Dieses Protokoll ermöglicht die Beurteilung der mitochondrialen Funktion innerhalb des Nervs durch Parzellierung der isolierten Mitochondrien, ein anspruchsvolles Verfahren in einem kleinen Gewebe, das eine begrenzte Anzahl von Mitochondrien enthält. Die Technik bietet die Möglichkeit, Mitochondrienfunktionen wie Sauerstoffverbrauch und ROS-Produktion gleichzeitig in einem konservierten Mitochondrien in situ zu analysieren. Mit mehreren Substraten, Inhibitoren und Entkoppler-Designprotokollen.
Mehrere Krankheiten teilen sich die mitochondriale Funktion, insbesondere Neuropathien, die durch Typ-Zwei-Diabetes oder Chemotherapie induziert werden. Bei diesen Erkrankungen sind Beeinträchtigungen der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung das einzige Zeichen, das die Krankheitsentwicklung bestimmt. Diese Methode bietet Einblicke in die Neurobiologie, Biochemie und Pharmakologie, mit der Untersuchung von mitochondrialen Krankheitsmechanismen, der Suche nach Therapien wie mitochondrialen Boostern oder verbesserten neuropathischen Schmerzen.
Kalibrieren Sie zunächst die Sauerstoffsensoren, indem Sie 2,1 Milliliter MR-Puffer in jede Kammer pipettieren. Schließen Sie es mit den Stopfen und saugen Sie Luft in die Kammer, bis sich eine Blase bildet. Im Kalibriermodus eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius umrühren, bis sich der Sauerstofffluss pro Masse stabilisiert hat.
Mit der HRR-Software führen Sie eine Luftkalibrierung der polarographischen Sauerstoffsensoren gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Zur Gewebepräparation legen Sie den Ischiasnerv in eine Petrischale mit genügend TP-Puffer, um ihn zu bedecken. Halten Sie ein Ende des Nervs mit einer Pinzette und ziehen Sie mit einer anderen Pinzette die Nervenbündel horizontal heraus.
Zuerst das angezeigte Gewebe in eine kleine Schale mit einem Milliliter TP-Puffer für die Gewebepermeabilisierung geben. Um mit der Permeabilisierung zu beginnen, übertragen Sie das Gewebe mit einer Pinzette in eine andere Schale, die einen Milliliter TP-Puffer enthält und 50 Mikrogramm pro Milliliter Saponin enthält. Legen Sie die Platte in einen Mikroplattenschüttler und lassen Sie sie 30 Minuten lang vorsichtig rühren.
Anschließend das Gewebe mit einer Pinzette in eine frische Schale mit einem Milliliter MR-Puffer geben und 10 Minuten lang vorsichtig umrühren lassen. Überführen Sie das Gewebe mit einer Pinzette in eine kalibrierte HRR-Kammer. Füllen Sie die HRR-Kammern mit 2,1 Millilitern MR-Puffer.
Fügen Sie Amplex Red und Peroxidase zu einer Endkonzentration von fünf Mikromolaren bzw. zwei Einheiten pro Milliliter hinzu. Dann fügen Sie den durchlässigen Ischiasnerv hinzu. Befestigen Sie die Fluoreszenzsensoren des Instruments.
Schalten Sie dann die Lichter im Steuerungsbereich der Software aus und klicken Sie in der Software auf "An Oxygraph anschließen"Gehen Sie zu Protokollen bearbeiten" und geben Sie das Gewebegewicht ein. Gehen Sie zum Layout und wählen Sie die Option "Spezifischer Fluss pro Sample". Wählen Sie dann Parzellen aus, um gleichzeitig auf die Sauerstoffverbrauchsanzeige und bei Bedarf auf die Wasserstoffperoxidproduktion zuzugreifen.
Warten Sie ca. 10 Minuten. Injizieren Sie zwei Impulse Wasserstoffperoxid, jeder auf eine Endkonzentration von 260 Mikromolar zur Kalibrierung der Kammer. Injizieren Sie 20 Mikroliter Succinat, ein substrat des mitochondrialen Komplexes II, um das mitochondriale Elektronentransportsystem zu aktivieren.
Fügen Sie 20 Mikroliter ADP hinzu, um die ATP-Synthese zu aktivieren. Fügen Sie in der Folge fünf Mikroliter Cytochrom c als Indikator für die Integrität der Membran hinzu. Titrieren Sie mit Aliquots von 0,2 Mikrogramm pro Milliliter Oligomycin, bis keine weitere Abnahme des Sauerstoffverbrauchs mehr beobachtet wird.
Titrieren Sie mit Aliquots von 0,5 Mikromol pro Liter FCCP, dem mitochondrialen Entkoppler, bis kein weiterer Anstieg des Sauerstoffverbrauchs beobachtet wird. Um das Experiment zu beenden, injizieren Sie zwei Mikroliter Antimycin A, machen Sie eine endgültige Konzentration von fünf Millimolar und warten Sie, bis sich der Fluss stabilisiert hat. Wechseln Sie zur Befehlsleiste.
Suchen Sie nach "multisensory" in der Software. Klicken Sie auf "Steuerung", drücken Sie "Datei speichern" und trennen Sie die Verbindung. Öffnen Sie die gespeicherte Datei und wählen Sie den Sauerstofffluss pro Massenschalen aus, um die experimentellen Sauerstoffverbrauchsergebnisse zu erhalten.
Wählen Sie das Fenster zwischen den Injektionen manuell aus, indem Sie die Umschalttaste und die linke Maustaste drücken. Gehen Sie zu Markierungen und wählen Sie Statistiken aus, um die Ergebnisse für jede Injektion von Substraten, Inhibitoren und Entkopplungsprotokollen zu visualisieren. Für die Wasserstoffperoxidproduktion führen Sie das gleiche Verfahren mit der Ampere-Steigungsspur durch.
Die Abnahme des Membranpotentials, die durch die ATP-Sythase-Aktivität gefördert wird, beschleunigte den Sauerstoffverbrauch. Die Zugabe von exogenem Cytochrom C förderte nur eine minimale Stimulation der Atmung und bescheinigte die Integrität der mitochondrialen äußeren Membran für dieses Präparat. Absolute Sauerstoffflüsse wurden aufgezeichnet und nur ein Anstieg der Atmung um 6,3% beobachtet, was auf eine gute Qualität der Gewebepräparation hinweist.
Der Sauerstoffverbrauch und die ROS-Produktion wurden gleichzeitig in Gegenwart verschiedener Substrate gemessen, die Brennstoff für das Elektronentransportsystem lieferten. Die Zugabe von Pyruvat und Malat für den mitochondrialen Komplex I erhöhte die Atmung. Und die weitere Zugabe von Succinat für Komplex II erhöht auch den Sauerstoffverbrauch.
Daher konnten andere Substrate getestet werden. Die ROS-Produktion stieg ebenfalls, was auf das Austreten von Sauerstoff aus dem Elektronentransportsystem hinweist. Die Zugabe von Adenosindiphosphat in der Sättigungskonzentration erhöhte den Sauerstoffverbrauch, was die ATP-Bildung vorantrieb, und verringerte die ROS-Produktion.
Im Gegensatz dazu verringerte die Oligotitration den Sauerstoffverbrauch und erhöhte die ROS-Produktion. Dies deutete darauf hin, dass der permeablisierte Ischiasnerv die Standardrelation in der mitochondrialen Physiologie replizieren könnte. Die Zugabe von FCCP und Retinon, abgestimmt auf die erwarteten Sauerstoffflussänderungen, bestätigt, dass die mitochondriale Physiologie und das bioenergetische Profil im permeablisierten Ischiasnerv erhalten blieben.
Der wichtigste Schritt besteht darin, den Gewebeabschnitt vorsichtig vorzubereiten und sicherzustellen, dass alle Kammeröffnungen ordnungsgemäß gereinigt werden. Veränderungen der Mitochondrienfunktion können auf Funktionsstörungen oder eine niedrigere mitochondriale Zahl zurückzuführen sein. daher werden die zitierte Synthaseaktivität und die Bestätigung des mitochondrialen DNA-Gehalts durch PCR empfohlen.
