Diese Forschung wurde teilweise durch National Science Foundation (NSF 1227359), WVU EPSCoR Programm von der National Science Foundation (EPS-1003907), WVU ADVANCE Büro von der National Science Foundation (1007978) gefördert und WVU PSCoR finanziert bzw. unterstützt. Die Arbeit wurde in microfabrication WVU Forschungseinrichtungen gemeinsam nutzen (Reinraum-Einrichtungen) und Mikrofluidik Integrative Zellforschung on Chip Laboratory (Mikrochip Lab) an der West Virginia University getan. Die konfokale Bildgebung wurde bei WVU Microscope Imaging Facility getan.

1. Photolithographie Herstellung von Fotolack Meister Mold Das folgende Protokoll zeigt den Prozess, um die Mikrokanäle mit Durchmessern zwischen 30-60 um herzustellen. Um einen Mikrokanal mit einem kleineren Durchmesser (weniger als 30 Mikrometer), einem Dreh-Beschichtung aus Photoresist zu erhalten benötigt. <ol><li> Übertragen Sie die Reflow Fotolack aus dem Kühlschrank bei 4 ° C bis zur Reinraum 24 Stunden vor dem Gebrauch und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur erwärmen. </li><li> Reinigen eines Silizium-Wafers und backen es für eine Stunde bei 150 ° C, damit sie austrocknen. Die Dehydratisierung wird das Photoresist Haftung auf dem Silizium-Substrat zu unterstützen. </li><li> Spin-Beschichtung der ersten Schicht aus Photoresist mit folgender Rezeptur: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Schritt </td><td> Zeit (Sekunden) </td><td> Geschwindigkeit (rpm) </td><td> Beschleunigung </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 &lt;/ Td&gt; <td> 300 </td><td> höchste </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 10 </td><td> 0 </td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 300 </td><td> höchste </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 60 </td><td> 600 </td><td> höchste </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 10 </td><td> 500 </td><td> höchste </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 600 </td><td> höchste </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> Dann backen die Wafer auf einer Heizplatte mit einer Temperatur von 110 ° C für 90 sek. Nach dem Weichbacken die Dicke der Fotolack wird 20-30 um betragen. </li><li> Schleuderbeschichten einer zweiten Schicht aus Photoresist nach der gleichen Rezeptur für die erste Schicht verwendet wird. </li><li> Weichbacken der Wafer erneut, indem Sie es auf einer Heizplatte mit einer Temperatur von 110 ° C für 90 sec. Nach dieser Weichbacken die Dicke der Fotolack wird 40-60 um betragen. </li><li> Generieren positive Urmodelle indem die PHOTOResist mit UV-Licht mit einer Belichtungsdosis von 14.500 mJ / cm 2 durch eine Filmmaske. </li><li> Verdünnen Sie die Entwickler mit deionisiertem (DI) Wasser (1:2 (v / v)). Spülen Sie den Wafer wiederholt in der Lösung, bis das Muster voll entwickelt ist. Dann waschen Sie den Wafer mit DI-Wasser und trocknen Sie sie mit Hilfe von Stickstoff. </li><li> Reflow: Platz der Wafer auf einer Heizplatte mit einer Temperatur von 120 ° C für 4 min und Deckel mit einem Glas Petrischale zur Verdampfung des Lösungsmittels zu verhindern. Entfernen Sie die Wafer von der Kochstelle und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur abkühlen. Die Photoresistdicke nach dem Reflow werden 50-60 um betragen. </li></ol> 2. Softlithographie Herstellung von PDMS Microchannel Netzwerk <ol><li> Bereiten Polydimethylsiloxan (PDMS)-Lösung in einem Gewichtsverhältnis von 10:1 (Basis: Härter) und mischen Sie es gründlich mit einem planetarischen Zentrifugalmischers. </li><li> Wandelt den PDMS-Lösung auf dem Reflow Fotolack Urform. Legen Sie die gegossene PDMS in einem Exsikkator für 15 min zur Entgasung. Verwenden Stickstoffgas, um alle verbleibenden Luftblasen zu entfernen, wenn nötig. </li><li> Backen des PDMS in einem Ofen bei einer Temperatur von 60 ° C für 3 Stunden, um es zu härten. Entfernen Sie dann die gehärteten PDMS Schicht von der Urform. </li><li> Verwenden Sie eine geschärfte Puncher zu Einlass / Auslass Löcher durch Stanzen von Löchern in der Channel-Netzwerk zu erstellen. Reinigen Sie die Oberfläche des PDMS mit Hilfe von Stickstoff. </li><li> Behandle zwei PDMS-Schichten mit Sauerstoff-Plasma für 30 sec in einem Plasma-Reiniger bei einem Betriebsdruck von 4,5 x 10 -2 Torr und einem Sauerstoff-Fluss von 3,5 m 3 / min. Dann Ausrichtung der Oberflächen der PDMS manuell unter einem optischen Mikroskop. Verwenden Sie einen Tropfen Wasser, wenn nötig für eine bessere Kontrolle der Ausrichtung. </li><li> Backen Sie das Gerät in einem Ofen bei 60 ° C für 30 min, um eine dauerhafte Verklebung zu erreichen. </li></ol> 3. HUVEC Kultur und Seeding in den Chip <ol><li> Kultur die HUVECs mit Kulturmedium mit L-Glutamin mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt. Für the Experiment Durchgänge zwischen 2 und 5 verwendet wurden. </li><li> Sobald die HUVECs konfluent sind, zählen die Zellen und ernten sie nach ersten Spülen der Zellen mit HEPES gepufferte Salzlösung (HEPES-BSS), und dann behandeln die Zellen mit Trypsin / EDTA und Inkubation für 2-6 min bei 37 ° C Nachdem die Trypsinierung abgeschlossen ist, neutralisieren die Trypsin / EDTA mit Trypsin Neutralisationslösung. Zentrifuge und die Zellen in Kulturmedium mit 8% Dextran, sie zu sammeln. Dextran wurde verwendet, um die mittlere Viskosität zu erhöhen, um in besser Zellaussaat und Anhänglichkeit zu unterstützen. </li><li> Behandeln Sie das Gerät mit Sauerstoff-Plasma für 5 min mit einem Betriebsdruck von 4,5 x 10 -2 Torr und einem Sauerstoff-Fluss von 3,5 m 3 / min. Dann laden Sie das Gerät mit DI-Wasser und Behandlung mit UV-Licht für 8 h in einer laminaren Biosicherheit Haube für die Sterilisation. </li><li> Eines Tages, bevor die Zellen fertig sind, waschen Sie das Gerät mit 1x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (1x PBS) anschließend mit Fibronektin (100 ug / ml, dilausgeschüttet mit 1x PBS) und Inkubation im Kühlschrank bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Nach dem Fibronectinbeschichtung, waschen Sie das Gerät mit 1x PBS dann mit Kulturmedium zu laden. Inkubieren der Vorrichtung bei einer Temperatur von 37 ° C für 15 min. </li><li> Legen Sie die HUVEC-Zellen in 8% Dextran Kulturmedium mit einer Zellkonzentration von 3-4 x 10 6 Zellen / ml. Legen Sie eine 20 ul Tröpfchen von Zellen an einem Einlass des Geräts und kippen, um die Zellen in den mikrofluidischen Kanal einzuführen. Nach 15-20 min werden die Zellen beginnen zu den Seitenwänden der Kanäle zu befestigen. Drehen Sie das Gerät alle 15 Minuten, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu schaffen. Falls erforderlich, kann eine zusätzliche Belastung durchgeführt werden. </li></ol> 4. Langfristige Perfusion-Setup Nach 5-6 h statischer Kultur, werden die angeschlossenen HUVECs beginnen, voll ausbreiten. Richten Sie Perfusion mit einem ferngesteuerten Spritzenpumpensystem mit einem stetigen Strom von 10 ul / hr. Perfusion kann f eingestellt werdenoder eine höhere Strömungsgeschwindigkeit und kann für einen Zeitraum von 4 Tagen auf 2 Wochen. 5. Zellfärbung und Mikroskop Charakterisierung <ol><li> Wenn die Zellen Konfluenz erreichen im Inneren des Gerätes, erstens, waschen Sie das Gerät mit 1x PBS gründlich zu entfernen das Medium. Dann laden Sie das Gerät mit roter Farbstoff mit Verdünnungsmittel (4 ul-1 ml) verdünnt. Legen Sie den Farbstoff ähnlich der Zelle Ladevorgang. Inkubieren der Vorrichtung in der Dunkelheit für 5 min bei Raumtemperatur und anschließend Waschen der Vorrichtung mit Kulturmedium, um die Färbung zu beenden. Lange Inkubationszeit des Farbstoffes kann zelluläre Toxizität und disadhesion. </li><li> Legen Sie das Gerät mit blauer Farbstoff mit 1x PBS (2 Tropfen pro ml) verdünnt. Im Dunkeln für 5 min bei Raumtemperatur und anschließend gründlich mit 1x PBS Gerät. </li><li> Untersuchen Sie die Zellfärbung unter einem inversen Lichtmikroskop. Wenn die Färbung war gut, laden die Mikrokanäle mit Befestigung Medium (3,5% Paraformaldehyd mit 1x PBS verdünnt), dann tauchendas Gerät bei der Festsetzung der mittleren und vollständig bedecken Sie es mit Alufolie. Lagern Sie das Gerät im Kühlschrank bei einer Temperatur von 4 ° C, um das Gerät vor dem Austrocknen und Ausbleichen zu verhindern. Die feste Vorrichtung ist nun bereit für die konfokale Abbildung, die von einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt werden kann. </li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

<html> 1. Meister Formenbau Einer der Gestaltung und Leitprinzipien für vaskuläre Morphometrie als Murray Gesetz 16, was bedeutet, dass die Verteilung der Gefäßdurchmesser im gesamten Netzwerk von Mindestanforderungen an die Gesamtenergieeffizienz Gegenleistung regierten Staaten bekannt. Weiter heißt es, dass der Würfel der Durchmesser eines Elternteils Gefäß an einer Verzweigung der Summe der Potenzen der Durchmesser der Tochter Schiffe gleich ( <img alt="Gleichung 1" fo:cont...

Mikrogefäßen als Teil des Kreislaufsystems, vermitteln die Wechselwirkungen zwischen Blut und Gewebe, unterstützt Stoffwechselaktivitäten, definieren Gewebe Mikroumgebung und spielen eine entscheidende Rolle in vielen Gesundheits-und pathologischen Bedingungen. Zusammenfassung der funktionellen microvessels in vitro konnte eine Plattform für die Untersuchung von komplexen vaskulären Erscheinungen bereitzustellen. Jedoch sind herkömmliche in vitro Assays microvessel wie Endothelzellmigration Assays Bildung endothelialer Gefäße Assays und Ratte und Maus Aortenring Assays nicht die in vivo microvessels neu in Bezug auf dreidimensionale (3D)-Geometrie und kontinuierlichen Steuerung 1-8. Studium der Mikrogefäßen anhand von Tiermodellen und in-vivo-Untersuchungen, wie Hornhaut-Angiogenese-Assay, chick Chorioallantoismembran Angiogenese Assay und Matrigel-Plug-Assay sind zeitaufwendiger, hohe Kosten, herausfordernde bezüglich Beobachtung und Quantifizierung undethische Fragen aufwerfen, 1, 9-13. Advances in Mikrotechnik und Mikrofluidik-Chip-Technologien haben eine Vielzahl von Einblicken in biomedizinischen Wissenschaften aktiviert, während beschneidet die hohen experimentellen Kosten und Komplexitäten mit Tieren und in vivo-Studien 14, wie einfach und streng kontrolliert biologischen Bedingungen und dynamischen Umgebungen Fluidik, die nicht hätten zugeordnet war mit herkömmlichen makroskopischen Techniken möglich. Hier präsentieren wir einen Ansatz für eine endothelialisierten konstruieren Mikrokanäle-on-a-Chip, der die 3D-Geometrie in vivo Mikrogefäßen imitiert und läuft unter kontrollierten kontinuierlichen Perfusionsfluss durch die einzigartige Kombination von Photolithographie reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie, und Mikrofluidik.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflow Photoresist</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>AZP4620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>AZ 400K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 131 Culture Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NacBlue Nuclei Staining</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH Red Stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MINI26 and PKH26GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHE0023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffered Saline Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizing Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Curing Agent</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diluent C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CGLDIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>BelArt Products</td>
			<td>999320237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump System</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD Ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Biosafety Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary Centrifugal Mixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-246-516GAQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Invertoskop 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne Cimarec</td>
			<td>SP131635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure for the development of multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip

Die Anstrengungen haben sich auf die Entwicklung in-vitro-Assays zur Untersuchung der Mikrogefäßen konzentriert, weil in vivo Tierstudien mehr zeitaufwendig, teuer und Beobachtung und Quantifizierung sind sehr anspruchsvoll. Jedoch haben herkömmliche in vitro Assays microvessel Einschränkungen bei der Darstellung in vivo microvessels bezüglich dreidimensionale (3D)-Geometrie und eine kontinuierliche Strömung. Mit einer Kombination von Photolithographie reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie und Mikrofluidik, haben wir eine Multi-Tiefe kreisförmigen Querschnitt endothelialisierten entwickelt Mikrokanäle-on-a-Chip, der die 3D-Geometrie in vivo Mikrogefäßen imitiert und läuft unter kontrollierten kontinuierliche Perfusion fließen. Eine positive reflowable Photoresist wurde verwendet, um eine Master-Form mit einem halbkreisförmigen Querschnitt Mikrokanal Netzwerk herzustellen. Nach der Ausrichtung und Verbindung der beiden Polydimethylsiloxan (PDMS) Mikrokanäle ersicated von der Urform wurde ein zylindrischer Mikrokanal Netzwerk erstellt. Die Durchmesser der Mikrokanäle kann gut beherrscht. Darüber hinaus zeigte primäre humane Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs) innerhalb des Chips ausgesät, dass die Zellen mit der Innenfläche der Mikrokanäle ausgekleidet unter kontrollierten Perfusion dauernd für einen Zeitraum von 4 Tagen bis 2 Wochen.

Unser Ansatz für die Multi-Tiefe Mikrokanalstruktur Netzwerk herzustellen ahmt die komplexen 3D-Geometrien in vivo Mikrogefäßen, in denen die Mikrokanäle haben abgerundete Querschnitte 15. Darüber hinaus sind die Durchmesser der übergeordneten Verzweigung Kanäle und die Kanäle Tochter etwa gehorchen Murray Gesetz zur Aufrechterhaltung der Fluidströmung an einen erforderlichen Pegel, so dass der gesamte Kanal ist niedrig und Strömungsgeschwindigkeiten gleichmäßiger im gesamten Netzwerk <su...

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Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

A Mikrokanälen-on-a-Chip-Plattform wurde durch die Kombination von photolithographischen reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie und Mikrofluidik entwickelt. Die endothelialisierten Mikrokanäle Plattform imitiert die dreidimensionale (3D) Geometrie in vivo Mikrogefäßen läuft unter kontrollierten kontinuierlichen Perfusionsfluss, ermöglicht qualitativ hochwertige und Echtzeit-Bildgebung und kann für mikrovaskuläre Forschung angewendet werden.

Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.8K Aufrufe.  West Virginia University.  A Mikrokanälen-on-a-Chip-Plattform wurde durch die Kombination von photolithographischen reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie und Mikrofluidik entwickelt. Die endothelialisierten Mikrokanäle Plattform imitiert die dreidimensionale (3D) Geometrie in vivo Mikrogefäßen läuft unter kontrollierten kontinuierlichen Perfusionsfluss, ermöglicht qualitativ hochwertige und Echtzeit-Bildgebung und kann für mikrovaskuläre Forschung angewendet werden. 

Serie: Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

Vorgehensweise für Lung Technik

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Forschung

Biotechnik

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Perfusion-based whole organ decellularization has recently gained interest in the field of tissue engineering as a means to create site-specific extracellular matrix scaffolds, while largely preserving the native architecture of the scaffold. To date, this approach has been utilized in a variety of organ systems, including the heart, lung, and liver 1-5. Previous decellularization methods for tissues without an easily accessible vascular network have relied upon prolonged exposure of tissue to solutions of detergents, acids, or enzymatic treatments as a means to remove the cellular and nuclear components from the surrounding extracellular environment6-8. However, the effectiveness of these methods hinged upon the ability of the solutions to permeate the tissue via diffusion. In contrast, perfusion of organs through the natural vascular system effectively reduced the diffusion distance and facilitated transport of decellularization agents into the tissue and cellular components out of the tissue. Herein, we describe a method to fully decellularize an intact porcine heart through coronary retrograde perfusion. The protocol yielded a fully decellularized cardiac extracellular matrix (c-ECM) scaffold with the three-dimensional structure of the heart intact. Our method used a series of enzymes, detergents, and acids coupled with hypertonic and hypotonic rinses to aid in the lysis and removal of cells. The protocol used a Trypsin solution to detach cells from the matrix followed by Triton X-100 and sodium deoxycholate solutions to aid in removal of cellular material. The described protocol also uses perfusion speeds of greater than 2 L/min for extended periods of time. The high flow rate, coupled with solution changes allowed transport of agents to the tissue without contamination of cellular debris and ensured effective rinsing of the tissue. The described method removed all nuclear material from native porcine cardiac tissue, creating a site-specific cardiac ECM scaffold that can be used for a variety of applications.

A method to rapidly and completely remove cellular components from an intact porcine heart through retrograde perfusion is described. This method yields a site specific cardiac extracellular matrix scaffold which has the potential for use in multiple clinical applications.

Verfahren für Dezellularisierung der Porcine Heart von Retrograde Coronary Perfusion

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

Methoden zur Charakterisierung des Co-Entwicklung von Biofilm und Habitat Heterogenität

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

Qualitative Charakterisierung der wässrigen Fraktion von hydrothermale Verflüssigung von Algen mit Hilfe von 2D-Gaschromatographie mit Time-of-Flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Entwicklung eines unter Schwerelosigkeits Vielzellige Dreidimensionale Organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut Grown

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

Zusammenbau und Verfolgung der mikrobiellen Gemeinschaftsentwicklung innerhalb einer Microwell Array Plattform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the adhesive cure, and the effect of adhesive penetration on the wood interphase; thus, normal testing of a neat adhesive film is generally not useful. Most tests of wood adhesive bond strength are slow, laborious, can be strongly influenced by the wood and do not provide information on the kinetics of cure. Test method ASTM D 7998-19, however, can be used for fast evaluation of the strength of wood bonds. The use of a smooth, uniform, and strong wood surface, like maple face-veneer, and sufficient bonding pressure reduces the adhesion and wood strength effects on bond strength. This method has three main applications. The first is to provide consistent data on bond strength development. The second is to measure the dry and wet strengths of bonded lap shear samples. The third is to better understand the adhesive heat resistance by quickly evaluating thermal sensitivity and distinguishing between thermal softening and thermal degradation.

We present a procedure, ASTM D7998-19, for a rapid and more consistent evaluation of both dry and wet strength of adhesive bonds on wood. The method can also be used to provide information on strength development as a function of temperature and time or strength retention up to 250 &#176;C.

Standardprüfverfahren ASTM D 7998-19 zur kohäsiven Festigkeitsentwicklung von Holzklebstoffen

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the ...

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and size distribution of nanoparticles is of utmost importance for various applications. The size range is also important, as it defines the most &#8220;active&#8221; component of a nanoparticle dose.
Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation (AF4) is a powerful technique for sizing of particles in suspension in the size range of approximately 1&#8211;1000 nm. There are several ways to derive size information from an AF4 experiment. Besides coupling AF4 online with size-sensitive detectors based on the principles of Multi-Angle Light Scattering or Dynamic Light Scattering, there is also the possibility to correlate the size of a sample with its retention time using a well-established theoretical approach (FFF theory) or by comparing it with the retention times of well-defined particle size standards (external size calibration).
We here describe the development and in-house validation of a standard operating procedure (SOP) for sizing of an unknown gold nanoparticle sample by AF4 coupled with UV-vis detection using external size calibration with gold nanoparticle standards in the size range of 20&#8211;100 nm. This procedure provides a detailed description of the developed workflow including sample preparation, AF4 instrument setup and qualification, AF4 method development and fractionation of the unknown gold nanoparticle sample, as well as the correlation of the obtained results with the established external size calibration. The SOP described here was eventually successfully validated in the frame of an interlaboratory comparison study highlighting the excellent robustness and reliability of AF4 for sizing of nanoparticulate samples in suspension.

This protocol describes the use of Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation coupled with UV-vis detection for the determination of the size of an unknown gold nanoparticle sample.

Asymmetrische Durchflussfeld-Flow-Fraktionierung zur Dimensionierung von Gold-Nanopartikeln in Suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...