Unsere Forschungsgruppe nutzt Mitochondrien als pharmakologisches Ziel für die Entwicklung verschiedener Produkte wie Chemotherapute, Insektizide und andere. Mit diesem Video wollen wir die Methodik zur Bewertung von Enzymen der mitochondrialen Atmung auf eine zugänglichere, verständlichere und nutzbarere Weise beschreiben. In unserem Labor haben wir ein Protokoll erstellt, um die verschiedenen Auswirkungen von Xenobiotika auf Mitochondrien bei Ratten, Mücken und Zecken zu bewerten, um einige Einblicke in eine spezifische mitochondriale Reaktion zu erhalten.
Dieser Ansatz unterstützt die biosichere Formulierung von Pestiziden, indem er mitochondriale Bioenergetikstörungen identifiziert, die für die Minimierung der Nichtzieltoxizität entscheidend sind. Zu unseren besonderen Vorteilen gehört ein Insektizid-Designprotokoll, das mit der In-silico-Analyse von Tausenden von Molekülen beginnt, gefolgt von einer In-vitro-Validierung derjenigen, die die Biosicherheitskriterien erfüllen, und mit In-vivo-Tests endet. Diese Methode spart Zeit und Ressourcen und hält sich gleichzeitig an die Best Practices in der Pestizidproduktion.
Mittelfristig werden wir natürlich gewonnene Moleküle auswählen, die mit genetischer Modifikation kombiniert werden können und auf Insektenmitochondrien abzielen, um die Spezifität und Biosicherheit in Nichtzielorganismen zu verbessern. Bereiten Sie zunächst 250 Milliliter Mitochondrien-Isolationspuffer mit oder ohne 0,2 Gramm BSA vor. Aliquotieren Sie 10 Milliliter des Puffers in ein eiskaltes konisches Röhrchen.
Nachdem Sie eine Ratte eingeschläfert haben, zerlegen Sie ihre Leber vollständig und legen Sie sie in den eiskalten Isolationspuffer, um sie zu spülen. Nach zwei Wäschen das Lebergewebe mit einer scharfen Schere in einer Petrischale mit 10 Millilitern Isolationspuffer zerkleinern. Geben Sie die Lösung in das Potter-Elvehjem-Gewebehomogenisatorröhrchen, um das zerkleinerte Gewebe mindestens 10 Mal bei einer niedrigen Geschwindigkeit von 390 Umdrehungen pro Minute zu homogenisieren.
Dann wird die homogenisierte Lösung in ein konisches Röhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 600 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand vorsichtig in ein neues konisches Röhrchen gegossen. Der Überstand wird erneut bei 7.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert und der resultierende Überstand verworfen.
Resuspendieren Sie das isolierte mitochondriale Pellet in zwei Millilitern Isolationspuffer ohne BSA. Prüfen Sie, ob die Eier von Aedes aegypti eine Woche vor dem Versuch in Schalen mit gefiltertem entchlortem Wasser ausgebrütet wurden, und überwachen Sie den Häutungsprozess bei den Larven. Sobald die Larven das L3-Stadium erreicht haben, warten Sie maximal 12 Stunden, bevor Sie sie einsammeln.
Sammeln Sie mit einer Pasteur-Pipette mindestens 100 Larven von Aedes aegypti in den Stadien L3 bis L4 in etwa 30 Millilitern chlorfreiem Wasser. Nach dem Filtrieren wird die Lösung mit den Larven in das Potter-Elvehjem-Gewebehomogenisatorröhrchen überführt und mindestens 10 Mal vorsichtig bei etwa 390 Umdrehungen pro Minute homogenisiert. Übertragen Sie das homogenisierte Gewebe durch eine Glaswollespritze, um große Exoskelett-Rückstände herauszufiltern.
Zu Beginn erhalten Sie Mitochondrien der Rattenleber und homogenisierte Aedes aegypti L3, L4-Larven. Für polarographische Assays kalibrieren Sie das hochauflösende Respirometer jeden Tag, bevor Sie mit den Assays beginnen, und befolgen Sie dabei die Anweisungen des Herstellers. Geben Sie Reaktionsmedium in die Kammern, wobei Sie auf eine Überschreitung von mindestens 0,2 Millilitern über dem Standardvolumen der Versuchskammer von zwei Millilitern achten.
Überwachen Sie den Sauerstoffverbrauch, um die NADH- und Succinatoxidase-Aktivitäten nach Zugabe von Reaktionspuffer, 0,1 Milligramm Protein und dem Substrat zu messen. Warten Sie, bis sich das Signal der Sauerstoffkonzentration stabilisiert hat, und nehmen Sie es auf. Fügen Sie der Kammer Elektronentransportprotein-Inhibitoren hinzu, um zu bestätigen, dass der beobachtete Sauerstoffverbrauch auf die mitochondriale Atmungskette zurückzuführen ist.
Für die NADH-Dehydrogenase-Aktivität bereiten Sie zunächst das Reaktionssystem vor, das alle erforderlichen Komponenten enthält, und geben Sie die Reagenzien in die Spektrophotometerzelle. Überwachen Sie die NADH-Dehydrogenase-Aktivität mit der Reduktion von Kaliumferrocyanid bei 420 Nanometern. Verwenden Sie den molaren Extinktionskoeffizienten von 1,04 pro Millimolar pro Zentimeter, um die Konzentration zu berechnen.
Teilen Sie schließlich die berichtete Aktivität durch die Proteinkonzentration, die verwendet wurde, um die spezifische Enzymaktivität zu erhalten. In ähnlicher Weise ist die Succinatdehydrogenase und die Cytochrom-c-Reduktase oder die Komplex-III-Aktivität unter Verwendung geeigneter Reaktionsmischungen zu bewerten. Um die Aktivität von Cytochrom-c-Oxidase oder Komplex IV zu messen, bereiten Sie das Reaktionssystem vor und mischen Sie gleiche molare Mengen an Cytochrom c und Natriumdithionit, um eine vollständige Reduktion zu gewährleisten.
Die reduzierte Mischung wird durch eine vernetzte Dextran-Gelsäule geleitet, wobei der Phosphatpuffer als mobile Phase verwendet wird. Quantifizieren Sie die Fraktionen, die bei 550 Nanometern in einem Spektralphotometer gesammelt werden. Berechnen Sie schließlich die Konzentration mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 19,8 pro Millimolar pro Zentimeter unter Anwendung des Beerschen Gesetzes.
Teilen Sie die berichtete Aktivität durch die Proteinkonzentration, um spezifische Ergebnisse der Enzymaktivität zu erhalten. Cavacrol bei 9,7 Teilen pro Million reduzierte die NADH-Oxidase-Aktivität um etwa 9,35 %, während Cymbopogon flexuosus ätherisches Öl oder EO bei 10 Teilen pro Million die NADH-Oxidation und Sauerstoffreduktion um etwa 34 % reduzierte, was auf eine Hemmung des Elektronentransports zwischen Komplex I und Komplex IV hinweist. Cavacrol reduzierte die Succinatoxidase-Aktivität um etwa 10,84 % in Aedes aegypti-Larven. und Cymbopogon flexuosus EO reduzierten die Succinatoxidase-Aktivität um bis zu 50 % in isolierten Mitochondrien der Rattenleber, was auf eine Hemmung zwischen Komplex II und Komplex IV hindeutet.Cavacrol verringerte die NADH-Cytochrom-c-Reduktase-Aktivität und die Cytochrom-c-Oxidation und Sauerstoffreduktion bei Komplex IV in Aedes aegypti-Larven, während Cymbopogon flexuosus EO die Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität in Rattenleber-Mitochondrien um etwa 58 % reduzierte.
