Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine praktische Methode für die Herstellung von photokatierten Verbindungen mit zusätzlichen Eigenschaften wie Wasserlöslichkeit oder zelluläre Targeting-Fähigkeit zur Verfügung zu stellen. Mit einem einfachen synthetischen Verfahren kann diese Technik verwendet werden, um das Labor über Käfigverbindungen zu erweitern und Käfigverbindungen mit zusätzlichen Eigenschaften herzustellen, ohne ihre Lichtempfindlichkeit zu beeinträchtigen. Diese Synthese kann in einem Standardlabor durchgeführt werden, da unsere klickbaren Käfigverbindungen stabil gegenüber photobestrahlung sind, wenn sie in nicht-nucleophilen organischen Lösungsmitteln wie Dichlormethan oder Dimethylsulfoxid gelöst werden.
Demonstriert das Verfahren mit Hirona Sasaki wird Akinobu Suzuki, ein Post-Doc, Hanami Aoki und Rei Watahiki, Grad Studenten aus dem Labor. Beginnen Sie mit 709,6 Milligramm PaBhc Methanol und 397,6 Milligramm n n-Carbonyldiimidazol in einem 30-Milliliter-Rundkolben. Sechs Milliliter Dichlormethan trocken in den Kolben geben und die Lösung bei Umgebungstemperatur eine Stunde rühren.
Am Ende der Inkubation 342,8 Milligramm 4-Dimethylaminopyridin und 552 Mikroliter Tert-Butyl-Sechs-Amino-Hexylcarbamat hinzufügen und die Lösung bei Umgebungstemperatur für weitere drei Stunden rühren. Verwenden Sie dann einen Rotationsverdampfer unter Vakuum, um das Lösungsmittel und andere flüchtige Materialien zu entfernen, und verwenden Sie Kieselgel-Flash-Säulenchromatographie, um den Rückstand direkt zu reinigen. Um eine funktionelle Einheit in die anklickbare Käfigverbindung zu installieren, lösen Sie 249 Milligramm Kupfer zwei Sulfat-Pentahydrat in 10 Milliliter Ionen-austauschendem Wasser auf, um eine 0,1 Mol-Kupfersulfatlösung zu geben.
Lösen Sie acht Milligramm von zwei Prime PaBhc Mock Paclitaxel, 7,5 Milligramm Tris(3-Hydroxypropyltriazolylmethyl)amin, 162,4 Milligramm Natrium-l-Ascorbat und 3,1 Milligramm 15-Chlor-3, 6, 9-Trioxypentyldecylazid in einem gemischten Lösungsmittel von 2,5 Milliliter00 0,1 Molarphosphatpuffer und 0,5 Milliliter Dimethylsulfoxid. Als nächstes fügen Sie dem Reaktionsgemisch 81,2 Mikroliter 0,1 Mol-Kupfersulfat-Lösung hinzu und rühren Sie das Gemisch 80 Minuten lang bei Umgebungstemperatur, um den Verlauf der Reaktion mit HPLC zu überwachen. Am Ende der Reaktion die Ausscheider mit 3,5 Millilitern einer 75%acetylnitryl Wasserlösung auflösen und die resultierende Lösung direkt auf das semipräparative HPLC-System auftragen, um das gewünschte Produkt zu reinigen.
Für Quanteneffizienzmessungen verdünnen Sie unter Leuchtstofflampen, die mit UV-Licht-Abschneidefilter abgedeckt sind, die Probenbestandslösung in 10 Mikroliter Dimethylsulfoxid mit 10 Milliliter KMOPS-Puffer. Übertragen Sie ein Aliquot der Lösung in dasselbe Reagenzglas, das bei der Fotoreaktion des chemischen Aktinometers verwendet wird. Bestrahlen Sie die Probenlösung fünf Sekunden lang mit 350 Nanometer Licht und entfernen Sie 50 Mikroliter-Aliquots periodisch zur Analyse durch HPLC aus der bestrahlten Lösung.
Bestimmen Sie dann die Bestrahlungszeit in Sekunden, in der 90% des Ausgangsmaterials durch Einbauplots des zeitabhängigen Verschwindens des Ausgangsmaterials reagierten. Für HaloTag Ligand Targeting einer klickbaren Käfigverbindung, ernten Sie die Zielzellpopulation von Interesse mit einem geeigneten Zelldissoziationsreagenz und setzen Sie die Zellen in einem 2,5 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter DMEM-Konzentration wieder aus. Dann säen Sie etwa 10 bis die fünften Zellen pro Schale in 35 Milliliter Glasbodenschalen für eine nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Am nächsten Morgen verdünnen Sie 14 Mikrogramm der PC-DNA drei Halo-Epidermal-Wachstumsfaktor-Rezeptor-Plasma-DNA in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit 700 Mikroliter reduziertem Serummedium. Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter des Lipofektionsreagenzes in 150 Mikroliter reduzierten Serummediums zu jeder von vier Röhren hinzu und lassen Sie die Rohre fünf Minuten lang bei Umgebungstemperatur stehen. Am Ende der Inkubation 150 Mikroliter verdünnter Plasma-DNA zu jeder der verdünnten Lipofektionsreagenzproben hinzufügen und die Proben bei Umgebungstemperatur für weitere fünf Minuten inkubieren.
Am Ende der Inkubation spülen Sie die Zellen mit zwei Milliliterpbs pro Schale ab und fügen Sie 1,5 Milliliter reduziertes Serummedium zu jeder Kultur hinzu. Fügen Sie 150 Mikroliter des Plasmid-Lipofektionsreagenz-Komplexes zu jeder Schale hinzu und geben Sie die Zellen 48 Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator zurück. Am Ende der Inkubation, aspirieren Sie die Überwältmittel und fügen Sie einen Milliliter frisch zubereitetem DMEM ergänzt mit zwei Mikromolar paBhc hex fitzi halo zu jedem Gericht.
Nach 30 Minuten bei 37 Grad Celsius das Medium, das die Käfigverbindung enthält, ansaugen und die Zellen zweimal mit einem Milliliter PBS plus abspülen, um alle ungebundenen Verbindungen zu entfernen. Fügen Sie 500 Mikroliter reduziertes Serummedium zu jeder Schale hinzu und geben Sie die Zellen für weitere 30 Minuten in den Zellkultur-Inkubator zurück, um die Verbindungen zu entfernen, die in die Zellen eingedrungen sind. Am Ende der Inkubation spülen Sie die Zellen zweimal mit einem Milliliter PBS plus pro Schale ab und fügen Sie jeder Kultur einen Milliliter Medium ohne Phenolrot hinzu.
Dann nehmen Sie die Blütenstände Bilder durch Laserscanning konfokale Floreszenzmikroskopie auf. Zur fotovermittelten Modulation der Kinase-Lokalisation mit einer klickbaren Käfigverbindung, Samen etwa fünfmal 10 bis die fünfte TOC-A-One-Zellen in zwei Milliliter n.V. Von Hams F12 Medium pro 35 Milliliter Glasbodenschale. Am nächsten Tag, transfetieren Sie die Zellen mit dem Plasmid kodieren für GFP Diacylglycerol Kinase Gamma für 48 Stunden, wie gerade gezeigt.
Ersetzen Sie nach dem Ende der Transfektion den Transfektionsüberstand durch zwei Milliliter reduziertes Serummedium. Fügen Sie den Zellen 20 Mikroliter der 100-fachen paBhcAA-Arbeitslösung für eine inkubation von fünf bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid hinzu. Am Ende der Inkubation stellen Sie die Schale auf die objektive Stufe eines invertierten Fluoreszenzmikroskops, das mit einem Dual-Licht-Fluoreszenz-Leuchter ausgestattet ist.
Stellen Sie die Zellen alle 10 Sekunden für 10 Minuten ab, während Sie die Zellen zu den entsprechenden experimentellen Zeitpunkten und Wellenlängen gemäß dem experimentellen Protokoll bestrahlen. Mit dieser Methode, wie gezeigt, können anklickbare Käfigverbindungen einiger biologisch interessanter Moleküle, einschließlich Paclitaxel und Arachidonsäure, erfolgreich synthetisiert werden. Zusätzliche Eigenschaften wie die Wasserlöslichkeit und zelluläre Targeting-Fähigkeit können über die Kupfer-Eins-Zyklisierungs-Klickreaktion in das paBhc-Mock-Paclitaxel eingebracht werden.
Diese klickbaren Käfig-Paclitaxel können dann photolysiert werden, um ihre Elternverbindungen bei Bestrahlung bei 350 Nanometern zu erzeugen. Die physikalischen und photochemischen Eigenschaften der anklickbaren Käfigverbindungen sind in der Tabelle zusammengefasst. In Live-Zell-Experimenten induziert die Ausrichtung von paBhc hex fitzi halo auf kultivierte Säugetierzellen, die vorübergehend ein HaloTagged-Protein und einen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor exezieren, ein grünes Blütenstichsignal aus dem Fluorescein-Moiety PAHBHC hex fitzi halo auf der Zellmembran.
Weiterhin bewirkt die Behandlung von CHO-K1-Zellen, die GFP-Diacylglycerinkinase gamma mit Arachidonsäure transient exzessient, eine Modulation der subzellulären Lokalisation von Diacylglycerinkinase Gamma. Ähnliche Veränderungen in der Diacylglycerinkinase Gammalokalisierung werden auch in paBhc-AA behandelten Zellen nach UV-Licht-Exposition beobachtet. Achten Sie bei der Durchführung der Caging-Experimente in wässrigen Lösungen, die das Kulturmedium erhöhen, immer unter Leuchtstofflampe mit kurzwelligem, gekapseltem Filter zu arbeiten.
Nach diesem Verfahren können Sie Käfigverbindungen untersuchen, die aufgrund mangelnder Wasserlöslichkeit, Membrandurchlässigkeit oder zellulärer Targeting-Fähigkeit für biologische Experimente reichlich vorhanden waren.
