This work was supported by R01NS075062-01A1. FACS sorting performed at UAB Comprehensive Flow Cytometry Core facility (P30 AR048311, P30 A1027767). Dr. Scott Philips from the UAB Neurobiology Core facility and Dr. Susan Nozell from UAB CDIB assisted with technical aspects of the luciferase assay.

Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Richtlinien behandelt. Die Animal Care und Verwenden Committee an der Universität von Alabama in Birmingham genehmigte Tierversuche. 1. Erhalten RNA und DNA aus einer Enriched Astrozytäre Bevölkerung mit Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) von Astrozyten aus Whole Brain Tissue <ol><li> Sedate Tier mit CO 2 für 1 Minute und dann schnell zu enthaupten. Sezieren Kortex wie in Albuquerque et al,. 26; es ist nicht notwendig, Meningen entfernen. Hinweis:. Transgenen Ratten exprimieren eGFP unter der S100β (eine Astrozyten Marker) Promotors wurden durch Itakura et al 27 erzeugt und für die FACS-Sortierung von Astrozyten verwendet. </li><li> Vorbereitung ganze Gehirnhomogenisat mit einer Papain-Kit Dissoziation unter nicht-sterilen Bedingungen nach dem Protokoll des Herstellers. Wärme aktivieren Papain bei 37 ° C in einem Wasserbad für 10 min. Hinweis:Papain-Lösung wird durch den Hersteller zur Verfügung gestellt und enthält L-Cystein und EDTA (Siehe Tabelle der Materialien). <ol><li> Geschnitten oder Dremel ein Loch in der Spitze einer 50 ml konischen Röhrchen Rohrtrag 95% O 2 zu ermöglichen: 5% CO 2 in einem geschlossenen konischen Röhrchen zugeführt werden (1A). Platzieren seziert cortices in 10 mm Kulturschale enthaltend Dissoziation Medium (MEM mit 20 mM Glucose und Penicillin / Streptomycin (500 U / ml) ergänzt und 95% O äquilibriert 2: 5% CO 2) und mit einem sauberen Rasierklinge Gewebe in 1 Hackfleisch x 1 mm 2 Stück. </li></ol></li><li> Mit 10 ml Hand Pipetman zu 50 ml konische Röhrchen mit Papainlösung Transfergewebe. Erlauben Gewebe zur Unterseite der Transferpipette vor dem Entladen, um die Menge der Dissoziation Medien übertragenen minimieren begleichen. Halten Papainlösung zu 95% O 2 äquilibriert: 5% CO 2 über die Oberfläche der Gasaustausch für die Dauer der Inkubation. Nicht Blase Papain solutiam. Inkubieren Gewebe für 20 Minuten in 37 ° C Wasserbad. </li><li> Nach der Inkubation in Papainlösung, triturate Gewebe 10mal mit 10 ml Transferpipette mit langsamer Geschwindigkeit. Zentrifuge trübe Zellsuspension bei 1.000 g für 5 min bei RT. <ol><li> Äquilibrieren DNase / Albumin-Inhibitor-Lösung (Herstellerangabe) über Oberflächengasaustausch und resuspendieren pelletierten Zellen in 3 ml DNase / Albumin-Inhibitor-Lösung. Bereiten kommerziellen diskontinuierlichen Dichtegradienten gemäß Herstellerangabe. </li></ol></li><li> Spin diskontinuierlichen Dichtegradienten bei 1.000 × g für 6 min. Isolieren dissoziierten Zellen vom Boden des Röhrchens durch Ansaugen unteren Pellet mit einer Pipette. </li><li> Resuspendieren dissoziierten Zellen in 2-3 ml DPBS mit 0,02% Rinderserumalbumin und 1 mg / ml DNase oder bevorzugte HEPES gepufferte Kulturmedien. Fahren Sie durch 40 &amp; mgr; m-Filter vor der FACS (2A). Halten Sie Zellen auf Eis, bis die Sortierung. <ol><li> Führen FACS 28. &lt;/ li&gt; <li> Pellet-Zellen in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen bei 2.000 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Anmerkung: Pelletierte Astrozyten kann sofort verwendet oder in -80 ° C bis die DNA-Extraktion zu halten. </li></ol></li><li> Auszug RNA und DNA mit Hilfe bevorzugte Isolierungsverfahren 29 30. Beurteilen Sie RNA- und DNA-Konzentration und Qualität über Spektralphotometer und Bioanalyzer 31. Hinweis: Nutzen Sie nur qualitativ hochwertige RNA und DNA in den nachfolgenden Schritten, 260/280 = 2,0 bis 2,2 und 1,8 bis 1,9 auf. Bioanalyzer Analyse ist wichtig, für die RNA-Abbau oder DNA-Fragmentierung zu bewerten. RNA oder DNA kann sofort verwendet oder in -80 ° C oder -20 ° C, jeweils für die nachfolgenden Untersuchungen gespeichert werden. </li></ol> 2. Bewertung der DNA-Methylierungsstatus eines Gens mit methylierungssensitiven Hohe Auflösung Schmelzanalyse (MS-HRMA) <ol><li> Geben Sie Gen-Sequenz von Interesse in bevorzugten Online-Methylierungs-Mapping-Software, um alle CpG-Inseln im Gen zu identifizierenInteressen 32. <ol><li> Design-Primer gegen Bisulfit-konvertierter DNA-Sequenz 33 und verstärken mit bevorzugten DNA-Polymerase nach Herstellerprotokoll. Stellen Sie sicher, verstärkte Produktgröße, indem Sie einen 1% -igen DNA-Gel bei 100 V für 45 min. Shop Primer bei Stammkonzentration von 20 um -20 ° C. </li></ol></li><li> Bisulfit konvertieren 500-1000 ng DNA von jeder Probe und methylierten DNA-Standards im Bereich von 0-100% von der gleichen Tierart 34. Eluieren Proben auf eine Konzentration von 20 ng / &amp; mgr; l bereitzustellen. Stellen Sie sicher, Konzentration von Bisulfit-konvertierter DNA mittels Spektralphotometer 31. </li><li> Setup 20 &amp; mgr; l-Reaktionen für MS-HRM-Amplifikation unter Verwendung bevorzugte DNA-Polymerase und Primern bei 5 &amp; mgr; M-Konzentration gemäß Tabelle 1 und 2. Führen Sie alle Proben, einschließlich FACS DNA methylierte und Standards, in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Je nach Analysesoftware, setzen vor und nach dem Start und Stopp-Parameterum die Übergänge der Schmelzkurve. Set vor, eine Schmelz Start und Pre-Schmelzstoppparameter so dass der Unterschied zwischen den beiden ist von 0,2 bis 0,5 ° C. Stellen Sie nach dem Schmelzbeginn und nach der Schmelze zu stoppen ähnlich. Extrahieren Spitzentemperatur Differenzdaten für jede Probe. </li><li> Verwenden Prozent methylierte Standards (y-Wert) und die entsprechenden durchschnittlichen Spitzentemperaturunterschiede (x-Wert) erzeugen einen linearen Regressionsgleichung (3A-B, Tabelle 3-4). Verwenden Sie dieses linearen Regressionsgleichung zur Methylierungsstatus von unbekannten Proben 35 zu schätzen. </li></ol> 3. Bewertung Hyper-methyliert Promotoraktivität durch Verwendung von Luciferase Assay <ol><li> Identifizieren CpG-Inseln des Zielgens (Schritt 2.1). PCR zu amplifizieren interessierenden Bereiche 36 und Klon stromaufwärts des luc2 Firefly Luziferase-Reportergens an CpG-Insel-luc2 Plasmide 37 zu produzieren. </li><li> Linearisieren 30 &amp; mgr; g CpG-Insel-luc2 Plasmid über RestriktionsEnzymverdau 38. Stellen Sie sicher, Standorte für Restriktionsverdau und vermeiden Doppel Schnitte mit bevorzugten Schneidesoftware 38. Wärme inaktivieren Enzyme bei geeigneter Temperatur und Dauer, die nach Aufschluss nach dem Protokoll des Herstellers. Minimalen Verlust an DNA erfolgt während der Linearisierungsschritt. </li><li> Methylat linearisierte Plasmide mit CpG-Methylase (M.Sssl) O / N bei 30 ° C oder lassen Sie unbehandelten folgenden Herstellerprotokoll mit Ausnahme der folgenden Einstellungen. </li><li> Führen Sie 50 ul-Reaktionen. </li><li> Verwenden Sie 5 Einheiten CpG Methylase bis 700 ng linearisierte Plasmid methylieren. </li><li> Führen Reaktionen O / N für 13-19 Std. </li><li> Nach CpG Methylase-Reaktion, führen DNA-Bereinigung mit handelsüblichen Silicagel-Membran reinigen Kit gemäß Herstellerprotokoll. Erhebliche Verluste der DNA auftreten folgenden CpG Methylase-Reaktion, 30-60% Verlust. </li><li> Stellen Sie sicher, Methylierung von Plasmiden über einen HpaII Restriktionsverdau. </li&gt; <li> Nehmen 1 ug methylierten oder unmethylierten DNA und Restriktionsverdau mit Hpa II für 1 h bei 37 ° C. Verwenden Sie 5-10 Einheiten HpaII pro ug DNA. Nach HpaII Verdauung, führen DNA-Bereinigung mit bevorzugten, im Handel erhältlich Silicagel-Membran reinigen Kit. Laufen die beiden CpG-methylierter und nicht-methylierter Plasmide auf einem 1% Agarose-Gel in TAE-DNA oder TBE-Puffer bei 100 V für 45 min zur Visualisierung (4B). </li><li> Gegenstand sowohl methylierten und nicht-methylierten Plasmiden doppelten Digestion mit geeigneten Restriktionsenzymen, um Volllängen-luc 2 (Vektor) und CpG-Insel (insert) -Fragmente 38 freizugeben. Zuführen doppelten Verdau O / N bei geeigneten Temperatur- und Wärme Enzyme zu deaktivieren, die nach Aufschluss nach dem Protokoll des Herstellers. Minimalem Verlust an DNA-Konzentration tritt bei Doppel Restriktionsverdau. </li><li> Laufen Doppel verdauten Plasmide auf 1% DNA Agarosegel bei 100 V für 1 Stunde, um die Trennung zu ermöglichen of Vektor und Insert (4C). Vorsicht. Das Tragen von Schutz UV-Gesichtsschutz, legen DNA-Gel auf einer Tischplatte Schwarzlicht, um Bands zu visualisieren. Basierend auf Größe, Verbrauch methylierter und nicht-methylierter Einsatz und nicht-methylierte Vektor mit einem sauberen Skalpell. </li><li> Gel-Extrakt DNA mit gesättigtem Phenol, pH-Wert 6,6. Kurz gesagt, wiegen DNA Gel-enthaltenden Vektor oder Einsatz. Verwenden Sie 100 ul Phenol pro 0,1 g DNA-Gel. Homogenisieren DNA-Gel in Phenol unter Verwendung von Glas Dounce-Homogenisator. </li><li> In Chloroform (mit 1/5 der Phenolvolumen) und schütteln Proben für 20 Sekunden. Proben Inkubieren bei Raumtemperatur für 2-3 min. Zentrifuge für 15 min bei Maximalgeschwindigkeit (16,1 x 1.000 x g) bei 4 ° C. </li><li> Entfernen wässrigen Lösung und füge 0,1 X Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 X Volumen Ethanol. Proben Inkubation für 1 h bei -80 ° C. Nach der Inkubation Ethanol entfernen und erneut zu suspendieren DNA in 30 ul bevorzugte Puffer. Signifikanten Verlust der DNA erfolgt nach der Isolierung von Einsätzen und Vektoren, 30-50% loss. </li><li> Wieder Ligat methylierter und nicht-methylierter Einsätze nicht methylierte Vektor unter Verwendung von T4-DNA-Ligase 38. Verwenden Sie eine 1: 4-Verhältnis von Vektor für Ligationsreaktionen einfügen. Setup-Reaktion nach Herstellerangaben. Verwenden Sie ein Gesamtvolumen von 50 &amp; mgr; l für Reaktionen und Inkubation O / N bei -20 ° C oder auf Eis mit Deckel auf Eis Eimer. </li><li> Nach der Ligation durchführen DNA Cleanup mit bevorzugten, im Handel erhältlich Silicagel-Membran reinigen Kit. Signifikanten Verlust der DNA auftreten folgenden Ligationsreaktion, eine ungefähre 30-50% Verlust der DNA. Überprüfen Religation von auf 1% Agarose Gel DNA läuft bei 100 V für 45 min und Beurteilung Konzentration re-ligiert Plasmide (Figur 4D). </li><li> Transfektion von methylierten oder unmethylierten Plasmide in D54-Zellen unter Verwendung eines kommerziellen Transfektionsreagens gemäß dem Protokoll des Herstellers. Samen D54 Zellen auf 12-Well-Platte mit einer 0,14 x 10 6 Zellen / Vertiefung. </li><li> Nach 24 Stunden, Transfektion von Zellen, with gleiche Konzentrationen von entweder (1) Nicht methyated CpG-luc2 Plasmid + Renilla oder andere Steuer Luciferase-Vektor oder (2) methylierte CpG-luc2 Plasmid + Renilla oder andere Steuer Luciferase-Vektor. </li><li> Zulassen-Zellen für 24 Stunden Transfektion vor der Durchführung Dual Luciferase-Assay. Führen Sie Test gemäß Herstellerangaben. Führen Sie Messwerte unter Verwendung eines Luminometers. Lesen Sie jede Vertiefung in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Berechnen Verhältnis von Firefly Luziferase-Aktivität zu Renilla oder andere Steuer Luciferase-Aktivität. Normalisieren methylierte Firefly: Steuer Luciferase-Aktivität, um nicht methylierten Firefly: Steuer Luciferase-Aktivität durch Division methylierte Luciferase-Aktivität von nicht methylierten Luciferaseaktivität </li></ol>

The authors have no disclosures.

This protocol describes the isolation of an enriched population of astrocytes via FACS as well as a variety of techniques that allow for both correlative and causative studies between DNA methylation and gene expression. These techniques, used in isolation or in combination, are particularly useful for laboratories that work with tissue of high cellular heterogeneity or are interested in the DNA methylation status of a particular gene or gene region versus global DNA methylation changes. One relatively unique challenge in studying the epigenome of the CNS is the diversity of cell populations. As genes of interest may be expressed to varying degrees with both temporally and spatially unique patterns in the CNS, the use of whole tissue often confounds data from both transcription and DNA methylation studies. 
Kir4.1, the protein of interest, is spatially and temporally regulated in astrocytes, oligodendrocytes, and ependymal cells 13,14,40-47. Thus, the use of eGFP-S100&#946; transgenic animals 27 for FACS provided an enriched population of astrocytes 15, and therefore a more accurate assessment of the level of gene transcription and DNA methylation specific to this cell population. Despite this advantage, the use of FACS sorted astrocytes presents several challenges. Preparation of a cell suspension for FACS requires significant disruption of whole tissue and several changes in the temperature and external media environment. While pH and temperature are maintained to promote cell viability and stabilize cellular machinery, it is reasonable to assume that some changes in DNA methylation occur subsequent to the mechanical and enzymatic disruption of cells. Additionally, in comparison to the use of whole tissue, FACS sorting of astrocytes yields significantly lower amounts of RNA and DNA for downstream molecular studies. This low ratio of yield to labor/reagent may limit the feasibility of some studies depending on the number and complexity of subsequent molecular applications as well as brain regions under study. Taking time to maintain proper pH and temperature as well as working efficiently to reduce total protocol time will aid in isolating healthy cells and thus high quality DNA/RNA. 
In regards to methylation studies, a variety of applications are currently available for detection of DNA methylation 48,49. Methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) was utilized to study KCNJ10, the gene of interest. MS-HRMA is useful in screening changes in DNA methylation of any given region of a gene of interest. This technique incorporates many of the same basic concepts and procedures as standard PCR amplification 50. Thus, reactions can be setup using a number of thermal cyclers and data analysis performed in most laboratories familiar with standard molecular techniques. One caveat to MS-HRMA is that the method provides estimates of the methylation status of a given region of DNA. This is in contrast to pyrosequencing which provides exact percentages of methylation of specific CpG sites. Additionally, depending on the number of CpG sites assessed within one region, using a linear regression may skew results for those regions with limited numbers of CpG sites. 
In studying the ability of DNA methylation to regulate KCNJ10 gene expression, we supplemented correlative studies with a dual luciferase assay to directly assess changes in the transcriptional activity of the KCNJ10 gene following hypermethylation. Use of the luciferase assay allows for alteration of the methylation status of a specific region of the gene and subsequent assessment of transcriptional activity directly related to these changes. Two major challenges of the luciferase assay are the laborious nature of the protocol and the loss of DNA input through each sequential step. Validation of the quantity and quality of DNA following each reaction as well as starting with a sufficient amount of DNA is essential to acquiring adequate amounts of DNA for transfection. Overall, the use of these techniques can be performed using tools found in most molecular laboratories and be can performed without the use of a large genomic sequencing facility, making these techniques widely accessible to investigators interested in DNA methylation.

Epigenetics is the study of chemical modifications that can affect the transcriptional activity of the genome. Essentially, without a change in the DNA sequence, epigenetic modifications such as DNA methylation, histone acetylation, and histone methylation are sufficient to reversibly alter patterns of gene expression 1. DNA methylation, a potent regulator of gene expression, is the most well characterized epigenetic modification. DNA methylation is the covalent attachment of methyl groups on the C5 position of a cytosine, typically the cytosine of a cytosine-guanine dinucleotide, also known as a CpG site. Areas that contain a high density of CpG sites are known as CpG islands (CGIs). CGIs are frequently associated with transcriptional start sites (TSS) and gene promoters 1-3. Thus, while changes in DNA methylation at CGIs are not always concomitant with changes in cellular expression or function, changes in DNA methylation at CGIs can exert powerful regulation on transcriptional activity 2. 
Historically, DNA methylation was observed to be essential in embryogenesis, imprinting, and development, with little changes in the levels of DNA methylation occurring in post-mitotic cells (with the exception of alterations in cancer-related genes) 4,5. However, the field of neuroepigenetics has highlighted an important non-developmental role for DNA methylation. Specifically, cognitive epigenetics has redefined DNA methylation as a highly plastic mechanism integral in mediating both the transcriptional activation and repression of genes essential for the process of learning and memory 6. Apart from cognitive epigenetics, studies modeling ischemic injury and neuropathic pain characterize DNA methylation as a labile mechanism that responds rapidly to a variety of CNS insults 7-9. In regards to astrocytes, several lines of evidence suggest DNA methylation plays an important role in astrogliogenesis. Fan et al., found that conditional KO of DNMT1 in neural progenitor cells (NPCs) resulted in precocious development of astrocytes concordant with a global state of hypomethylation 10. Additionally, Perisic et al., concluded differential levels of DNA methylation of the GLT-1 promoter mediated differential levels of expression of the glutamate transporter in the cortex and cerebellum, emphasizing a role in DNA methylation in establishing brain-region specific patterns of astrocytic gene expression 11. Overall, numerous studies underscore the dynamic and labile nature of DNA methylation in the CNS as environment, drugs, and injury have all been shown to change DNA methylation and often, gene expression 4,9. Together, these neuroepigenetic studies point to DNA methylation as a feasible therapeutic target with the potential to mitigate a variety of CNS pathologies.
As the field of epigenetics expands its understanding of the role of DNA methylation in neurodevelopment and disease, the challenge of moving DNA methylation towards a therapeutic target is performing not only correlative, but causative studies that define specific gene targets and sites. Additionally, surveying changes in DNA methylation specific to brain region and cell type remains an ongoing and time worthy challenge unique to the field of neuroepigenetics. This protocol utilizes a variety of techniques including fluorescence-activated cell sorting (FACS) of astrocytes, methylation-sensitive high resolution melt analysis (MS-HRM), and a methylation luciferase assay to investigate the DNA methylation status of KCNJ10, a gene that encodes for Kir4.1. Kir4.1 is a glial specific potassium channel that demonstrates both brain region and cell specific patterns of expression in the CNS 12-16. Kir4.1 expression increases moving from rostral to caudal CNS regions, with the highest expression occurring in the spinal cord 15. Although the channel is expressed in ependymal cells, oligodendrocytes and their precursor cells, Kir4.1 is predominantly expressed in astrocytes and thought to be essential for maintaining homeostatic levels of potassium as well as supporting glutamate uptake by setting the astrocytic resting membrane potential at a hyperpolarized -80mV 12,16-19. Importantly, the expression of Kir4.1 is non-static both during development and following multiple forms of CNS injury 20-25. We wished to examine the epigenetic regulation of this channel, specifically in astrocytes during development. The techniques utilized offer gene-specific and targeted CpG site analyses that provide causal evidence for a role of DNA methylation in regulating KCNJ10 gene expression. These techniques can be applied to other genes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Primer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>online</td>
			<td>software to localize CpG Islands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Premixed Calibration Standard</td>
			<td>EpiGenDx</td>
			<td>80-8060R-Premix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG Methylase (M.Sssl)</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction&#160;</td>
			<td>QIagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Used for gel extraction and DNA cleanup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB cutter</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>online</td>
			<td>verify restriction digest sites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luc2 vector, pGL4.10</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>renilla vector, pGL4.74</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TD-20/20 Luminometer</td>
			<td>Turner Designs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine LTX and Plus Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A12621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, saturated pH 6.6/6.9</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 17501-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeltDoctor Master Mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4415440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Resolution Melt (HRM) Software v2.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4397808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB SDS software v2.3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>online</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB High Resolution Melting Getting Started Guide&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>online</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB 7900HT Fast Real-Time System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlating gene-specific dna methylation changes with expression and transcriptional activity of astrocytic kcnj10 (kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Eine angereicherte Population von Astrozyten wurde mittels FACS-Sortierung von eGFP-S100β transgenen Tieren 27 erworben. Aufgrund abnehmender Qualität der Zellen und molekularen Moleküle von Tieren, die älter sind als postnatalen Tag 50 (p50) isoliert, alten Tieren p0-p40 sind optimal für solche Experimente. Cortexgewebe wurde für diese Experimente verwendet. Cortices von zwei bis sechs Tiere wurden gepoolt. FACS wurde UAB Umfassende Durchflusszytometrie Core Facility durchgeführt. Sortier wurde am Becton Dickinson FACSAria II durchgeführt. eGFP Anregung wurde mit 488 nm-Laser erhalten wird; keine Kompensation notwendig. Ein Wohnbevölkerung wurde basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuung (1B) ausgerichtet. Eine Live-Zellpopulation wurde unter Verwendung eines Ethidiumbromid tote Zelle Indikator bestimmt und gated (Abbildung 1c). Zwei verschiedene Populationen wurden auf der Grundlage der eGFP-Profil (Figur 1D) beobachtet. Durch empirische Tests, die Zellpopulation mit höheren eGFPProfil wurde als die eGFP-positive Zellpopulation (1F-F &#39;&#39;) identifiziert. Visuelle Analyse der zweiten Population mit einem niedrigeren eGFP Profil zeigte Zellfragmente exprimieren eGFP, aber ohne Kerne, wahrscheinlich, die Trümmer von Astrozytenfortsätze (1G-G &#39;&#39;). Repräsentative Bilder dissoziierter eGFP positive Astrozyten folgenden Dissoziation aber vor der Sortierung (2A) und nach der Sortierung (2B) werden gezeigt. Isoliert eGFP-positiven Zellpopulation zeigte eine 40-fache Steigerung der ALDH1L1 mRNA, einem astrozytischen spezifischer Marker 39 (Abbildung 2C). Zusätzlich trotz geteilt Expression S100β in NG2 + OPCs und Astrozyten 39, beobachteten wir eine 4-fache Verringerung der mRNA NG2, einen Marker für Oligodendrozyten-Vorläuferzellen 39, was anzeigt, Isolierung eines angereicherten Astrozyten Zellpopulation (2C-D). RNAund DNA aus FACS isoliert, sortiert Astrozyten waren von ausreichender Qualität und Quantität für die anschließende Methylierung Studien verwendet werden. Die Gesamt-RNA und DNA aus unterschiedlichen Alters und Anzahl der Tiere isoliert wird als Referenz für die erwartete Rendite des molekular folgenden FACS (Tabelle 5) aufgeführt. Es sei darauf hingewiesen, daß die Ausbeute wird auch je nach Anzahl der verwendeten Tiere, Inkubationszeit und Erfahrung der Forscher basieren. Tabelle 6 zeigt die Variabilität der gemessenen Ereignisse je nach Anzahl der verwendeten Tiere und Inkubationszeiten. Für Methylierungsstudien, die mit hoher Qualität und ausreichende Mengen an DNA ist von wesentlicher Bedeutung für eine erfolgreiche Downstream-Anwendungen. Um eine ausreichende Lyse von Gewebe zur RNA oder DNA-Extraktion zu gewährleisten, wurden alle Homogenisierung von Gewebe oder Zellen durch Trituration unter Verwendung einer 23G Nadel 7x, wobei darauf zu achten Aufschäumen während der Lyse gefolgt. Sobald hochwertige DNA wird extrahiert und Bisulfit converted, Bereiche von Interesse kann für MS-HRMA ausgerichtet sein. Beachten Sie, dass bei der Beurteilung der Qualität und Konzentration von Bisulfit-konvertierter DNA, sollte Spektralphotometer gesetzt, um bei einer OD-Faktor von 33 zu lesen, wie Bisulfit-konvertierter DNA Einzelstrang werden. Die 260/280 Werte für Bisulfit-konvertierter DNA lag im Bereich von 2,20 bis 2,70. Vor Beginn der Methylierungsstudien, ist es dringend notwendig, auszuwählen und zu kalibrieren ein Thermocycler für MS-HRMA Studien. Darüber hinaus muss man bestimmen, wie zu exportieren und zu nutzen Rohdaten von MS-HRMA generiert. Applied Biosystems High Resolution Melting Erste Schritte wurde verwendet, um bei der Kalibrierung des 7900HT Thermocycler zu unterstützen. Schließlich wurden die Daten extrahiert und in HRM Analysesoftware für die anschließende Datenanalyse eingeführt. Wie im Protokoll beschrieben, vor und nach der Start- und Stopp-Parameter wurden in der Nähe der Übergänge der Schmelzkurve gesetzt. Spitzentemperaturunterschiede wurden verwendet, um Methylierungsstatus unbekannt sa zu extrapolierenmples. Geschätzter von MS-HRMA erworbenen Methylierung Daten entsprachen eng mit Methylierungsdaten von Pyrosequenzierung generiert (Pyrosequenzierung Daten wurden in Haus unter Verwendung von Primern Targeting gleichen Regionen wie MS-HRM Primern) (3C) 15. Ein Dual-Luciferase-Assay wurde verwendet, um die Transkriptionsaktivität von hyper-methylierten Bereichen des Gens von Interesse (4A) zu beurteilen. Jedes CpG-Insel-luc2 Plasmid wurde linearisiert und dann methyliert. Da jedoch sowohl der Einsatz (CpG-Insel) und Vektor (luc2) werden während der Reaktion methyliert, muß man das methylierte Insert herauszuschneiden und Wieder Ligat an einen nicht methylierten Vektors. Durch umfangreiche Manipulation des Plasmids treten erhebliche Verluste und muss eine ausreichende Ausgangsmaterial beginnen. HpaII-Verdau wurde verwendet, um den Methylierungsstatus von jedem Plasmid Nachprüfung der HpaII verdaut einzige nicht-methylierte DNA (4B). Es sollte angemerkt werden, dassWenn O / N-Methylierung nicht ausreicht, kann ein zusätzlicher 1x von SAM und 1x CpG Methylase folgenden 1 h Inkubation bei 30 ° C zugegeben werden. Weiter O / N Inkubation nach Zugabe von zusätzlichem SAM und CpG-Methylase. Generation von methylierter und nicht-methylierter CpG-Insel-luc2 Plasmid ermöglicht die direkte Beurteilung der Veränderungen zwischen DNA-Methylierung und Transkriptionsaktivität durch Messung der Luciferase-Aktivität. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52406/52406fig1.jpg" /> Abbildung 1. FACS-Sortierung isoliert eGFP + Zellen popoulation. (A) Verwendung eines 50 ml konischen Röhrchen mit Lochausschnitt auf der Oberseite ermöglicht eine Oberflächengasaustausch während Papainverdau. (B) Sortiert Zellen wurden auf Basis von Vorwärts- und Seitenstreudiagramme gated. (C) Ein Ethidiumbromid basierend tote Zelle Indikator wurde eine Live-Zellpopulation (rot) an Gate verwendet. (D) Live-cell Bevölkerung demonstriert zwei Populationen - eines mit einem hohen Profil eGFP (grün) und einem niedrigen eGFP Profil (lila). Für alle Graphen repräsentiert y-Achse Seitenstreubereich (SSC-A); x-Achse die vorderen Seitenstreubereich (FSC-A), grün fluoreszierendes Protein Bereich (GFP-A) oder Ethidiumbromid (EtBr). (EG) dissoziierten Zellen wurden mit Hoechst inkubiert und 20 &amp; mgr; l von dissoziierten Zellen auf Deckglas gelegt und abgebildet. (EE &#39;&#39;) eGFP + Astrozyten, mit umfangreichen Prozessen wurden vor dem Sortieren (NS) visualisiert. (FF &#39;&#39;) Im Folgenden Sortieren, Hoch eGFP + Bevölkerung (POS) zu demonstrieren eGFP + Zellen, die Soma-Lokalisierung Co mit Hoechst-Färbung. (GG &#39;&#39;) Low eGFP Bevölkerung zeigt eGFP + Färbung, die nicht nebeneinander zu lokalisieren war mit Hoechst-Färbung, wahrscheinlich, die Astrozyten Schutt (für alle Bilder, scale = 20 um). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52406/52406fig1large.jpg" target="_blank">Bitte</a>Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52406/52406fig2.jpg" /> Abbildung 2. FACS-Sortierung von eGFP-S100 β transgenen Tieren bietet angereicherte Population von Astrozyten. (A) 20 ul dissoziierten Zellen vor der FACS (NS) angezeigt, Prozesse intakt bleiben (Maßstab = 50 um). (B) Repräsentative Bildpost FACS (FACS) Zellen gezeigt; Astrozytenfortsätze werden entfernt und Zellsoma Überreste (Maßstab = 20 um). (C) qPCR Daten zeigen eine 40-fache Steigerung der ALDH1L1 mRNA im FACS sortierten Zellen (FACS), verglichen mit nicht sortiert Population (NS). (D) NG2 mRNA wird durch 4-fach in FACS reduziert sortierten Zellen im Vergleich zu nicht sortiert Bevölkerung (NS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52406/52406fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um</a><html> vergrößern Version dieser Figur. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52406/52406fig3.jpg" /> Abbildung 3. Beispiel Daten und Analysen für MS-HRM-Studien. (A) Beispiel der Temperaturdifferenz Plots von Methylierungsstandards generiert. Entsprechenden prozentualen Methylierung für jede Kurve (B) Beispiel eines linearen Regressionsgleichung aus Ratten methyliert Standards erzeugt markiert. (C) Vergleich der Prozent-Methylierung von Pyrosequenzierung (pyroseq, grüner Balken) und MS-HRMA (graue Balken) erworben zeigt ein ähnliches Niveau an Methylierung für unterschiedliche Regionen KCNJ10. Pyrosequenzierung Daten im Haus erzeugt unter Verwendung von Primern Targeting gleichen Regionen wie MS-HRM Analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52406/52406fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Zelt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52406/52406fig4.jpg" /> Abbildung 4. Dual-Luciferase-Assay ermöglicht die Beurteilung der Transkriptionsaktivität von differentiell methyliert Genregionen. (A) Schematische Darstellung der Luciferase-Transkriptionsaktivität Test zeigt Workflow-Protokoll. (B) DNA-Gel zeigt Unterschiede in der methylierten gegenüber nicht-methylierten Plasmiden folgenden HpaII-Verdau. Nicht-methylierter DNA ist leicht folgenden HpaII Verdauung verdaut Vergleich zu methylierte DNA und zeigt erfolgreiche Methylierung von DNA-Plasmid. (C) DNA-Gel zeigt Trennung von Vektor aus Einsatz folgenden Doppel Verdauung. Nach DNA-Trennung, Vektor und Insert sind Gel extrahiert. (D) DNA-Gel zeigt erfolgreiche Re-Ligation von Vektor und Insert. Re-ligierten Plasmid besitzt ähnliche Molekulargewicht, wie unbehandeltes Plasmid (uNTx). NM, nicht erfüllthylated; M, methylierte; RL, religiert; uNTx, unbehandelt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52406/52406fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> . </td><td> Volumen (ul) </td><td> x3 + 10% Überschuß </td><td> x Anzahl der Proben </td></tr><tr><td> MeltDoc MM </td><td> 10 &amp; mgr; </td><td> 33 &amp; mgr; </td><td></td></tr><tr><td> Primer 1 </td><td> 1,2 &amp; mgr; </td><td> 3,96 &amp; mgr; </td><td></td></tr><tr><td> Primer 2 </td><td> 1,2 &amp; mgr; </td><td> 3,96 &amp; mgr; </td><td></td></tr><tr><td> gDNA </td><td> 1 &amp; mgr; </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td> dH 2 0 </td><td> 6,6 &amp; mgr; </td><td> 21.78 ul </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Beispielberechnung MeltDoctor Mastermix. Führen Sie jeden MS-HRM reaction in dreifacher Ausfertigung mit 10% Überschuß, um Pipettierfehler zu kompensieren. Letzte Spalte zeigt die Berechnung für mehrere Probenzahlen benötigt werden. Gesamtvolumen für jede Reaktion ist 20 &amp; mgr; l. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Zyklus </td><td> Temp (° C) </td><td> Zeit (s) </td><td> Rampenrate (%) </td></tr><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> :15 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 40x </td><td> 95 ° C </td><td> :15 </td><td> 100 </td></tr><tr><td></td><td> 60 ° C </td><td> : 60 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Schmelzparameter </td><td> 95 ° C </td><td> : 10 </td><td> 100 </td></tr><tr><td></td><td> 60 ° C </td><td> : 60 </td><td> 100 </td></tr><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> :15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 60 ° C </td><td> :15 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Halten </td><td> 4<html> 76; C </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2:. Beispielprotokoll für die Amplifikation Denaturieren Proben bei 95 ° C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen der Amplifikation und die Erzeugung von Schmelzkurve. Schmelz Parameter innerhalb Tabelle aufgeführt. Hinweis Änderung der Anstiegsrate, die für die Übernahme von hochauflösenden Schmelztemperatur ermöglicht. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Prozent Methylierung (Rat Standard) </td><td> Peak-Temperatur-Differenz- </td></tr><tr><td> y </td><td> x </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 5.670116 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 10,70448 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 15,5044 </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 25,52295 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 34,43047 </td></tr><tr><td> 75 </td><td> 43,80894 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 53,88717 </td></tr></tbody></table>nt &quot;&gt; Tabelle 3. Beispiel der Spitzentemperatur Differenzdaten. Percent Methylierung Standard wird als Y-Koordinate markiert. Peak-Temperaturdifferenz-Daten werden als x-Koordinate gekennzeichnet. Repräsentative Spitzentemperatur Differenzdaten wurde mit MS-HRM von einem Gen-Region erworben. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Spitzen Temp Difference </td><td> Geschätzte Methylierung </td></tr><tr><td> X </td><td> Y </td></tr><tr><td> Probe 1 (n = 4) </td><td></td></tr><tr><td> 47,450 </td><td> 81,115 </td></tr><tr><td> 46,292 </td><td> 78,657 </td></tr><tr><td> 41,694 </td><td> 68,894 </td></tr><tr><td> 47,292 </td><td> 80,779 </td></tr><tr><td> Probe 2 (n = 4) </td><td></td></tr><tr><td> 29,925 </td><td> 43,904 </td></tr><tr><td> 24,269 </td><td> 31,894 </td></tr><tr><td> 25,061 </td><td> 33,575 </td></tr><tr><td> 25,389 </td><td> 34,272</td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Beispiel berechnete geschätzte Prozent Methylierung. Peak-Temperaturdifferenz von Proben unbekannter Methylierungsstatus wird verwendet, um den prozentualen Methylierungs Schätzung unter Verwendung einer linearen Regressionsgleichung. Repräsentative Daten von zwei verschiedenen Bedingungen, Probe 1 und Probe 2 sind gezeigt; n = 4 für jede Bedingung. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Lebensalter </td><td> Anzahl der Tiere </td><td> Die Gesamt-RNA (ng) </td><td> Gesamt-DNA (ng) </td></tr><tr><td> P4-p10 </td><td> 3-6 </td><td> 455-868 </td><td> 265-1523 </td></tr><tr><td> p19-p22 </td><td> 1-2 </td><td> 220-680 </td><td> 583-1483 </td></tr><tr><td> p40-p50 </td><td> 3-4 </td><td> 198-260 </td><td> 578-1700 </td></tr></tbody></table> Von FACS erworbenen Tabelle 5. Gesamt-RNA und DNA-sortierten Zellen Alter. Und Anzahl der Tiere in FA verwendetCS-Experimente werden aufgelistet. Beachten Sie wurden beide Kortex für jeden N. Gesamt-RNA verwendet, und DNA wird als Referenz für die erwartete Rendite aufgeführt. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Lebensalter </td><td> Anzahl der Tiere </td><td> Pos Events </td><td> Neg Events </td><td> Inkubationszeit (bei 37 ° C) </td></tr><tr><td> p26 </td><td> 1 </td><td> 2.18X10 ^ 6 </td><td> 1.15X10 ^ 6 </td><td> 20.00 min </td></tr><tr><td> p26 </td><td> 2 </td><td> 4.4X10 ^ 6 </td><td> 2.78X10 ^ 6 </td><td> 20.00 min </td></tr><tr><td> p26 </td><td> 2 </td><td> 9.2X10 ^ 6 </td><td> 3.3X10 ^ 6 </td><td> 30:00 min </td></tr></tbody></table> Tabelle 6. Anzahl der Ereignisse von FACS am postnatalen Tag 26 erworben Bei p26 Anzahl der positiven (eGFP +) Veranstaltungen und negativen Ereignissen variiert je nach Anzahl der verwendeten Tiere und Inkubationszeit abhängig.

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Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Korrelieren von Gen-spezifischen DNA-Methylierungsänderungen mit Expression und Transkriptionsaktivität Astrozytäre<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

7.9K Aufrufe.  University of Alabama at Birmingham. DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression. 

Serie: Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Bestimmung der DNA-Methylierung von geprägten Genen in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

DNA-Methylierung: Bisulfit Modifikation und Analyse

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

Eine quantitative Assay zur Protein Studie: DNA-Wechselwirkungen, Discover Transkriptionsregulatoren der Genexpression, und identifizieren Novel Anti-Tumor-Wirkstoffe

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In-vitro-Test zur Methylierung Protein-Arginin-Methylierung Studieren

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Verbesserte Reduzierte Darstellung Bisulfit-Sequenzierung für die Bewertung der DNA-Methylierung bei Basenpaar Auflösung

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...