies ist. Darüber hinaus Messen der konstanten jeder Stufe ermöglicht es, Informationen über die geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Reaktion zu erhalten und dazu beitragen, die kinetischen und chemischen Mechanismen des Enzyms aufzuklären. Im Allgemeinen können ähnliche Ansätze für andere Flavoenzyme oder Proteine, für die Absorption ändert aufgetreten sind, wie Proteine ​​verwendet werden, dass contain Häm, Pyridoxal-Phosphat-oder Nicht-Häm-Eisen 8-10. Eine Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass große Mengen von gereinigtem Enzym benötigt werden, aber dies kann unter Verwendung eines Ausdrucks mit hohen Ausbeuten zu überwinden. Man bestimmt die optimale Protein-Konzentration für die Aufnahme von Spektren mit genügend Eiweiß, so dass ein Signal stark genug beobachtet werden kann, aber nicht zu viel, so dass Enzym wird nicht verschwendet. Typischerweise ist die niedrigste Enzymkonzentration für Flavin-Enzyme in Stopped-Flow-Experimenten verwendet 6-10 pM (nach dem Mischen) und wird unter Verwendung der entsprechenden molaren Extinktionskoeffizienten des Enzyms. Im Fall von A f Sida, ist der Prozentsatz des Enzyms gebunden FAD 50-65% 2. Apo-Protein wird als inaktives in diesen Experimenten betrachtet, weil ein gebundenes FAD-Cofaktor ist notwendig für die Katalyse. Eine weitere mögliche Einschränkung dieser Methode ist, wenn Prozesse in einem Enzym auftreten schneller als 2 ms (Totzeit der Stopped-Flow) werden sie nicht eingehalten werden, aber there sind Strategien, bei denen Preise gesunken, um dieses Problem überwunden werden kann berichtet. Ein Beispiel dafür die Verwendung einer hohen NaCl-Konzentration in der Reaktion eines Ferredoxin-NADP +-Reduktase 11. Die Wäsche von Sauerstoff aus der Strömungskreislauf der Stopped-Flow ist oft eine heikle Schritt in diesem Experiment und erfordert besondere Aufmerksamkeit. Die Glucose-Oxidase-Glucose hier beschriebene System wird erfolgreich in den meisten Labors verwendet, da es eine effektive und kostengünstige Methode ist. Es gibt jedoch einige Nachteile, die die Produktion von H 2 O 2 sind und für einige Anwendungen der Alternativen, da der Protocatechuat Dioxygenase-Protocatechuat sollte als 12 ist. Die Verwendung eines anaeroben Handschuhfach erleichtert, um anaerobe Bedingungen zu gewährleisten, ist jedoch nicht wesentlich. Sauerstoff muss aus dem Strömungskreislauf der Stopped-Flow entfernt werden, wie wir das Enzym in Abwesenheit von Sauerstoff reduziert werden soll oder reagieren mit Sauerstoff in einer Konzentrations, die wir angeben. Obwohl die Stopped-Flow ist im Handschuhfach, gibt es Sauerstoff in der Strömungskreislauf wenn wir aeroben Puffer verwendet in früheren Experimenten. Zusätzlich zu Absorptionsmessungen, können Fluoreszenz-und Circulardichroismus-Assays in die Angewandte Photophysik SX20 Stopped-Flow-Spektralphotometer mit dem entsprechenden Zubehör durchgeführt werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Allgemeine Laborgeräte </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Vakuumpumpe </td><td> Welch </td><td> - </td></tr><tr><td> Büchner-Kolben </td><td> Fischer </td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td> Rührstäbchen </td><td> Fischer </td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td> Stir Platten </td><td> Fischer </td><td> 11-100-49S </td></tr><tr><td> Schlenk-Linien </td><td> Kontes Glass </td><td> - </td></tr><tr><td> Argontank </td><td> Airgas </td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td> Stickstofftank </td><td> Airgas </td><td> Ni200 </td></tr><tr><td> Stickstoff-Tank, ultra hohen Reinheitsgrad </td><td> Airgas </td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td> Sauerstoffbehälter </td><td> Airgas </td><td> OX 40 </td></tr><tr><td> 5% Wasserstoff Gleichgewicht Stickstofftank </td><td> Airgas </td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> SX20 StOp-Flow-Spektrophotometer </td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td> Im Handschuhfach </td><td> Schüchtern </td><td> - </td></tr><tr><td> Wasserbad </td><td> Brinkmann Lauda </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vorräte </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50-ml-Falcon-Röhrchen BD </td><td> Fischer </td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 ml konischen Röhrchen BD Falcon </td><td> Fischer </td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td> 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße </td><td> Fischer </td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50 und 25 ml Glasfläschchen </td><td> Fischer </td><td> 06-402 </td></tr><tr><td> Gummistopfen </td><td> Fischer </td><td> 06-447H </td></tr><tr><td> Aluminiumkappen </td><td> Fischer </td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagents </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kaliumphosphat, monobasisches </td><td> Fischer </td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td> Kaliumphosphat, dibasisches </td><td> Fischer </td><td> P288-500 </td></tr><tr><td> Natriumacetat </td><td> Sigma </td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> Glucose-Oxidase aus A. Niger </td><td> Sigma </td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Fischer </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td> Fischer </td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L (+)-Ornithin-hydrochlorid </td><td> Fischer </td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry

Aspergillus fumigatus Siderophor A (SIDA) ist ein FAD-haltige Monooxygenase, die die Hydroxylierung von Ornithin katalysiert in der Biosynthese von Hydroxamat Siderophore, die für Virulenz (zB ferricrocin oder N &#39;, N &quot;, N&#39;&#39;&#39;-triacetylfusarinine C) 1 sind. Die Reaktion von Sida katalysiert werden in reduktive und oxidative Halbreaktionen (Schema 1) unterteilt werden. Bei der reduktiven halbreaktion die oxidierte FAD gebunden an A f Sida, durch NADPH 2,3 reduziert wird. Bei der oxidativen halbreaktion die reduzierten Cofaktor reagiert mit molekularem Sauerstoff zu einem C4a-hydroperoxyflavin Zwischenschicht, die ein Sauerstoffatom überträgt Ornithin bilden. Hier haben wir ein Verfahren, um die zu messen und erkennen die verschiedenen spektralen Formen von Sida Verwendung eines Stopped-Flow-Gerät installiert beschreiben eine anaerobe Handschuhfach. In Stopped-Flow-Instrument, sind kleine Mengen der Reaktanten rasch gemischt, und nach der Strömung durch th gestoppte Anschlag Spritze (1), werden die spektralen Veränderungen der Lösung in der Zelle angeordnet Beobachtung über die Zeit aufgezeichnet. Im ersten Teil des Experiments zeigen wir, wie wir die Stopped-Flow-Instrument im Single-Modus, wo die anaerobe Reduktion des Flavin in a-f Sida durch NADPH direkt gemessen wird, zu verwenden. Wir verwenden dann doppelt Mischen Einstellungen in der A f Sida erste anaerob durch NADPH wird für eine bestimmte Zeit in einer alternden Schleife reduziert, und dann mit molekularem Sauerstoff in der Zelle Beobachtung (Abbildung 1). Um dieses Experiment durchzuführen, sind anaerobe Puffer erforderlich, weil, wenn nur die reduktive halbreaktion überwacht wird, kein Sauerstoff in den Lösungen mit der reduzierten Flavin reagieren und bilden eine C4a-hydroperoxyflavin Zwischenschicht, die letztlich zerfallen wieder in den oxidierten Flavin . Dies würde nicht zulassen, dass der Benutzer genau zu messen Ermäßigungssätze da komplette Umsatz der Enz wäreYme. Wenn die oxidative halbreaktion geprüft wird das Enzym muss in Abwesenheit von Sauerstoff, so dass nur die Schritte von Reduktion und Oxidation beobachtet reduziert werden. Einer der Puffer in diesem Experiment verwendet Sauerstoff gesättigt ist, so dass wir die oxidative halbreaktion bei höheren Konzentrationen von Sauerstoff zu studieren. Diese sind oft die durchgeführten Verfahren bei der Untersuchung entweder die reduktive oder oxidative Halbreaktionen mit Flavin-Monooxygenasen. Die Zeitskala der Pre-Steady-State-Experimente mit der Stopped-Flow durchgeführt ist Millisekunden bis Sekunden, die die Bestimmung der intrinsischen Geschwindigkeitskonstanten und die Detektion und Identifizierung von Zwischenstufen der Reaktion 4 zu ermöglichen. Die hier beschriebenen Verfahren kann auf andere Flavin-abhängigen Monooxygenasen angewendet werden. 5,6

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Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

Wir beschreiben die Verwendung eines Stopped-Flow-Gerät sowohl die reduktive und oxidative Reaktionen von Halb-Untersuchung<em&gt; Aspergillus fumigatus</em&gt; Ein Siderophor (SIDA), eine Flavin-abhängige Monooxygenase. Wir stellen dann die Spektren entsprechend der Spezies in der Reaktion von Sida, und wir berechnen die Geschwindigkeitskonstanten für ihre Bildung.

Die Überwachung der reduktiven und oxidativen Halbreaktionen eines Flavin-abhängige Monooxygenase mit Stopped-Flow Spektrophotometrie

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of ...

monitoring-reductive-oxidative-half-reactions-flavin-dependent

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.0K Aufrufe.  Virginia Polytechnic Institute and State University. Wir beschreiben die Verwendung eines Stopped-Flow-Gerät sowohl die reduktive und oxidative Reaktionen von Halb-Untersuchung Aspergillus fumigatus Ein Siderophor (SIDA), eine Flavin-abhängige Monooxygenase. Wir stellen dann die Spektren entsprechend der Spezies in der Reaktion von Sida, und wir berechnen die Geschwindigkeitskonstanten für ihre Bildung.

Serie: Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Forschung

Biotechnik

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the arterial wall lead to tissue injury, which initiates restenosis2-7. This hypothesis needs further investigations including better quantifications of non-uniform strain distribution on the artery following stent implantation. A non-contact surface strain measurement method for the stented artery is presented in this work. ARAMIS stereo optical surface strain measurement system uses two optical high speed cameras to capture the motion of each reference point, and resolve three dimensional strains over the deforming surface8,9. As a mesh stent is deployed into a latex vessel with a random contrasting pattern sprayed or drawn on its outer surface, the surface strain is recorded at every instant of the deformation. The calculated strain distributions can then be used to understand the local lesion response, validate the computational models, and formulate hypotheses for further in vivo study.

Stent-induced arterial strain distributions are characterized using an optical surface strain measurement system. This visualization technique is used to gain insights into the impact of stent implantation on the host vessel.

Die Überwachung der Wand Mechanik Während der Entfaltung des Stents in einem Gefäß

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Messe Cytometry: Protokoll für die tägliche Tuning und Ausführen von Zellproben auf einem CyTOF Messe Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Echtzeit-Überwachung von intrazellulären Gallensäure Dynamics Mit Hilfe eines genetisch kodierte FRET-Gallensäure-Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

Intrakardialer Side-Firing Light Katheter zur Überwachung des Zellstoffwechsels mit transmuraaler Absorptionsspektroskopie von perfundierten Säugetierherzen

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

Präklinische Kardiale Elektrophysiologie Bewertung durch Dual Voltage und Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental technique and image analysis protocol presented here can also be applied for imaging microscopic bubbles in other fields of research; therefore, it has a wide range of applications. We apply this to image cavitation around dental ultrasonic scalers. It is important to image cavitation to characterize it and to understand how it can be exploited for various applications. Cavitation occurring around dental ultrasonic scalers can be used as a novel method of dental plaque removal, which would be more effective and cause less damage than current periodontal therapy techniques. We present a method for imaging the cavitation bubble clouds occurring around dental ultrasonic scaler tips using a high-speed camera and a zoom lens. We also calculate the area of cavitation using machine learning image analysis. Open source software is used for image analysis. The image analysis presented is easy to replicate, does not require programming experience, and can be modified easily to suit the application of the user.

Cavitation microbubbles are imaged using a high-speed camera attached to a zoom lens. The experimental setup is explained, and image analysis is used to calculate the area of the cavitation. Image analysis is done using ImageJ.

Bildgebung und Quantifizierung des Bereichs der schnelllebigen Mikroblasen mit einer Hochgeschwindigkeitskamera und Bildanalyse

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.