Wir danken T. Hunt, M. Rosenbluth, und das Lam-Lab für ihre Ratschläge und nützliche Diskussionen. Wir erkennen die Unterstützung von G. Spinner und dem Institut für Elektronik und Nanotechnologie an der Georgia Institute of Technology. Finanzielle Unterstützung für diese Arbeit wurde durch ein NIH-K08 HL093360, UCSF REAC award, einem der NIH Nanomedizin Development Center Award PN2EY018244, und die Finanzierung aus dem Zentrum für Endothelial Cell Biology von Kinder-Healthcare von Atlanta zur Verfügung gestellt.

1. Fabrication der endothelialen Microdevice <ol><li> Erstellen Sie eine Photomaske durch die Vorlage eines computerunterstützten Konstruktion (CAD) Zeichnung des Mikrofluidik-Vorrichtung an einen externen Anbieter Maske. Die verwendete Maske wurde von einer Chromschicht auf Kalk-Natron-Glas besteht. In diesem Fall wird Mikrofluidkanal Breite betrug 30 um. </li><li> Reinigen einer nackten Silizium-Wafer mit Piranha (10:1 Verhältnis von Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid) für 15 Minuten und tauchen in Flusssäure für 30 Sekunden. Spülen mit deionisiertem Wasser (DI) für ca. 10 Sekunden. </li><li> Verwendung eines Spin-Coater, Spin Microchem SU-8-2025 Photoresist auf den Wafer zu einer Höhe von 30 um. Für SU-8 2025, ist ein Spin Drehzahl von 3000 min empfohlen. Andere Viskositäten von SU-8 zur Verfügung, wird diese Höhe zu erreichen. Eine vollständige Anleitung für SU-8-Einsatz sind verfügbar unter <a href="http://www.microchem.com" target="_blank">www.microchem.com</a> </li><li> Setzen Sie den Wafer mit SU-8 auf einer Heizplatte bei 95 ° C für5 Minuten zu verjagen überschüssiges Lösungsmittel. Hinweis: Ein Ofen wird der Wafer anders trocknen als eine Kochplatte und wird nicht empfohlen. </li><li> Platzieren Sie eine Maske mit dem gewünschten Feature Form über den Wafer, und UV-Licht bestrahlen (160 mJ / cm 2 gemessen bei 365 nm) in einem Mask Aligner (Karl Süss, MA-6). Dieses Kreuz verbindet den Fotolack. </li><li> Legen Sie die Wafer-Rückseite auf einer Heizplatte bei 95 ° C für weitere 5 Minuten weiter beschleunigen die Polymerisation von SU-8. </li><li> Tauchen des Wafers in SU-8-Entwickler, in erster Linie aus PGMEA (Propylenglykolmethylether Acetat) für 4 Minuten zusammen, um den nicht-vernetzten SU-8 zu entfernen. </li><li> Spülen Sie die neu entwickelten Wafer mit 100% Isopropylalkohol (IPA) für 10 s. Der Wafer kann dann unter Verwendung unter Druck stehendem Stickstoff oder indem man das Lösungsmittel aus der Wafer in einem sauberen Abzug, der für mehrere Minuten zu verdampfen. </li><li> Band die Ränder des getrockneten Wafer mit strukturiertem SU-8 in eine Petrischale vorabentlüften Bewegung. </li><li> Bewerben 1 mL Sigmacote auf dem Wafer mit einer Pipette, decken mit der Spitze der Petrischale, und wirbeln Wafer, um eine vollständige Beschichtung der Wafer sicherzustellen, Deckel abnehmen und erlauben Wafer für einige Minuten trocknen lassen, bis alle Lösungsmittel verdampft ist. </li></ol> 2. PDMS (Polydimethylsiloxan) Herstellung <ol><li> Mix PDMS Polymer und Härter im Verhältnis 10:1 (w / w) und Luftblasen mit einem Vakuumexsikkator getrocknet. Die erforderliche Zeit zum Entgasen des PDMS variiert je nach der Stärke des zur Verfügung Vakuumsystem, jedoch typischerweise im Bereich von mehreren Minuten bis eine Stunde. Für ein sechs Zoll Petrischale ohne zuvor ausgegossenen PDMS ist ein Gesamtvolumen von 60 ml des Polymers wird empfohlen. </li><li> Die Mischung auf den Wafer, etwa 5 mm dick. Auch auf einen flachen Teller gießen unten auf eine dünne Folie aus PDMS zu schaffen, etwa 1 mm dick. Härten bei 60 ° C in einem Ofen über Nacht. </li><li> Mit einem Messer oder Skalpell ausgeschnitten rund um die cured PDMS-Gerät und entfernen Sie sie aus dem Wafer. Darüber hinaus schneiden eine dünne Folie aus PDMS geringfügig größer als der Vorrichtung. </li><li> Erstellen Sie Ein-und Auslass Löcher in der PDMS-Gerät mit einem 1,0 mm Lochung. Dies kann unter Verwendung entweder einen Stift Laster, Harris Uni-Core oder ähnlichen Vorrichtung. </li><li> Reinigen Sie die Oberflächen des Gerätes und das Blatt mit Tesafilm. </li><li> Verwendung einer Plasma-Reiniger, freizulegen die Oberflächen der Vorrichtung und PDMS PDMS Datenblatt an Sauerstoffplasma für 30 s. Die Sauerstoff-Plasma erzeugt reaktiven Spezies auf der freiliegenden Oberfläche des PDMS, die darstellt, wenn in körperlichen Kontakt gebracht. </li><li> Verbinden kleiner Schlauch mit einer geringen Länge (einige Zentimeter) mit großem Schläuche, die wiederum mit einer Spritze mit einer stumpfen-Punktnadel verbunden ist, mit 50 ug / ml Fibronectin aus Humanplasma in PBS gefüllt. Der Schlauch und die Nadel sind so bemessen, dass ein Reibschluss zwischen dem Rohr erzeugt wird. Legen kleinere Rohre mit dem Einlass des PDMS und eine Mikrovorrichtungpply Druck auf der Spritze, um die Kanäle ganz mit Fibronectin-Lösung und einen kleinen Tropfen 100 ul an der Auslaßöffnung zu schaffen, um sicherzustellen, dass die Kanäle nassen bleiben. Inkubieren Sie das Gerät bei 37 ° C für 40-60 min. </li><li> Schließen Sie eine frische Spritze mit PBS auf die stumpfe Spitze Nadel gefüllt. Üben Sie Druck auf die Spritze, um das Gerät mit PBS spülen. </li></ol> 3. Seeding der Mikrofluidik-Vorrichtung mit Endothelzellen <ol><li> Planen 1.000.000 Zellen / ml menschlichen Endothelzellen der Nabelvene (HUVECs) in endothelialen Wachstumsfaktor Medien mit 8% Dextran. Ein Bereich von 500.000 bis 2.000.000 Zellen / ml wurde erfolgreich verwendet. Die Zugabe von Dextran in die Zelle Ladehilfsmittel erhöht die Viskosität des Fluids, das die Geschwindigkeit von Endothelzellen abnimmt, wenn sie die Fibronectin-beschichteten mikrofluidischen System eingeben. Dies wiederum erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die Zellen anhaften und Kultur erfolgreich in der Mikrovorrichtung. </li><li> Cchließen Sie den neuen Spritze und Schlauch, wie in Schritt 2.7. jedoch mit einem längeren Schlauch (ca. 1 Meter in der Länge). </li><li> Um die Leistungsfähigkeit dieses Systems zu optimieren, ist es wichtig, an dieser Stelle auf eventuelle Lecks oder Blasen in der gesamten Perfusion Systems zu verhindern, jedes Austreten von Lösung oder das Vorhandensein von Blasen in den Medien wird die Strömung verändern und verhindern, dass erfolgreiche Aussaat der Endothelzellen. Daher ist eng anliegend des Schlauchs wesentlichen um eine Leckage zwischen allen Anschlüssen zu beseitigen. Blasen, die in der Spritze und / oder der Schlauch zu machen, bevor Zellen in der Mikrovorrichtung eingeführt werden und die gesamte Perfusionssystem sollte mit der Zelle Lösung vor dem Anbringen des Schlauchs mit der mikrofluidischen, um die Einführung von Luftblasen zu vermeiden grundiert werden. </li><li> Verwendung einer Spritzenpumpe infundieren Zellsuspension in PDMS Gerät Volumenstrom von 1,23 ml / min für 2 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. Optimale Ergebnisse wurden erzielt, wenn die Spritzenpumpe war beim<html> gleicher Höhe wie der PDMS-Gerät. Für den Zulauf sorgt die längeren Schlauch, der innerhalb des Inkubators werden kann gewickelt, dass die Zellen und Medien ausreichend sind, bevor er in Kontakt mit der Vorrichtung erwärmt. In unserem System nähert sich die volumetrische Strömungsrate von 1,23 ml / min ein Midstream Geschwindigkeit von ~ 1 mm / s in den kleinsten Mikrokanäle, entsprechend einer Wandschubspannung ~ 1 Dyn / cm 2 bei dieser Kanäle mit Vollblut. </li><li> Mit der gleichen Spritzenpumpe und lange Schläuche, perfuse frische Nährböden für 2-8 Tage bei-Verhältnis von 1,23 ml / min. Eine erfolgreiche Gerät wird eine Monoschicht von Endothel-Zellen, die auf der Innenseite der Vorrichtung innerhalb von 24-48 Stunden. Frühere Experimente haben gezeigt, dass konfluente Monolayer angemessen äußern VE-Cadherin an Zell-Zell-Verbindungen in der gesamten Einrichtung 14. </li><li> Injizieren von Blut oder Zellsuspension in das System für Experimente. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse _content &quot;&gt; Unter Verwendung dieses Protokolls Standard lithographischen Mikrofertigungstechniken verwendet werden, um die Form benötigt, um die mikrofluidischen Kanälen, die physiologisch imitieren die sizescale des Mikrovaskulatur (Abbildung 1A) produzieren zu schaffen. Mit Hilfe eines optimierten Perfusionstechnik, Endothelzellen dann Saatgut und die Kultur konfluent gesamten Innenfläche des mikrofluidischen Systems innerhalb von 24-48 Stunden nach dem Aussähen der Zellen (1B). Da die Mikrofluidik-System transparent ist, kann die gesamte Mikrovorrichtung auf einem Hellfeld / Fluoreszenz-Mikroskops zum Abbilden und Datensammlung gespeichert. Unser System kann dann angewendet, um hämatologische Erkrankungen, die biophysikalischen Eigenschaften, wie zB Sichelzellenanämie, in dem die erhöhte Steifigkeit des sichelförmigen Erythrozyten und Leukozyten und Endothel-aberranten Haftung auf mikrovaskulärer Obstruktion beitragen verändert beinhaltet die Untersuchung werden. Eine klinisch zugelassenes Medikament, Hydroxyurea, lindert Symptome, sondern seine dDirekten Einfluss auf mikrovaskulären Flusses ist nicht bekannt. Unser Test berücksichtigt sowohl Zell-Adhäsion und Steifigkeit, und zeigt, dass Hydroxyurea deutlich bessert Strömung in Sichelzellanämie (Abbildung 2). Sichelzellenanämie ist nur ein Beispiel einer Anwendung für die Mikrovaskulatur-on-a-Chip, wie dieses System ideal geeignet ist, jede hämatologischen Verfahren, bei dem Blutzellen miteinander interagieren und Endothelzellen in der Mikrovaskulatur studieren. Andere klinisch relevante Anwendungen sind entzündliche Erkrankungen, Sepsis / Lungenschädigung, thrombotische Mikroangiopathie, Malaria und Krebs Metastasen, während mehr Basisanwendungen Leukozyten Biologie und hämatopoetischen Stammzellen Zellbiologie, unter vielen anderen auch. <img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig1.jpg" alt="1"/> Abbildung 1. A) das Anfangskapital PDMS Mikrofluidikvorrichtung vor Endothelialisierung. Hier wird die Mikrovorrichtung nämlich injizierth Lebensmittelfarbe sizescale und der Gesamtaufbau des Systems darzustellen. B) Hellfeldmikroskopie zeigt die Mikrofluidik-System ist komplett innerhalb von 48 Stunden Zellaussaat endothelialisiert unter Verwendung des Protokolls beschrieben. <img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig2.jpg" alt="2"/> Abbildung 2. A) Der Mikrovaskulatur-on-a-Chip mit Mikrokanälen in etwa der Größe der postkapillären Venolen (30 um), dem Ort der meisten Sichelzellenanämie mikrovaskulären obstruktiven Ereignissen. Vollblut aus Sichelzellanämie Patienten, die Hydroxyurea und von Patienten ohne Hydroxyurea wird durch zwei verschiedene Mikrovaskulatur-on-a-Chip-Geräte geflossen. B) Vollblut aus Sichelzellanämie Patienten, die Hydroxyurea Strömungen mit relativer Leichtigkeit in den endothelialisierten Mikrokanäle. C) Unter den gleichen Vorraussetzungen, Vollblut aus Sichelzellanämie Patienten ohne Hydroxyharnstoff zeigt jedoch viel mehr träge Strömung mit microchAnnel Obstruktion. Der untere Kanal vollständig mit keiner Strömung behindert und die Strömungsgeschwindigkeiten in den anderen endothelialisierten Mikrokanäle sind deutlich geringer als in der Hydroxyharnstoff Zustand. Der Balken in allen drei Bildern ist 30 um.

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	<li>Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Level+of+Laboratory+Testing+Required+for+Diagnosis+or+Exclusion+of+a+Platelet+Function+Disorder+Using+Platelet+Aggregation+and+Secretion+Assays.">The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays.</a> Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).</li><li>Young, E. W. K., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+microfluidic+cell+culture+in+controlled+microenvironments.">Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments.</a> Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).</li><li>Young, E. W. K., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macro-+microscale+fluid+flow+systems+for+endothelial+cell+biology.">Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology.</a> Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).</li><li>Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+cell+vasoocclusion+and+rescue+in+a+microfluidic+device.">Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).</li><li>Rosano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiologically+realistic+in+vitro+model+of+microvascular+networks.">A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).</li><li>Meer, A. D. v. a. n. d. e. r., Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Technology+in+Vascular+Research.">Microfluidic Technology in Vascular Research.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).</li><li>Karunarathne, W., Ku, C. -. J., Spence, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dual+nature+of+extracellular+ATP+as+a+concentration-dependent+platelet+P2X1+agonist+and+antagonist.">The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist.</a> Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).</li><li>Kotz, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+microfluidics+for+neutrophil+genomics+and+proteomics.">Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics.</a> Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).</li><li>Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+cell+mechanics+in+hematologic+diseases+with+microfluidic+biophysical+flow+cytometry.">Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry.</a> Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).</li><li>Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+model+for+single-cell+capillary+obstruction+by+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes.">A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).</li><li>Borenstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+endothelialized+microvascular+networks+with+circular+cross-sections+in+a+tissue+culture+substrate.">Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate.</a> Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).</li><li>Nesbitt, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation.">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nat. Med. 15, 665-673 (2009).</li><li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. -. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature.">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).</li><li>Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+the+microvascular+occlusion+and+thrombosis+that+occur+in+hematologic+diseases+using+microfluidic+technology.">In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li><li>Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemolytic+uraemic+syndrome:+prognostic+factors.">Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors.</a> Clinical &#38; Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Unsere endothelialisierten Kleinstgerätes System eignet sich am besten in Verbindung mit in-vivo-Experimenten verwendet und seine reduktionistische Ansatz kann dazu beitragen, Aufklärung der biophysikalischen Mechanismen von hämatologischen Prozesse, die beim Menschen und im Tiermodell beobachtet werden. Darüber hinaus ist unser System nicht ohne Einschränkungen. Zum Beispiel sind unsere mikrofluidischen Kanälen im Querschnitt quadratisch. Obwohl technisch kreisförmigen Mikrokanäle 10,11 herg...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> stumpfer Spitze Nadel </td><td> OK International </td><td> 920.050-TE </td><td> Präzisions-TE Nadel 20 Gauge x 1/2 &quot;, pink </td></tr><tr><td> Dextran </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 31392 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0895 </td><td></td></tr><tr><td> Locher (Bohrfutterhalters) </td><td> Technische Innovationen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Humane Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs) </td><td> Lonza </td><td> CC-2519 </td><td></td></tr><tr><td> Plasma cleaner </td><td> Plasma </td><td> PDC-326 </td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9285739 </td><td> Sylgard 184 Siliconelastomer KIT </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> SL2 </td><td></td></tr><tr><td> SU-8-2025 </td><td> Microchem </td><td> Y111069 </td><td></td></tr><tr><td> SU-8-Entwickler </td><td> Microchem </td><td> Y020100 </td><td></td></tr><tr><td> Spritzenpumpe </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-3008 </td><td> PHD-ULTRA </td></tr><tr><td> Schlauch (größeren) </td><td> Cole-Parmer Instrument Company </td><td> 06418-02 </td><td> Tygonreg Microbore Schläuche, 0,020 &quot;ID x 0.060&quot; OD </td></tr><tr><td> Schlauch (kleiner) </td><td> Cole-Parmer Instrument Company </td><td> 06417-11 </td><td> PTFE-Schläuche Microbore, 0,012 &quot;ID x 0.030&quot; OD </td></tr></tbody></table>

endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases

Advances in Mikrofabrikationstechniken haben die Produktion von kostengünstigen und reproduzierbaren mikrofluidischen Systemen für die Durchführung von biologischen und biochemischen Experimenten auf der Mikro-und nanoskaligen 1,2 aktiviert. Darüber hinaus haben Mikrofluidik ebenfalls speziell verwendet, um quantitativ zu analysieren hämatologischen und mikrovaskulären Verfahren, wegen ihrer Fähigkeit, eine einfache Steuerung der dynamischen Strömungsumgebung und biologischen Bedingungen 3-6. Als solche haben die Forscher in jüngerer Zeit mikrofluidischen Systemen verwendet werden, um Blutkörperchen Verformbarkeit, Blutkörperchen Aggregation, mikrovaskuläre Blutfluss und Blutkörperchen-Endothelzell-Interaktionen 6-13 studieren. Allerdings sind diese mikrofluidischen Systemen entweder gar nicht zählen kultivierten Endothelzellen waren größer oder als die sizescale relevanten mikrovaskulären pathologischen Prozessen. Ein mikrofluidischen Plattform mit kultivierten Endothelzellen, dass genau rekapituliert die zelluläre, physikalischen und hemodynAmic Umfeld der Mikrozirkulation wird benötigt, um unser Verständnis der zugrunde liegenden biophysikalischen Pathophysiologie von hämatologischen Erkrankungen, die eine erneute Mikrovaskulatur. Hier berichten wir über eine Methode, um eine &quot;endothelialisierten&quot; In-vitro-Modell der Mikrovaskulatur erstellen, mit Hilfe eines einfachen, einzigen Maske Mikrofabrikationsprozessen in Verbindung mit Standard Endothelzellkultur Techniken, zu pathologischen mikrovaskulären biophysikalischen Interaktionen, die in hämatologischen Erkrankungen auftreten, zu studieren. Diese &quot;Mikrovaskulatur-on-a-Chip&quot; bietet die Forscher mit einem robusten Assay, die eng kontrolliert biologischem sowie biophysikalischen Bedingungen und wird mit einer Standard-Spritzenpumpe und Hellfeld / Fluoreszenzmikroskopie. Parameter wie mikrozirkulatorischen Vorraussetzungen, Endothelzellen Typ, Blut Zelltyp (en) und Konzentration (en), Arzneimittel / Hemmkonzentration usw., sind bequem gesteuert. Als solche bietet unser Mikrosystemtechnikeine Methode, um quantitativ zu untersuchen Krankheit Prozesse, in denen mikrovaskulären Flusses aufgrund der Veränderungen von Zell-Adhäsion, Aggregation und Verformbarkeit, eine Fähigkeit, nicht verfügbar mit den bestehenden Assays beeinträchtigt wird.

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Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Verfahren zur Kultur von Endothelzellen eine Monoschicht der gesamten inneren Oberfläche des 3D einer Mikrofluidikvorrichtung mit mikrovaskulären großen Kanälen (&lt;30 um) beschrieben. Dies<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrovaskulatur Modell ermöglicht die Untersuchung der biophysikalischen Wechselwirkungen zwischen Blutzellen, Endothelzellen, und löslichen Faktoren in hämatologischen Erkrankungen.

Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

endothelialized-microfluidics-for-studying-microvascular-interactions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.8K Aufrufe.  Emory University School of Medicine. Verfahren zur Kultur von Endothelzellen eine Monoschicht der gesamten inneren Oberfläche des 3D einer Mikrofluidikvorrichtung mit mikrovaskulären großen Kanälen (

Serie: Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

Mikrofluidischen Mischern für ein Studium Proteinfaltung

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Forschung

Biotechnik

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Bestimmung der Transport von Xenobiotika und Nanomaterialien über die Plazenta mit dem<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menschliche Plazentaperfusion Modell

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Mit Mikrofluidik-Chips für Live-Imaging-und Studienverletzungs Antworten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.

This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.

Die Tauchdruck der Zellen auf eine modifizierte Oberfläche mit einem Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Sandwichartigen Mikroumgebungen zu nutzen Handy / Material-Interaktionen

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several angiogenic and prevascularization strategies have been established. However, most cell-based approaches include time-consuming in vitro steps for the formation of a microvascular network. Hence, they are not suitable for intraoperative one-step procedures. Adipose tissue-derived microvascular fragments (ad-MVF) represent promising vascularization units. They can be easily isolated from fat tissue and exhibit a functional microvessel morphology. Moreover, they rapidly reassemble into new microvascular networks after in vivo implantation. In addition, ad-MVF have been shown to induce lymphangiogenesis. Finally, they are a rich source of mesenchymal stem cells, which may further contribute to their high vascularization potential. In previous studies we have demonstrated the remarkable vascularization capacity of ad-MVF in engineered bone and skin substitutes. In the present study, we report on a standardized protocol for the enzymatic isolation of ad-MVF from murine fat tissue.

We present a protocol to isolate adipose tissue-derived microvascular fragments that represent promising vascularization units. They can be rapidly isolated, do not require in vitro processing and, thus, may be used for one-step prevascularization in different fields of tissue engineering.

Die Isolierung von murinen Fettgewebe stammenden mikrovaskuläre Fragmente als Vaskularisation Einheiten für Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of electrophysiological activity for long periods. However, the property of sensing signals from all sources around every microelectrode can become unfavorable when trying to understand communication and signal propagation in neuronal circuits. In a neuronal network, several neurons can be simultaneously activated and can generate overlapping action potentials, making it difficult to discriminate and track signal propagation. Considering this limitation, we have established an in vitro setup focused on assessing electrophysiological communication, which is able to isolate and amplify axonal signals with high spatial and temporal resolution. By interfacing microfluidic devices and MEAs, we are able to compartmentalize neuronal cultures with a well-controlled alignment of the axons and microelectrodes. This setup allows recordings of spike propagation with a high signal-to-noise ratio over the course of several weeks. Combined with specialized data analysis algorithms, it provides detailed quantification of several communication related properties such as propagation velocity, conduction failure, firing rate, anterograde spikes, and coding mechanisms.
This protocol demonstrates how to create a compartmentalized neuronal culture setup over substrate-integrated MEAs, how to culture neurons in this setup, and how to successfully record, analyze and interpret the results from such experiments. Here, we show how the established setup simplifies the understanding of neuronal communication and axonal signal propagation. These platforms pave the way for new in vitro models with engineered and controllable neuronal network topographies. They can be used in the context of homogeneous neuronal cultures, or with co-culture configurations where, for example, communication between sensory neurons and other cell types is monitored and assessed. This setup provides very interesting conditions to study, for example, neurodevelopment, neuronal circuits, information coding, neurodegeneration and neuroregeneration approaches.

This protocol aims to demonstrate how to combine in vitro microelectrode arrays with microfluidic devices for studying action potential transmission in neuronal cultures. Data analysis, namely the detection and characterization of propagating action potentials, is performed using a new advanced, yet user-friendly and freely available, computational tool.

Interfacing Mikrofluidik mit Mikroelektrode Arrays für das Studium neuronale Kommunikation und axonalen Signalausbreitung

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...

Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models is crucial both to better understand the pathological mechanisms of these diseases and identify new therapeutic targets and strategies. To be pertinent, an in vitro model must reproduce the pathological features of a human disease. However, in the context of neurodegenerative disease, a relevant in vitro model should provide neural cell replacement as a valuable therapeutic opportunity. 
Such a model would not only allow screening of therapeutic molecules but also can be used to optimize neural protocol differentiation [for example, in the context of transplantation in Parkinson's disease (PD)]. This study describes two in vitro protocols of 1) human glioblastoma development within a human neural organoids (NO) and 2) neuron dopaminergic (DA) differentiation generating a three-dimensional (3D) organoid. For this purpose, a well-standardized protocol was established that allows the production of size-calibrated neurospheres derived from human embryonic stem cell (hESC) differentiation. The first model can be used to reveal molecular and cellular events occurring during in glioblastoma development within the neural organoid, while the DA organoid not only represents a suitable source of DA neurons for cell therapy in Parkinson's disease but also can be used for drug testing.

This study introduces and describes protocols to derive two specific human neural organoids&#160;as a relevant and accurate model for studying 1) human glioblastoma development within human neural organoids exclusively in humans and 2) neuron dopaminergic differentiation generating a three-dimensional organoid.

Human neurale Organoide zur Untersuchung von Hirntumor und neurodegenerativen Erkrankungen

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models ...