Die Autoren danken den Mitarbeitern der Abteilung für Pharmazeutische Biotechnologie und Molekularbiologie und insbesondere Monique de Pelsmacker für die Herstellung der radioaktiv markierten Virus. Wir bedanken uns bei Ellen Merckx und Hadewych Halewyck für ihre interessanten Ausführungen und Diskussionen und Gerrit de Bleeser für seine Hilfe im Labor. Diese Arbeit wurde finanziell durch eine OZR Gewährung der Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), dem Fonds voor Vlaanderen Wetenschappelijk Onderzoek (G.0168.10N) und der Weltgesundheitsorganisation (TSA 200410791) unterstützt. Lise Schotte ist ein Promotionsstipendium des Fonds voor Vlaanderen Wetenschappelijk Onderzoek (FWO).

Das Prinzip (A) und ein Überblick über die Verfahren (B) sind in 1 dargestellt. 1. Vorbereitung der Puffer <ol><li> Bereiten Binding / Waschpuffer durch Auflösen von Natriumdihydrogenphosphat (50 mM) und Natriumchlorid (300 mM) in Wasser und den pH-Wert auf 8,0. Zusätzlich fügen Tween 20 (0,01% (m / v) Endkonzentration), Methionin (2% (m / v) Endkonzentration) und Albumin (0,1% (m / v) Endkonzentration) und stellen Sie die gewünschte Lautstärke ein. </li></ol> 2. Herstellung der magnetischen Beads Bereiten Sie die magnetischen Kügelchen nach der Bedienungsanleitung. Kurz gesagt: <ol><li> Resuspendieren magnetische Kügelchen mit einem Vortex. </li><li> Übertragen, für jede Probe 10 ul der resuspendierten magnetischen Kügelchen (40 mg / ml) in ein Rohr. </li><li> Sammeln Sie die magnetischen Beads mittels eines Magneten, bis der Überstand klar ist (+ / - 30 sec) und entfernen Sie den Überstand vorsichtig. </li><li> Waschen Sie diemagnetischen Beads zweimal: Dynabeads in 150 ul Binding / Wash-Puffer. Migrieren Sie die magnetischen Kügelchen zu einer Seite des Rohres mit Hilfe eines Magneten, bis der Überstand klar ist und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. </li><li> Verwenden Sie 40 ul Binding / Waschpuffer, für jede Probe, um die Perlen (10 mg / ml) resuspendieren. </li></ol> 3. Affinity Capture Assay Hinweis: Um die (kosmische) Hintergrund Radioaktivität (0% der Radioaktivität) zu messen, nicht radioaktiv markierten Virus ist mit einer Steuereinheit Probe 1 aufgenommen. Stattdessen wird das gleiche Volumen Binding / Waschpuffer zugesetzt. Anmerkung: 100% der Radioaktivität wird durch eine Kontrollprobe 2, an dem alle Komponenten mit Ausnahme des Nanobody hinzugefügt definiert sind. Stattdessen wird das gleiche Volumen Binding / Waschpuffer zugesetzt. <ol><li> Bringt 2000 cpm von 35 S markierten (β-Strahlung) Poliovirus Sabin-Stamm Typ 1 9, mit Binding / Wash-Puffer auf 80 ul in einer 96-Well Mikrotiterplatten verdünnt. </li><li> Fügen Sie 10 &amp; mu; l Nanobody Verdünnung in die Vertiefungen. </li><li> Mischen Sie etwa 10 Sekunden lang mit einem Shaker. </li><li> Man lässt die Proben für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. </li><li> In 40 ul des gewaschenen magnetischen Beads Suspension und Inkubation für 10 Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln. </li><li> Trennen der Kügelchen und der Überstand unter Verwendung eines Magneten und übertragen die geklärte Überstand in ein Rohr. </li></ol> 4. Messung der Radioaktivität <ol><li> Übertragen Sie 50 ul der Überstand aus Schritt 3.6 in einem Kolben zu zählen. </li><li> 3 ml Szintillationsflüssigkeit und mischen. Messen Sie die Radioaktivität in einem β-Szintillationszähler. </li></ol> 5. Das Recycling der Perlen <ol><li> Sammeln der verwendeten magnetischen Kügelchen in ein Rohr und Zentrifuge bei 500 × g für 2 Minuten oder bis eine klare Überstand erhalten wird. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Perlen in 6 ml 0,5 M NaOH. </li><li> Überführt die Suspension Multiple Rohre und inkubieren Sie in einem Ultraschallbad für 5 Minuten. </li><li> Nutzen Sie die Magneten, die magnetische Kügelchen sammeln und den Überstand entfernen. </li><li> 1 ml 2% SDS-Lösung und die Dynabeads mit einem Vortex. Kochen Sie während 5 Minuten. </li><li> Sammeln Sie die Perlen und den Überstand entfernen. Dynabeads in 1 ml 0,2 M EDTA (pH = 7). </li><li> Die Röhrchen in ein Ultraschallbad für 5 Minuten und einmal mehr wurde der Überstand entfernt. </li><li> 1 ml Wasser zu und die Dynabeads die Perlen. Sammeln Sie die Perlen und den Überstand entfernen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Perlen in 1 ml 10 mM CoCl 2-Lösung. Legen Sie auf einem Schüttler für 10 Minuten. </li><li> Entfernen Sie den Überstand mit Hilfe eines Magneten, um die Perlen zu sammeln und Resuspension in 1 ml Binding / Wash-Puffer. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Waschen der Kügelchen zweimal mit 1 ml 20% (v / v) Ethanol </li><li> Resuspendieren der Kügelchen in ihr ursprüngliches Volumen von 20% (v / v) ethanol regeneriert Kügelchen in einer Konzentration von 40 mg / ml zu erhalten. </li></ol> 6. Interpretation der Ergebnisse <ol><li> Probe 1, in dem keine radioaktiv markierten Virus zugegeben wird verwendet, um die Hintergrund-Radioaktivität zu beseitigen und die Radioaktivität 0% eingestellt werden. Control-Probe 2, die nicht enthält Nanobody und wo somit alle radioaktiv markierten Virus verbleibt im Überstand wird als 100% Radioaktivität Wert gesetzt. </li><li> Der Anteil der Radioaktivität im Überstand (= a%) ist ein Maß für die gesamte Niederschlag (= 100 - a%) des radioaktiv markierten Virus durch den Nanobody. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Repräsentative Ergebnisse für dieses Affinitätsabfang-Assays sind in den 2, 3 und 4 gezeigt. In 2 wird die Affinität der PVSS38C ein Nanobody spezifisch für Poliovirus, gezeigt. Die Affinität der PVSS38C wurde für drei verschiedene Antigene getestet poliovIrus: Native-Antigen-(N-Antigen), Beheizt-Antigen (H-Antigen) und 14S-Untereinheiten. N-Antigen ist das intakte Virus, das ansteckend ist. Wenn das Virus wird erhitzt (20 Minuten bei 56 ° C) oder an einer festen Oberfläche (unveröffentlichte Ergebnisse), die Konformation der Kapsid ändert, was zu einer (teilweisen) Verlust der viralen RNA und dem Kapsidprotein VP4 und leer Kapside gebildet werden, die dann als H-Antigene. 14S-Untereinheiten sind Assemblierungsintermediate. Diese Antigene werden durch verschiedene Arten von Antikörpern nach der Immunisierung 10 erkannt und besitzen daher verschiedene Epitope und antigenen Bindungsstellen. In der Figur ist der Prozentsatz an Radioaktivität im Überstand wird in Abhängigkeit von der Konzentration des Nanobody dargestellt. Es ist ersichtlich, dass die Radioaktivität in dem Überstand der Proben mit radioaktiv markierten 14S-Untereinheiten mit steigenden Konzentrationen des Nanobody PVSS38C abnimmt. Dies kann als ein Anstieg in der Menge von Poliovirus 14S-Untereinheiten con übersetzt werdenangeschlossen an die Nanobody PVSS38C und indirekt an die magnetischen Beads. Die Erfassung Titer (= die Konzentration des Nanobody erforderlichen bis 50% des radioaktiv markierten Virus zu erfassen) kann graphisch als 0,099 nm berechnet werden. Nr. Affinität PVSS38C für die N-Antigens und H-antigene Form Poliovirus beobachtet wird. Aus diesen Daten wird so interpretiert, dass PVSS38C ist mit einem Epitop, das ausschließlich auf dem 14S-Untereinheit und nicht auf die beiden anderen antigenen Formen der Interaktion Poliovirus ist. Um zu zeigen, dass der Verlust der Radioaktivität aus dem Überstand nur aufgrund der spezifischen Affinität des Nanobody gegenüber ihren Antigenen, gleich Assay wurde mit Nb1 durchgeführt, um ein Nanobody gegen die lrpB Transkriptionsregulator Sulfolobus sulfataricus erzeugt und bekannt sind keine Wechselwirkung mit einem Poliovirus-Antigen. Das Ergebnis dieser Analyse ist in 3 gezeigt. Alle radioaktiv markierten Virus bleibt in den Überständen der hervorgeht, dass es keine ReaktivitätNb1 gegen die drei antigenen Formen des Poliovirus. Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse wurde durch Wiederholung des Experiments für insgesamt acht Mal für eine gegebene Nanobody (dh PVSP29F) an verschiedenen Tagen und von verschiedenen Personen getestet. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Der Mittelwert der Anteil Radioaktivität im Überstand wurde für jede Nanobody Konzentration berechnet und in Übereinstimmung mit der Standardabweichung dargestellt. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig1.jpg" /> Abbildung 1. Eine Übersicht des Prinzips (A) und das Verfahren (B) des Assays. A. Nanokörper, die spezifisch eine bestimmte Poliovirus-Antigen in der Lage, mit den Kobalt-beschichteten magnetischen Kügelchen interagieren und wird so den radioaktiv markierten Virus His-Tag. B. His-markierten Nanokörper werden radioaktiv markierte Poliovirus hinzugefügt und inkubiert. Cobalt-beschichteten magnetischen Kügelchen sindzugegeben und magnetische Trennung des gebundenen / ungebundenem Antigen durchgeführt wird. Die Radioaktivität der Überstand wird gemessen und die Menge des eingefangenen Antigen abgeleitet werden kann. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig2.jpg" /> Abbildung 2. Magnetic Beads Capture-Affinität von verschiedenen Poliovirus-Antigenen durch Nanobody PVSS38C. Der Anteil der Radioaktivität im Überstand gefunden wird als eine Funktion der Konzentration von PVSS38C dargestellt. Für eine Konzentration 14S-Wirkungs-Beziehung gefunden werden kann, zeigt das Zusammenspiel von PVSS38C mit einem Epitop vorhanden ausschließlich auf 14S. Keine signifikante Interaktion mit dem N-, oder H-Antigen kann erkannt werden, obwohl eine vernachlässigbare unspezifische Aufnahme in sehr hohen Konzentrationen festgestellt wird. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig3.jpg" /> Abbildung 3. Magnetic Beads Capture-Affinität von verschiedenen Poliovirus-Antigenen durch Nanobody Nb1 </strong&gt;. Der Anteil der Radioaktivität im Überstand gefunden wird als eine Funktion der Konzentration von Nb1 dargestellt. Nb1 ist bekannt, dass keine Interaktion mit beliebigen Poliovirus-Antigen oder-Untereinheit haben. Da 100% der Radioaktivität im Überstand gefunden wird, war kein Virus nicht-spezifisch an Nb1 gebunden. Der Verlust an Radioaktivität in 2 ist daher nur durch die spezifische Affinität des Nanobody gegenüber ihren Antigenen. <img alt="Abbildung 4." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig4.jpg" /> Abbildung 4. Reproduzierbarkeit des Tests. Der Mittelwert der Anteil Radioaktivität im Überstand wird in Abhängigkeit von der Konzentration des Nanobody dargestellt. Das Experiment wurde achtmal an verschiedenen Tagen und von verschiedenen Personen wiederholt. Die Standardabweichung wird als vertikale Balken dargestellt.

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	<li>Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antiviral+activity+of+single+domain+antibody+fragments+against+poliovirus.">In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus.</a> Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).</li><li>Meloen, R. H., Briaire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+cross-reacting+antigens+on+the+intact+foot-and-mouth+disease+virus+and+its+12S+subunits+with+antisera+against+the+structural+proteins.">A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins.</a> J. Gen. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+antigens+from+cells+with+a+staphylococcal+protein+A-antibody+adsorbent:+parameters+of+the+interaction+of+antibody-antigen+complexes+with+protein+A.">Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A.</a> J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).</li><li>Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. a. j. y. a. n. a., Bendahman, E., N, ., Hamers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li><li>Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+identification+of+single+domain+antibody+fragments+from+camel+heavy-chain+antibodies.">Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.</a> FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+domain+camel+antibodies:+current+status.">Single domain camel antibodies: current status.</a> Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).</li><li>Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+evolution+in+poliovirus+maturation.">Epitope evolution in poliovirus maturation.</a> Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).</li><li>Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridoma+antibodies+to+poliovirus+N+and+H+antigen.">Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen.</a> Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).</li><li>Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+quantitative+affinity+capturing+assay+of+poliovirus+antigens+and+subviral+particles+by+single-domain+antibodies+using+magnetic+beads.">A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads.</a> J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).</li><li>Wild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immunoassay Handbook. , (2005).</li><li>Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+of+human+rhinovirus+capsid+and+analysis+by+capillary+electrophoresis.">Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis.</a> Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).</li><li>Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolar+endocytosis+of+simian+virus+40+reveals+a+new+two-step+vesicular-transport+pathway+to+the+ER.">Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER.</a> Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

In dem Protokoll wird die Radioaktivität des Antigens Interaktion mit dem Nanobody als Verlust von radioaktiv markiertem Virus aus dem Überstand definiert. Daher ist die Menge des ausgefällten Radioaktivität (= 100 - a%) (gebunden an die magnetischen Beads) in einer indirekten Weise durch die Radioaktivität im Überstand (= a%) geschätzt werden. Auf der anderen Seite ist es auch möglich, die Radioaktivität des gebundenen Fraktion ausgefallene von Antigen in direkter Weise durch Elution der Immunkomplexe von den ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Name des Reagenzes</strong</td&gt;<td<strong&gt; Unternehmen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog-Nummer</strong</td&gt;<td<strong&gt; Kommentare</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dynabeads His-Tag Isolierung und Pulldown</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 101.03D</td&gt;<td&gt; Magnetic Beads</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Optiphase &#39;Hisafe&#39; 2</td&gt;<td&gt; Perkin Elmer</td&gt;<td&gt; 1200 - 436</td&gt;<td&gt; Szintillationsflüssigkeit</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

a liquid phase affinity capture assay using magnetic beads to study protein-protein interaction: the poliovirus-nanobody example

In diesem Artikel wird eine einfache, quantitative, flüssigen Phase Affinität Capture-Assay vorgestellt. Vorausgesetzt, dass ein Protein markiert werden kann und ein anderes Protein markiert, kann dieses Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen durchgeführt werden. Es wird einerseits auf der Erkenntnis des markierten Proteins durch Kobalt beschichteten magnetischen Kügelchen und auf der anderen Seite auf der Wechselwirkung zwischen dem markierten Proteins und einer zweiten spezifischen Protein, das markiert ist bezogen. Zuerst werden die markierten und markierte Proteine ​​gemischt und bei Raumtemperatur inkubiert. Die magnetischen Perlen, die das Tag zu erkennen, werden zugegeben und der Anteil an gebundenem markierte Protein wird aus der ungebundenen Fraktion mit Hilfe von Magneten getrennt. Die Menge an markiertem Protein, das erfasst werden auf eine indirekte Weise durch Messen des Signals des markierten Proteins blieb in der ungebundenen Fraktion bestimmt werden. Die beschriebene flüssige Phase Affinitätsassay ist extrem nützlich, wenn Konformationsänderung Umwandlung empfindliche Proteine ​​Esel sindAyed. Die Entwicklung und Anwendung des Tests ist für die Interaktion zwischen Poliovirus und Poliovirus erkennen Nanobodies 1 demonstriert. Da Poliovirus ist empfindlich gegenüber Konformationskonversion 2, wenn an einer festen Oberfläche (unveröffentlichte Ergebnisse) befestigt ist, ist die Verwendung von ELISA begrenzt und eine flüssige Phase System sollten bevorzugt werden. Ein Beispiel einer flüssigen Phase System auch an den polioresearch 3,4 verwendet wird, ist die Mikro-Protein A-Immunpräzipitation Test 5. Auch wenn dieser Test seine Anwendbarkeit unter Beweis gestellt hat, bedarf es eines Fc-Struktur, die es in den Nanobodies 6,7 ist. Doch als eine weitere Gelegenheit, lassen sich diese interessante und stabile Single-Domain-Antikörper 8 leicht mit verschiedenen Tags konstruiert werden. Die weit verbreitete (His) 6-Tag Affinität für zweiwertige Ionen, wie Nickel oder Kobalt, das an der Reihe leicht auf magnetischen Kügelchen beschichtet sein zeigt. Wir haben deshalb diese einfache quantitativeAffinität Capture-Assay auf Kobalt beschichteten magnetischen Kügelchen basiert. Poliovirus wurde mit 35 S markiert, um ungehinderten Interaktion mit den Nanobodies ermöglichen und um eine quantitative Erfassung möglich. Das Verfahren ist einfach durchzuführen und kann mit geringen Kosten, die durch die Möglichkeit der wirksamen Regeneration der magnetischen Beads unterstützt wird festgelegt.

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A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In diesem Artikel wird eine einfache, quantitative, flüssigen Phase Affinität Capture-Assay vorgestellt. Es ist eine zuverlässige Technik auf der Wechselwirkung zwischen magnetischen Kügelchen und markierten Proteine ​​(zB Nanokörper) einerseits und der Affinität zwischen dem markierten Protein und einem zweiten, markierten Proteins (zB Poliovirus) auf der anderen Seite.

Eine flüssige Phase Affinity Capture Assay Verwendung von magnetischen Kügelchen, um Protein-Protein Interaktion Studie: Das Poliovirus-Nanobody Beispiel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

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11.8K Aufrufe.  Vrije Universiteit Brussel. In diesem Artikel wird eine einfache, quantitative, flüssigen Phase Affinität Capture-Assay vorgestellt. Es ist eine zuverlässige Technik auf der Wechselwirkung zwischen magnetischen Kügelchen und markierten Proteine ​​(zB Nanokörper) einerseits und der Affinität zwischen dem markierten Protein und einem zweiten, markierten Proteins (zB Poliovirus) auf der anderen Seite.

Serie: A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Forschung

Biologie

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen in Onion Zellen unter Verwendung des Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

Umbau eines Capture-ELISA zu einem Luminex xMAP Assay unter Verwendung eines Multiplex-Antikörper-Screening-Methode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluorescence Komplementierung: A High Throughput Quantitative Methode zur Protein-Protein Interaction Study

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads von Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron regulatory proteins, IRP1 and IRP2. They bind to iron responsive elements (IREs) within the untranslated regions (UTRs) of several target mRNAs, thereby controlling the mRNAs translation or stability. IRE/IRP interactions have been widely studied by EMSA. Here, we describe the EMSA protocol for analyzing the IRE-binding activity of IRP1 and IRP2, which can be generalized to assess the activity of other RNA-binding proteins as well. A crude protein lysate containing an RNA-binding protein, or a purified preparation of this protein, is incubated with an excess of32 P-labeled RNA probe, allowing for complex formation. Heparin is added to preclude non-specific protein to probe binding. Subsequently, the mixture is analyzed by non-denaturing electrophoresis on a polyacrylamide gel. The free probe migrates fast, while the RNA/protein complex exhibits retarded mobility; hence, the procedure is also called &#8220;gel retardation&#8221; or &#8220;bandshift&#8221; assay. After completion of the electrophoresis, the gel is dried and RNA/protein complexes, as well as free probe, are detected by autoradiography. The overall goal of the protocol is to detect and quantify IRE/IRP and other RNA/protein interactions. Moreover, EMSA can also be used to determine specificity, binding affinity, and stoichiometry of the RNA/protein interaction under investigation.

Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Here we present a protocol to analyze RNA/protein interactions. The electrophoretic mobility shift assay (EMSA) is based on the differential migration of RNA/protein complexes and free RNA during native gel electrophoresis. By using a radiolabeled RNA probe, RNA/protein complexes can be visualized by autoradiography.

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) für das Studium von RNA-Protein-Wechselwirkungen: Die IRE / IRP Beispiel

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genomweite Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Screening Protein-Fragment Komplementierungsassay (PKA) in lebenden Zellen

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.