Wir danken Professor Brian T. Chait für seine wertvolle Ratschläge, Unterstützung und Zugang zu MS-Geräten, sowie Ms. Kelly R. Molloy für einen ausgezeichneten technischen Support. Wir danken Frau Kelly Bare für die Unterstützung mit Lektorat. Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH Zuschüsse P41GM109824, P41GM103314 und P50GM107632 unterstützt.

The authors declare that they have no competing financial interests.

Diese drei Protokolle arbeiten im Tandem (1) bereiten Zellen für Festkörperbruch durch Cryomahlung, (2) erreichen Bruch in einer Planetenkugelmühle, und (3) erzeugen Extrakte aus Zellpulver capture ein Protein von Interesse in Komplex Affinität seine physiologische Interaktoren. Viele verschiedene Zell - Lyse Techniken existieren, einschließlich der mechanischen / physikalischen Ansätze unter Verwendung von Brech Auswirkungen, Scheren, und / oder Druck, sowie chemische / enzymatische Ansätze, die jeweils mit unterschiedlichen Vor- und Nachteile 49,50. Jeder Ermittler wird ermutigt , Methoden am besten geeignet für ihre Analysen zu erforschen, wenn man bedenkt, dass jeder gewählte Ansatz für Zellbruch und Proteinextraktion ist wahrscheinlich Verzerrungen einzuführen 51,52 erfordert empirische Optimierung (siehe unten). Mechanische Verfahren können hohe Wärme und / oder Scherkräfte erzeugen, die Proteinkomplexe stören können. Cryomahlung vermeidet Erwärmungseffekte durch LN 2 Kühlung der Proben für die t Einsatzer die Dauer des Prozesses. Planetenkugelmühlen verstanden beim Aufprall und Reibungskräfte zu stützen, einschließlich Scherspannung, als Komponenten von Teilchengrößenverringerung 53,54. Bei den Einstellungen berichteten wir haben nicht Degeneration von Proteinkomplexen beobachtet. Tatsächlich haben wir extrahiert und abgerufen anscheinend intakt ~ 50 MDa Kernporenkomplexe 11 und enzymatisch aktiven Retrotransposons ausstellenden höhere spezifische Aktivität als Zubereitungen &quot;sanften&quot; Waschmittel-Lyse - 7 verwendet. Chemische / enzymatische Verfahren der Zelllyse leiden unter der Einschränkung , dass der Inhalt der Zelle in einer in vitro Milieu freigesetzt werden, die die Zerstörung der Zellmembranen und strukturellen Makromoleküle unterstützt , aber nicht für die Aufrechterhaltung der Integrität des Proteinkomplexes (es geeignet sein , ) von Interesse. Häufig weder die Bestandteile der Komplexe mit dem Protein von Interesse gebildet wird, noch die Bedingungen benötigt die Ziel-Komplexe zu stabilisieren sindim voraus bekannt. Ein großer Vorteil von Solid-State-Fräsen ist, dass Bruch und Extraktion entkoppelt sind, Quellenmaterial ermöglicht, frei von zugesetzten Flüssigkeit gelagert (bei -80 ° C oder darunter), angehäuft und bequem abgerufen für On-Demand-Experimente vorbereitet zu sein; zB zu erforschen in vitro Bedingungen für Affinitätseinfangen optimiert. Protein - Wechselwirkungen sind am stabilsten bei hoher Konzentration 55,56, also das Volumen an Extraktionsmittel minimiert werden können zur Konservierung von physiologischen Wechselwirkungen vorteilhaft sein. Auf der anderen Seite gibt es praktische Erwägungen - die Proteinkomplexe aus den Zellen aufgetrennt werden müssen und in eine nicht-viskosen wäßrigen Phase, frei von unlöslichen Aggregaten, um die Ziel-Komplexe mit dem Affinitätsmedium zu mischen. Darüber hinaus einige Standardisierung und Kontrolle über die in vitro - Umgebung (pH, Salzkonzentration, etc.) ist für Systematisierung und Reproduzierbarkeit benötigt. Wir finden, dass Extrakte produced im Verdünnungsbereich von 1: 4-1: 9 (w: v) erfüllen praktische und theoretische Anliegen, qualitativ hochwertige Ergebnisse liefert. Zusätzlich Extrakt der optimale Anteil von Zellmedium Bedürfnisse Affinität zu bestimmen. Dies wird empirisch durch Titration von Extrakten mit unterschiedlichen Mengen an Affinitätsmedium durchgeführt und nachweisbaren Wirkungen auf das Signal-zu-Rausch-Verhältnis des Experiments haben kann, weiter unten diskutiert. Eine ausgezeichnete Abreicherung des Zielproteins ist typischerweise ≥70% der löslichen Fraktion des Zielproteins, aber&gt; 90% ist wünschenswert und kann bei sorgfältiger Parametrisierung der Extraktionsbedingungen erreichbar sein. Viele solche praktischen Erwägungen sind in Bezug auf die 1 abgedeckt. Paramagnetische Perlen werden unter Verwendung von Neodym-Magneten in einem spezialisierten Mikrorohrhalter manipuliert, obwohl hausgemachte Alternativen lebensfähig sind. Wenn innerhalb des Halters angeordnet ist, sammeln Perlen an der Seite des Rohrs unter dem Einfluß des Magnetfeldes. Die Lösungen können dann ohne di entfernt werdenstörendes, die Perlen. Eine Einschränkung des präsentierten Kryomahlen Protokoll, entwickelt mit der Planetenkugelmühle verwendet hier (siehe Tabelle of Materials), ist , dass eine minimale Menge an Material benötigt wird , um effektiv Mühle und erholen Zellpulver mit diesem Gerät (&gt; 1 g). Solche Mengen sind leicht mit vielen Mikroben, Zelllinien und Modellorganismen, und auch oft mit Gewebe von Versuchstieren ausgeschnitten erreicht werden. Jedoch können bestimmte Zelllinien sehr schwierig sein, in Hülle und Fülle und tierischen Geweben wachsen kann knapp werden. Kleinere Mengen von Material vergleichbar ist mit anderen Geräten verwendet kleinere Behälter gefräst, auch wenn er möglicherweise auf das Opfer des Pulverfeinheit erreicht. Darüber hinaus werden die Kosten für die mechanischen Mahlvorrichtungen können unerschwinglich teuer für einige Laboratorien. Kryomahlen kann 14-19, einschließlich die meisten affordably von Hand mit einem Schädling unter Verwendung einer Anzahl von alternativen Konfigurationen erreicht werdenle und Mörtel, obwohl Brucheffizienz erheblich sinkt. Affinitätseinfang Protokolle zielen typischerweise für eine hohe Effizienz der Zelllyse maximale Proteinextraktion in die Lösung zu erleichtern, und somit die maximale Potenzial zur Erfassung der Zielproteinkomplexen. Auf der anderen Seite ist es für die Hefe in vitro Spleißen nachgewiesen Extrakte , die maximale Lyse nicht mit maximal in vitro biochemische Aktivität 57,58 gleichsetzen kann. Wir haben solche Probleme nicht in den Systemen beobachteten wir bisher getestet haben, und deshalb nicht einschränken gezielt unsere Zellbruch, wenn Cryomahlung. Dennoch sollte diese Möglichkeit berücksichtigt werden , wenn für die in vitro enzymatische Tests zu optimieren. Obwohl Kryomahlen ein hochwirksames Verfahren zum Brechen von Zellen ist, profitiert eine begrenzte Menge an Beschallung oft die Herstellungs homogenen Gesamtzellextrakten aus Säugetiergeweben, weil inhomogenen Aggregate manchmal durch visuelle Untersuchung beobachtet werden kann: typischerweisein Extraktionsbedingungen unter Verwendung von geringen Salz (100-300 mM) und nicht-ionisches Detergens (0,1 bis 1% v / v) -Konzentrationen zu moderieren. Da wir festgestellt, daß die Anwesenheit dieser Aggregate kann die Ausbeute und / oder Qualität der nachfolgenden Affinitätseinfangen reduzieren, setzen wir routinemßig Beschallung sie zu dispergieren (selbst wenn sie nicht mit dem bloßen Auge beobachtet). Die Aggregate sind konsistent mit agglomerierten Membranfragmenten, vergleichbar mit den vorher in Extrakten aus gemahlenen Hefezellen 58 berichtet. Beschallen wird auch in einigen Protokollen verwendet, um DNA zu scheren und Chromatin-Fragmente in die Lösung freisetzen, aber der Grad der Beschallung in diesem Protokoll angewandt nicht merklich Fragment DNA. Die begrenzte Verfügbarkeit (oder die hohen Kosten) eines ausgezeichneten Affinitätsligand oder Antikörper gegen das jeweilige Protein von Interesse kann ein weiteres Hindernis sein. Eine Vielzahl von im Handel erhältlichen Affinitätsreagentien genutzt werden kann, wenn das Modellorganismus genomische Tagging oder tr zugänglich istansfection mit ektopischer Expressionsvektoren, die Expression von Proteinen von Interesse als Affinitäts getaggt Fusionen ermöglicht. Allerdings hat sich die Produktion von kundenspezifischen Antikörpern zunehmend möglich und sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper lassen sich hervorragend in Affinität Capture-Anwendungen auszuführen. Diese vielen Überlegungen werden auch in grßerem Detail in Bezug auf 1 behandelt. Beispiele, wie die Zell - Lyse - Methode und die Wahl der Affinitätsmedium können die Ergebnisse beeinflussen , sind in Abbildung 1 dargestellt. Beispiele von verschiedenen Extraktionsmitteln ausgeübten Effekte können in Referenzen 1,11,24 erkennbar. Da diese und andere experimentelle Parameter die Qualität der Affinitätseinfangen beeinflussen, was es schwierig macht FPs zu unterscheiden, Repositories von &quot;Perle Proteome&quot; und rechnerische Ansätze zur Beseitigung nicht-spezifische Verunreinigungen wurden bei der Identifizierung von FPs 40-43 zu unterstützen , entwickelt. Dennoch solche Ansätze nur substitute für eine optimale Probenvorbereitung in begrenztem Umfang 59. Best Practices Beobachtung und Optimierung empirisch die Affinität Capture Experiment wird die höchste Qualität Proben für die Downstream-Analysen liefern, weiter unten diskutiert. Eine leicht implementiert Praxis, die Reinheit der Probe verbessern kann, ist, nativen Elution. Einheimische Elution wird am häufigsten zu erhalten, die Affinität isolierten Proteinkomplex, intakt, für weitere Experimente verwendet; aber wie es häufig Probenreinheit verbessert, kann sie auch aus diesem Grund allein verwendet werden. Wie jedoch II in 1, Panel demonstriert, in dem Zellextrakt auf einer genauen Titration der Menge der Affinitätsmedium der Fülle des Zielproteins hängt die Fähigkeit der nativen Elution Probenreinheit verbessern kann - wenn das Medium im Überschuss nicht besetzte Paratope kann die off-Target-Anreicherung von FP-Proteine ​​beobachtet werden in den nativ eluierten Fraktionen ermöglichen. Mit den Reagenzien und Verfahren hier beschrieben, es hwie unsere Erfahrung, dass die größte einzelne Beiträger von FPs unseren Experimenten ist das markierte Protein selbst einmal aus dem Kontext der lebenden Zelle entfernt. (Fig. 1 Abschnitt II und Fig. S1). In solchen Fällen Elternzelllinie Kontrollen, die irrelevant Proteome in Abwesenheit des Antigens ergeben sind ohne praktischen Wert; ebenfalls für Tag-only oder Spike-in Kontrollen, aber das Zielantigen frei von irgendetwas sind. Deshalb, wenn praktisch wir I-DIRT 7,38, zu implementieren , die direkt um die Ansammlung von post-Lyse Protein - Wechselwirkungen mit quantitativen MS misst. Als 3.2.7 des Protokolls in Schritt erwähnt, Verfahren für native Elution wird verwendet, um mit den Details der Affinität System variieren. Nativer Elution wird am häufigsten durch kompetitive Verdrängung des markierten Proteinkomplex oder proteolytische Spaltung des Tags, die Freigabe des Komplexes aus dem Affinitätsmedium erreicht. Mehrere Affinität Systeme von kleinen Epitop-Tags enthalten existieren, for , die das Epitop selbst ist nützlich für kompetitive Elution der markierten Proteinkomplexe 60 als Peptid erhältlich. Ebenso sind mehrere Proteasen zur Verfügung , um spezifisch verwandtes Websites markierten Fusionsproteine 61 strategisch in Affinität platziert spalten. In Abhängigkeit von den Besonderheiten der ausgewählten Affinität Systemen kann die geeignete Elution Schema übernommen werden. Im Allgemeinen erhalten die Qualität der Ergebnisse maßgeblich von der Qualität der Probenvorbereitung erheblich belastet werden. Es ist wichtig, sorgfältig und präzise durch die einzelnen Schritte dieser Protokolle zu arbeiten, und so schnell wie möglich, während Sorgfalt und Präzision. Es empfiehlt sich, die Aufteilung des Proteins von Interesse durch die einzelnen Schritte zu verfolgen, die Effizienz jeder Manipulation zu verstehen. Zum Beispiel: wie reichlich ist das Protein von Interesse in der Zelle oder eines Gewebes in Frage? Vielleicht ist das Protein untersucht (und seine Komplexe) wird eine Herausforderung sein Massen zu charakterisierenSpektrometrie aufgrund geringer Menge. Wenn die gereinigten Komplexe nachweisbar durch die allgemeine Proteinfärbung sind (etwa Nanogramm-Bereich) ist die Massenspektrometrie wahrscheinlich erfolgreich zu sein. Wenn das aufgenommene Protein von Interesse kann nur durch empfindliche verstärkten chemolumineszenten Western Blot (etwa Picogramm-Bereich) erfasst werden kann, ist die Massenspektrometrie weniger wahrscheinlich, um wirksam zu sein. Selbst wenn das Protein von Interesse in der Zelle reichlich vorhanden ist, wie reichlich ist es in der Zellextrakts? Hat das Protein Partition zu der Lösung, oder ist es im Pellet? Wenn letzteres kann eine neue Extraktionslösung entwickelt werden, dass die Erholung verbessern können. Sobald der Zellextrakt mit dem Affinitätsmedium kombiniert wird, wie effektiv erfasst das Protein? Hat das Protein bleiben durch nachfolgende Wäschen gebunden? Was ist mit anderen copurifying Proteine? Durch die Einsparung eines aliquoten jeder Probe an geeigneten Schritte des Protokolls diese Fragen leicht beantwortet werden können, in der Regel mittels Western Blot gegen das Protein von Interesseoder allgemeine Proteinfärbung, aber auch andere Assays können ebenfalls geeignet sein. jeder Schritt der Optimierung wird die Ausbeute und Reinheit der aufgenommenen Komplexe verbessern, obwohl es ein Kompromiß sein kann, in die Maximierung einer Eigenschaft oder der anderen durchgeführt werden. Eine typische Anwendung von Affinitätseinfangen für viele Forscher ist Kandidat in vivo - Inter für eine kleine Anzahl von Proteinen von Interesse zu identifizieren; Diese Kandidaten werden üblicherweise zur Validierung durch orthogonale Ansätze in vivo unterzogen , die biologische Bedeutung der physikalischen Interaktionspartner zu demonstrieren. Affinitätseinfang wird auch durch Hochdurchsatz - Studien eingesetzt zu erzeugen Listen von Proteinen copurifying auf einem (fast) Proteom weit beobachtet, die Erleichterung Rechen Schlüsse mutmaßlichen über in vivo - Komplexen. Zahlreiche Beispiele für solche Studien können in der Literatur gefunden werden. Dieser Ansatz verzichtet auf die Optimierung der Bedingungen der Aufnahme für einen bestimmten Ziel zugunsten der Erforschung der Menschy Ziele; Als solche sind die abgeleiteten Komplexe sich selten vollständig intakt und hochreine in jeder gegebenen Probe entnommen. Vielmehr werden als Grundlage der Schlussfolgerungen 42 verwendet die Teil Überschneidungen in Zusammensetzungen zwischen zahlreichen deutlichen Affinitäts erfassten Proben beobachtet. Beide Ansätze beitragen wertvolle Daten zu unserem Verständnis des Interaktom. Dennoch ist ein großer Vorteil der Affinitätseinfang, dass es häufig die Möglichkeit anbietet, die Komplexe intakt und hoch gereinigter zu erhalten, vorausgesetzt, dass die Bemühungen das Verfahren zu optimieren, hergestellt werden. Wir glauben , dass die Zukunft des Ansatzes liegt die Leichtigkeit und Effizienz zu optimieren , um die Erfassung von endogenen Proteinkomplexe 11, für eine genauere Beurteilung der Skala der physiologischen Interaktoren und häufigere Verwendung in weiteren nachgelagerten biochemischen, enzymologischer und strukturelle Untersuchungen bei der Steigerung, zB verweist 7,9,23.

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated from:
<ol start="29">
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
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to:
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Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Eine typische Anwendung der vorgestellten Verfahren ist zu stabilisieren und eine hohe Ausbeute und Reinheit des endogenen Proteinkomplexe von Interesse für interactomic Charakterisierung 1 erhalten. Es versteht sich, dass die dynamische Netzwerke beider stabil und transient makromolekularen Komplexen verbunden sind , die hauptsächlich aus Proteinen besteht, zelluläre Prozesse 2,3 orchestriert. Zwar gibt es viele experimentelle Ansätze zur Identifizierung von Protein-Protein - Wechselwirkungen sind, ist Affinitätseinfangen unter den am häufigsten verwendeten Methoden zur Isolierung und physiologischen Proteinkomplexe 4-6 sezieren. Darüber hinaus hat diese Technik den Vorteil, die makromolekulare Komplexe als physikalische Einheiten ergibt, nicht nur als Datenpunkte in einem Auslese; Vorteilhafterweise können die erhaltenen Komplexe somit in einer Vielzahl von zusätzlichen nachgeschalteten biochemischer, enzymatischer und strukturelle Assays 7-9 verwendet werden. Die vorgestellten Protokolle wurden in Reaktion auf die Notwendigkeit entwickelt abzubilden protein-Protein-Interaktionsnetze und makromolekulare Komplexe in ihrer Rolle als die Effektormoleküle der Zellbiologie charakterisieren. Sie sind detailliert in Bezug auf ihre Anwendung auf Säugetierzellen in Gewebekultur gezüchtet, sind jedoch gleichermaßen anwendbar auf einen weiten Bereich von biologischen Proben bei entsprechender systemspezifische Optimierungen. Die Geschichte der Affinitätseinfangen reicht zurück bis in den frühen zwanzigsten Jahrhunderts mit den ersten Immunaffinitätschromatographie Experimente - ähnlich, was man gemeinhin als Immunpräzipitation (IP) zu heute bezeichnet wird - von den frühen 1950er Jahren in der Literatur erscheinen. Mainstream Einsatz der Technik weiter durch die Jahrhundertwende der vorliegenden 10-13 entwickelt. Diverse Zell- und molekularbiologische Untersuchungen wurden durch Mahlen bei kryogenen Temperaturen zumindest in den letzten vierzig Jahren 14-19 mechanischen Bruch der Zellen verwendet werden ; und molekulare Trennungen unter Verwendung von (Super) paramagnetischen Perlen haben become immer häufiger in den letzten zwei Jahrzehnten 20. Die Kombination dieser unterschiedlichen Technologien hat dazu gedient , um synergistisch die Ergebnisse zu verbessern , die mit 1 in Proteinkomplex Affinitätseinfangen Experimente erhalten werden können, wie dies durch einen umfangreichen Werk von uns selbst und der breiteren Forschungsgemeinschaft produziert belegt 7,9,11,18,19,21 -23. Stütz Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt. Eine Sammlung von Einschränkungen und Überlegungen für effektive Affinitätseinfangen Experimente ausführen können in Bezug auf die 1 gefunden werden. Typischerweise ist dieser Ansatz am besten geeignet: (I) die Interaktionspartner eines Proteins von Interesse katalogisieren, dh Protein - Massenspektrometrie (MS) verwenden bisher unbekannte copurifying Proteine (explorative Analyse) zu identifizieren; (II) Assay auf das Vorhandensein eines bestimmten Wechselwirkungspartner, dh verwenden MS oder Western blot ein bestimmtes Protein oder begrenzten Satz von Proteinen in Verdacht nachzuweisenagieren mit dem Protein von Interesse (Hypothesentests); oder (III) vorbereiten endogen montiert Proteinkomplexe, die das Protein von Interesse für eine weitere Studie durch zusätzliche Techniken (präparative Aufarbeitung) enthält. Bevor Sie sich auf eine Affinitätsabfang-experimentelle Regime ist es absolut wichtig, eine qualitativ hochwertige Affinitätsreagens zu haben, die an das Zielprotein bindet, in der Regel eine IP-kompetenten Antikörper gegen das native interessierende Zielprotein oder gegen einen Tag zu einem Fusionsprotein angehängt. Es ist auch wichtig, geeignete Methoden der experimentellen Auslese an Ort und Stelle haben: allgemeine Proteinfärbung (wie Coomassie-Blau, Sypro Ruby oder Silber, nach SDS-PAGE), Western Blot und Protein-MS sind alle häufig in Verbindung mit Affinität Capture verwendet 1. Die vorgestellten Protokolle verwenden Antikörper konjugierten magnetischen Kügelchen als Affinitätsmedium. Während die Funktion des Affinitätsmedium kann zunächst in Tests validiert werden, die einige experimentelle Parameter nutzen, umerhalten die besten Ergebnisse sollte jedes Experiment empirisch 1,11,24 optimiert werden. Die Protokolle sind in drei unterscheidenden Phasen getrennt: (1) Herstellung von gefrorenen Zellmaterial; (2) Zellbruch durch Festkörper-Fräsen bei kryogenen Temperatur; und (3) Proteinextraktion und Affinitätseinfangen unter Verwendung von Antikörper-gekoppelten paramagnetischen Kügelchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1304">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Growth media &#38; cell culturing implements</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:403px;">For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500 cm^2 culture dishes</td>
			<td style="width:172px;">Corning</td>
			<td>431110</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large beaker (1-2L)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rectangular ice pan&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-900-747</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large cell scrapers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid nitrogen&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml Luer lock syringe</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur lock syringe caps</td>
			<td>www.dymax.com</td>
			<td>T11182</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml tube rack, 4 position</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Planetary ball mill, PM 100&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.540.0001&#160;</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling jar, 50 ml&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>01.462.0149</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling balls, 20 mm &#216;&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>05.368.0062</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm&#160;&#160;</td>
			<td style="width:172px;">www.marcorubber.com</td>
			<td>T1044-2.62x44.63</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">mini-LN2 decanter</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">see Ref 19</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 ml PTFE jar insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">Retsch</td>
			<td style="width:164px;">custom order</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">PTFE puck insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">The Rockefeller University</td>
			<td>For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional)</td>
			<td style="width:172px;">http://www.leeimh.com/</td>
			<td style="width:164px;">558 series check valve</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">1.5 - 2 ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Extractant</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:567px;">cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:172px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:164px;">11873580001</td>
			<td style="width:403px;">For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Microtip sonicator, Q700</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">Q700</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low intensity 1/16&#8221; microtip probe</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">4717</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Bench-top refrigerated microcentrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Dynabeads M-270 Epoxy</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:164px;">14302D</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III); see reference 19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Sample rotator&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Neodymium magnet</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:164px;">123-21D&#160;</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">DTT</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Protein Stain</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells

Affinitätseinfang ist eine wirksame Technik für die endogene Proteinkomplexe für die weitere Untersuchung zu isolieren. Wenn sie in Verbindung mit einem Antikörper verwendet wird, wird diese Technik auch als Immunpräzipitation häufig bezeichnet. Affinitätseinfangen in einer Labormaßstab und in einer Hochdurchsatz-Rahmen angewendet werden. Wenn sie mit Protein-Massenspektrometrie gekoppelt, Affinitätseinfangen hat sich als Zugpferd der Interaktom Analyse. Obwohl es möglicherweise viele Möglichkeiten gibt, beteiligt die zahlreichen Schritte auszuführen, implementieren die folgenden Protokolle unsere bevorzugte Methoden. Zwei Merkmale sind unverwechselbar: die Verwendung von cryomilled Zell Pulver Zellextrakten zu produzieren, und Antikörper-gekoppelten paramagnetischen Kügelchen als Affinitätsmedium. In vielen Fällen haben wir überlegene Ergebnisse zu denen mit konventionelleren Affinitätseinfangen Verfahren erhalten wurde. Kryomahlen vermeidet zahlreiche mit anderen Formen von Zellbruch verbundenen Probleme. Es sorgt für eine effiziente Bruch des Materials bei gleichzeitiger Vermeidung denatration Probleme mit Heizung oder Schäumen verbunden. Es behält die native Proteinkonzentration bis zu dem Punkt der Extraktion, makromolekulare Dissoziation zu mildern. Es reduziert die Zeit extrahierten Proteine ​​in Lösung zu verbringen, schädliche enzymatischen Aktivitäten zu begrenzen, und es kann die nicht-spezifische Adsorption von Proteinen durch das Affinitätsmedium zu reduzieren. Micron-Skala magnetischen Affinitätsmedien haben mehr alltäglich in den letzten Jahren geworden, immer mehr die traditionellen Agarose- ersetzt und Sepharose-basierte Medien. Primäre Vorteile von magnetischen Medien umfassen typischerweise geringere nicht-spezifische Protein-Adsorption; keine Größenausschlussgrenze, da Protein-Komplex tritt eher auf der Oberfläche der Kügelchen Bindung als in den Poren; und eine einfache Manipulation und Handhabung mit Hilfe von Magneten.

Abbildung 1, Tafel I zeigt , dass Kryomahlen und magnetische Kügelchen können zusammen Probenqualität weiter zu verbessern. Paneele IA-C zeigen , daß das Material des unlöslichen Medium für den Affinitätseinfang verwendet , umfassend 19 des wiedergewonnenen Proteom beeinflussen können. Das Protein von Interesse, gereinigter FLAG-markiertes bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP), wurde in menschlichen Zellextrakten versetzt. BAP wird erwartet, dass nicht speziell zur Interaktion und menschliche Proteine ​​copurify. Die Signatur copurifying Proteine, beurteilt durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung, variiert je nach dem verwendeten Medium. Micron Maßstab magnetischen Kügelchen zeigte die sauberste Profil, mit einem relativ niedrigen Niveau der unspezifischen Proteinadsorption hindeutet. Platten-ID und IE zeigen, daß das Verfahren der Zelllyse auch die zurückgewonnene Proteom beeinflussen können. In dem gegebenen Beispiel ist ein endogenes Protein - Komplex (der NEXT - Komplex 37), wurde Affinität captu ausgesetztre von cyromilled oder beschallte Zellextrakten 19. Weniger hohe Massen Verunreinigungen wurden beobachtet, wenn der Zellextrakt aus cryomilled Zellpulver hergestellt wurde. Eine Herausforderung bei der Affinität Capture mit endogenen Proteinkomplexen zu untersuchen ist, dass es schwierig sein kann, bona fide physiologischen Interaktoren des Proteins von Interesse von False Positives (RP) zu unterscheiden. FPs können aus vielen Quellen entstehen, einschließlich der nicht-spezifischen Adsorption an Rohren und Behältern, die Affinitätsmedium, dem Antikörper oder Affinitätsliganden, und / oder an das Protein von Interesse selbst. Als Ergebnis müssen erhebliche Anstrengungen zur Optimierung der Erfassungsprozess gewidmet. Der Nachweis von FPs bleibt eine zentrale Herausforderung für die eine große Anzahl von unterschiedlichen Werkzeugen entwickelt wurden, einschließlich experimenteller 38-40 und rechnerische Ansätze 41-43, die jeweils mit unterschiedlichen Vor- und Nachteile. In eigenen Versuchen stellten wir fest, die zuvor ein Muster von FP Proteinbindung, erhalten nach Inkubation von α-FLAG magnetisches Medium mit Kontroll-Zellextrakten, war, daß die sich von dem Muster in Gegenwart erhaltenen 3xFLAG-markierte Proteine. Darüber hinaus könnten diese FPs aus dem Medium durch die Inkubation mit Peptid 3xFLAG 7 freigegeben. Diese Beobachtung ist konsistent mit opportunistischen Bindung von FPs an die α-FLAG Paratop in Abwesenheit des verwandtes Epitop. die Natur dieser FP Hintergrund zu verstehen, ist wichtig, da viele Studien unmarkiert &quot;Elternzelllinie&quot; als Scheinkontrolle für Affinitätseinfangen verwenden; Diese Kontrollen können daher nicht angemessen sein, um die Spezifität der Wechselwirkung mit dem markierten Protein zu bestimmen. Um den Hintergrund zu bestimmen, die Bindung von unseren Affinitätsmedium beigetragen, wenn Antikörper Paratope besetzt sind oder nicht, durchgeführt wir mock Affinitätseinfangen Experimenten unter Verwendung von α-FLAG magnetischen Medium und HEK 293T-Zellextrakte (kein tagged Protein exprimiert) in Gegenwart oder Abwesenheit eines 3xFLAGPeptid-Spike-in. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1, Tafel II gezeigt. Kurz gesagt, wurde für 30 min in Zellextrakten (von ≳10 mg / ml Gesamtprotein), enthaltend 500 mM NaCl und 1% v / v Triton X-100 in 20 mM HEPES-Na, pH 7,4, inkubiert magnetischen Medium α-FLAG. Das Medium wurde dann mit 1 mg / ml 3xFLAG Peptid inkubiert, um kompetitiv alle Proteine ​​an die α-FLAG Paratop nativ oder mit SDS-PAGE-Probenpuffer gebunden verdrängen eine denaturierende Elution zu erreichen. Zusätzlich wurde das gleiche Experiment durchgeführt, wenn die Zellextrakte mit 1 ug / ml und 10 ug / ml Peptid 3xFLAG versetzt wurden. Alle eluierten Fraktionen wurden auf SDS-PAGE und Silberfärbung unterzogen. Wir beobachteten , dass in Abwesenheit von seinem verwandten Epitops, α-FLAG Medium eine detektierbare Pegel des Hintergrundproteine nicht erfassen , die mit 3xFLAG Peptid eluiert werden kann - in der durch Fig versehen Beispiel 1-II, eine dominante Spezies wurde bei zwischen 37 beobachtet und 50 kDa. Das Muster eluiert mitSDS-PAGE-Probenpuffer war vergleichbar mit zusätzlichen prominent Arten. Jedoch in Gegenwart von 1 &amp; mgr; g / ml Peptid 3xFLAG, FP an die Affinitätsbindungsmedium wurde unterhalb der Nachweisgrenze eliminiert und wurde in entweder den nativen oder denaturierenden Elutionsfraktionen nicht beobachtet. Dieses Ergebnis legt nahe, dass unbesetztes Antikörper Paratope während Affinitätseinfangen auch auf Antikörper, erhalten in Abwesenheit ihres zugehörigen Epitop und tragen wesentlich zur Proteom promiskuitiv, die ihre Epitop mit hoher Affinität binden, wie es der Fall für die 3xFLAG ist / α-FLAG M2 Paarung. Es suggestd auch, dass sehr stringenten Bedingungen mit hohem Salz verwenden, häufig gewählten unspezifische Bindung zu verringern, kann in Abwesenheit des Antigen / Antikörper-Wechselwirkung unwirksam. Follow-up wir ein ähnliches Experiment einschließlich der Analyse durch SDS-PAGE sowie quantitative MS (Abb. S1) durchgeführt. Von den 347 Proteinen quantifiziert, beobachteten wir, dass jedes Protein für eine (falsche Disco sparensehr Rate = 1%; Tabelle S1) wurde mit dem 3xFLAG-markierten Köderprotein assoziiert im Vergleich zu einer 3xFLAG Peptid Kontrollprobe versetzt. Diese Ergebnisse zeigen, dass in unseren Experimenten die überwältigende Mehrheit der Proteine ​​beobachtet, wahrscheinlich zusammen reinigen mit dem markierten Protein oder sind off-target Nebenprodukte der unbesetztes α-FLAG Paratope. Unserer Erfahrung nach hohen Signal-zu-Rausch-Affinitätsabfang-Ergebnisse sind in der SDS-PAGE und Proteinfärbung durch eine diskrete Muster von scharfen, reichlich und in etwa stöchiometrischen Bands sowie eine geringe Menge von Hintergrundfärbung von anderen blasser Bands exemplifiziert; zahlreiche Beispiel dieses Prinzips kann in Referenz 11 gesehen werden. Das Motiv für einen PTFE - Isolator mit (was empfohlen wird) , wenn Cryomahlung ist die Rate der Erwärmung des Glases während des Mahlens zu reduzieren, während des Mahlvorgangs die Last der wiederholten LN 2 Kühlung minimieren und reduzieren den Grad der EisBildung in den Topf. Dies erleichtert konsistente Mahlleistung und erleichtert die Handhabung des Zell Pulver. Beispiel Isolatoren können in Referenz 27 (Pucks) und dargestellt in Figur 2 unten (hülsen and-Puck) gefunden werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig1.jpg" /> Abbildung 1: Repräsentative Ergebnisse auswählen. (I) Dieses Panel wurde von Referenz 19 modifiziert. Coomassie Blau gefärbtes SDS-Polyacrylamidgel. (LINKS) Micron-Skala magnetische Kügelchen zeigen unteren Off-Target-Bindung als Agarose-basierte Medien. (A) magnetische Kügelchen; (B) traditionelle Agarose; (C) Eisen imprägniert (magnetisch) Agarose; jeweils mit anti-FLAG M2-Antikörper und verwendet FLAG-getaggten bakterieller alkalischer Phosphatase zu erfassen (BAP; gekennzeichnet) versetzt in Extrakten hergestellt aus cryomilled HEK-293-Zellen. Agarose-basierte purificationszeigten höhere unspezifische Adsorption (unmarkiertes Bänder). (RIGHT) Auszüge aus cryomilled HeLa-Zellen hergestellt werden, zeigen geringere Off-Target-Adsorption auf Antikörper-gekoppelten magnetischen Kügelchen als die durch Beschallung hergestellt, wenn verwendet, um ein endogenes Protein-Komplex zu reinigen. LAP-markierte 44 RBM7 wurde unter Verwendung der Affinität magnetische Kügelchen gekoppelt polyklonalen Anti-GFP - Antikörper erfasst die NEXT - Komplex 19,37 (D) zu reinigen von cryomilled Pulver - Extrakt; (E) Extrakte durch Beschallung von intakten Zellen. Die vertikale schwarze Balken hebt einen Bereich des Gels, wo eine hohe Masse nicht-spezifischen Interaktionspartner beobachtet werden in der Probe durch Beschallung hergestellt angereichert werden. Die schwarzen Pfeile die erwarteten spezifischen Interaktionspartner angezeigt (markiert). Bands beobachtet ~ 50 kDa in den Spuren D und E zu Lama IgG schweren Ketten zurückzuführen. (II) Silbergefärbtes SDS-Polyacrylamid - Gel. (Std.) Ein Mock Affinitätseinfangen erfolgt auf HEK-293T-Zellextrakten in üblicher Weise. Nach Erfassung, Elution des gebundenen Materials wurde mittels (N) nicht denaturierenden Elution mit 1 mg / ml 3xFLAG Peptid oder (D) Denaturieren Elution in SDS-PAGE-Probenpuffer gelöst; (PB 1) als Std. aber die 3xFLAG Peptid wurde in der Extraktionslösung bei 1 &amp; mgr; g / ml enthalten die α-FLAG Paratope auf dem Affinitätsmedium zu blockieren; (PB 10) als PB1, jedoch in Gegenwart von 10 ug / ml Peptid 3xFLAG. IgG-bezogenen Bands und 3xFLAG Peptid markiert sind. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig2.jpg" /> Abbildung 2: PTFE - Isolator Sleeve-and-Puck. Ein 250 ml - PTFE Gefäß wird (1) gezeigt. Ein 50 ml - Edelstahl - Fräsen Glas (2) passt in der PTFE - Glas (3) und stellt dieGelegenheit, das Fräsen Glas in der Mühle zwischen den Zyklen installiert zu verlassen. Ein oberer PTFE - Isolator Puck (2) zwischen der Klemmvorrichtung und der Behälterdeckel verwendet. Direkt in den Körper des Isolators Um die installierten Glas und Isolatoranordnung abkühlen (3), LN 2 zugegeben, das Gefäß umgibt. Der nächste Zyklus des Mahlens kann dann eingeleitet werden. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Empfohlene Konzentration </td><td> Notizen </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> 0,1-0,5 M </td><td> Hohe Konzentrationen (&gt; 300 mM) neigen dazu, Extraktion des Gesamtproteins zu verbessern und Hintergrund gering zu halten, können aber eine ansonsten stabile inter abstreifenAkteure. Konzentrationen unter 150 mM sind typischerweise nicht wirksam bei nicht-spezifischen Hintergrund zu reduzieren. </td></tr><tr><td> Ammoniumacetat </td><td> 0,2-2 M </td><td> Ein Salz, bestehend aus zwei Puffern, das ergibt einen neutralen pH - Lösung 57. Höhere Konzentrationen stabilisieren einige Proteinkomplexe. Saure Lösungen können aus alten, unsachgemäß gelagert kristallinen Bestände aufgrund von Ammoniakverlust zur Folge haben. Kein zusätzlicher pH-Puffer oder Salze werden in Extraktionsmittel enthält, Ammoniumacetat erforderlich. Kann mit NaCl kombiniert werden, erhalten zu modulieren Ergebnisse. </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> 0,1% v / v </td><td> Ein nicht-ionisches Detergens 58; typischerweise mit NaCl kombiniert. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 0,5-1% v / v </td><td> Ein nicht-ionisches Detergens 58; typischerweise mit entweder NaCl oder NH kombiniert 4 CH 3 CO 2 H </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> 5 mM </td><td> Ein zwitterionisches Waschmittel 58 &lt;/ Sup&gt;; typischerweise mit NaCl kombiniert. </td></tr><tr><td> Sarkosyl </td><td> 1 mM </td><td> Eine anionische Reinigungsmittel 58, der Hintergrund reduziert und kann eine stabile komplexe Bauteile abzustreifen, möglicherweise binäre Konnektivität enthüllt; typischerweise mit NaCl kombiniert. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Tris-Cl </td><td> 20 mM </td><td rowspan="2"> pK a von 8,8 bei 4 ° C, 8,1 bei 25 ° C. </td></tr><tr><td> (PH 8,0) </td></tr><tr><td rowspan="2"> HEPES-Na </td><td> 20 mM </td><td rowspan="2"> pK a von 7,8 bei 4 ° C, von 7,5 bei 25 ° C. NaOH oder KOH verwendet für pH Äquilibrierung in Abhängigkeit von dem Salz (beispielsweise NaCl, KCl oder CH 3 CO 2 K) in dem Extraktionsmittel verwendet. </td></tr><tr><td> (PH 7,4) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Einige vorgeschlagen Reagenzien , die für Proteinkomplexe zu reinigen. Diese Tabelle lists einige Reagenzien wir zur Reinigung von Proteinkomplexen nützlich aus menschlichen Zelllinien, mit den vorgeschlagenen Arbeitskonzentrationen gefunden. Eine typische Formulierung enthält Extraktionsmittel einen pH - Puffer, ein Salz und ein Detergens 1,11,24,45-48. Am günstigsten ist es die am wenigsten komplexe Kombination von Reagenzien zu identifizieren, die das gewünschte Ergebnis liefert. <img alt="Abbildung S1" src="/files/ftp_upload/54518/54518figS1.jpg" /> Abbildung S1: Mischen Sie nach der Reinigung (MAP-) SILAC Analyse von False Positives. I. Schematische Darstellung: In diesem Experiment 3xFLAG-markierte ORF2p Proteinkomplexe (von pLD401 ausgedrückt) wurden gereinigt von Schwer- und Leicht markierten HEK-293T - Zellen 7. Das Licht markierte Zellextrakt wurde mit 3xFLAG Peptid gespickt Affinität Erfassung des 3xFLAG-markierten ORF2p durch kompetitive Hemmung zu verhindern; dies wird nicht erwartet, dass die Bindung von Proteinen zu blockieren, die nicht-spezifi auftreten kanntisch mit dem magnetischen Medium oder den nicht paratopischen Strukturen des Antikörpers. Nach der Elution von den magnetischen Kügelchen, waren die schweren und leichten Proben gemischt Nachreinigung und analysiert durch quantitative MS (MAP-SILAC 39) den Anteil von Proteinen zu bestimmen , entweder mit Probe verbunden sind ; weitere methodische Detail befindet sich in der Tabelle S1. II. Silber gefärbtes Gel veranschaulicht, dass die Leicht- und Schwer markierten Materialien ergeben vergleichbare Ergebnisse (vergleiche mit L H), und daß die Reinigung in Gegenwart des spike in 3xFLAG durchgeführt (LI) war kompetitiv gehemmt. Im Folgenden wird ein Coomassie Blue G-250 gefärbtes Gel Topfen , bestehend aus dem gemischten H und LI Fraktionen vor Gelbasis Proteomanalyse, wie in Tabelle S1 beschrieben. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518figS1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518figS1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zum Download</a> bereit <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518figS1large.jpg" target="_blank">.</a> Tabelle S1:MAP-SILAC. Dieses Blatt enthält die erhaltenen Daten bei der Ausführung des MAP-SILAC Experiment in Abbildung S1 beschrieben. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/Table_S1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/Table_S1.xlsx" target="_blank">diese Tabelle zum Download</a> bereit <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/Table_S1.xlsx" target="_blank">.</a>

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Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Hier beschreiben wir Protokolle Säugerzellen durch Solid-State-Fräsen bei einer kryogenen Temperatur zu stören, um einen Zellextrakt aus der resultierenden Zelle Pulver produzieren, und Proteinkomplexe von Interesse durch Affinitätseinfangen auf Antikörper-gekoppelten Mikrometer-Maßstab paramagnetischen Perlen zu isolieren.

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.8K Aufrufe.  The Rockefeller University.  Hier beschreiben wir Protokolle Säugerzellen durch Solid-State-Fräsen bei einer kryogenen Temperatur zu stören, um einen Zellextrakt aus der resultierenden Zelle Pulver produzieren, und Proteinkomplexe von Interesse durch Affinitätseinfangen auf Antikörper-gekoppelten Mikrometer-Maßstab paramagnetischen Perlen zu isolieren. 

Serie: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Forschung

Biochemie

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

MRNA Interactome Capture aus Pflanzenprotoplasten

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

Affinitätsreinigung der Chloroplasten Translocon Proteinkomplexe mit dem TAP-Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

Übersetzen von Ribososomen-Affinitätsreinigung (TRAP) zur RNA-Isolierung von Endothelzellen In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall process costs. Alternative, cost-effective capture steps are therefore valuable for industrial-scale manufacturing, where large quantities of a single mAb are produced. Here we present a method for the immobilization of a DsRed-based epitope ligand to a cross-linked agarose resin allowing the selective capture of the HIV-neutralizing antibody 2F5 from crude plant extracts without using Protein A. The linear epitope ELDKWA was first genetically fused to the fluorescent protein DsRed and the fusion protein was expressed in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants before purification by immobilized metal-ion affinity chromatography. Furthermore, a method based on activated cross-linked agarose was optimized for high ligand density, efficient coupling and low costs. The pH and buffer composition and the soluble ligand concentration were the most important parameters during the coupling procedure, which was improved using a design-of-experiments approach. The resulting affinity resin was tested for its ability to selectively bind the target mAb in a crude plant extract and the elution buffer was optimized for high mAb recovery, product activity and affinity resin stability. The method can easily be adapted to other antibodies with linear epitopes. The new resins allow gentler elution conditions than Protein A and could also reduce the costs of an initial capture step for mAb production.

In this procedure, a DsRed-based epitope ligand is immobilized to produce a highly selective affinity resin for the capture of monoclonal antibodies from crude plant extracts or cell culture supernatants, as an alternative to Protein A.

Aktivierte vernetzte Agarose für die schnelle Entwicklung von Affinity Chromatography Resins - Antikörpererfassung als Fallstudie

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty acids via a labile thioester bond. S-acylation, which is emerging as a widespread regulatory mechanism, can modulate almost all aspects of the biological activity of proteins, from complex formation to protein trafficking and protein stability. The recent progress in understanding of the biological function of protein S-acylation was achieved largely due to the development of novel biochemical tools allowing robust and sensitive detection of protein S-acylation in a variety of biological samples. Here, we describe acyl resin-assisted capture (Acyl-RAC), a recently developed method based on selective capture of endogenously S-acylated proteins by thiol-reactive Sepharose beads. Compared to existing approaches, Acyl-RAC requires fewer steps and can yield more reliable results when coupled with mass spectrometry for identification of novel S-acylation targets. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between fatty acid species attached to cysteines via the same thioester bond.

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) is a highly sensitive, reliable and easy to perform method to detect reversible lipid modification of cysteine residues (S-acylation) in a variety of biological samples.

Nachweis der Protein-S-Acylation mit Acyl-Resin Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...