O apoio foi prestado por Becton Dickinson Technologies. As opiniões expressas nesta apresentação são de responsabilidade dos autores e não pretendem refletir a política oficial do governo dos EUA. A pesquisa foi realizada em conformidade com o Animal Welfare Act e outras leis federais e regulamentos relativos aos animais e experimentos envolvendo animais e adere a princípios estabelecidos no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, National Research Council, 1996. O local onde foi realizada esta pesquisa está totalmente credenciada pela Associação de Avaliação e Acreditação do Animal de Laboratório Care International.

1. Colecção NALT e cultura <ol><li> Euthanize ratos usando aprovado orientação IACUC. Evite o uso de anestésicos inalantes que possam afetar NALT. Transferência ratos para um espaço de trabalho asséptico ou cabine de segurança biológica. Retire o maxilar inferior do mouse e limpar a área palato superior com toalhetes com álcool e iodo. </li><li> Use uma lâmina cirúrgica n º 11 no cabo da faca cirúrgica para cortar cuidadosamente e consumo do palato superior, seguindo o contorno interior dos dentes incisivos do rato e os dentes molares. </li><li> Suavemente descole o paladar com uma pinça, tomando cuidado para não rasgar o paladar. </li><li> Este passo é necessário para reduzir a contaminação das culturas e é desenhado para processar paladares múltiplas. Paladares lugar em poços individuais na primeira coluna de uma placa de 48 poços estéreis pré-cheias com 250 uL de meio de cultura completo (37 ° C) consistindo em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino, estreptomicina 100 ug / mL, 100 UI / mL de penicilina, 50 ug / mL de gentamicinae 1 mg / mL fungizona / anfotericina. Os meios devem ser tamponadas se carbonato de paladares são cultivadas em um 5% de CO2 / 95% húmido incubadora de ar (37 ° C), ou, alternativamente, utilizar HEPES 10 mM, pH 7,4, para não-CO cultura 2. </li><li> Para lavar os paladares, utilize uma pinça para mover paladares em cada poço sucessiva em uma linha, cuidadosamente tocar no prato entre as lavagens, até o palato foi submetido a um total de oito lavagens. </li><li> Transfira os paladares em uma nova placa de 48 poços estéril contendo 250 uL de meio de cultura fresco, completo (37 ° C) em poços. </li><li> Colocar as placas contendo os paladares numa incubadora a 37 ° C para a cultura durante a duração do estudo. </li><li> Recolher amostras para análise por transferência de assepticamente 100 uL de meio de cultura a partir de poços em tubos Eppendorf a cada 24 horas, substituindo com 100 uL de 37 ° fresco meio de cultura C. </li><li> Centrifugar media das amostras de cultura a 380 xg durante 10 minutos, 4 ° C, para os detritos de ressuspensão. </li><li> Transferir o sobrenadante a partir da amostra centrifugada para tubos frescos Eppendorf e armazenar a -20 ° C até estar pronto para analisar. </li><li> Antigénio específico IgG, IgM e IgA, ou citocinas secretadas são medidos em sobrenadantes de cultura de tecidos por padrão enzyme-linked immunosorbent (ELISA). </li></ol> 2. Ablação cirúrgica da NALT <ol><li> Fêmeas BALB / c, de 7 a 9 semanas de idade, são sujeitos adequados, mas outras estirpes são também aceitáveis. Fornecer-gel como alimento molhado três dias antes da cirurgia para se aclimatarem rato a comida e água substituto que será administrado pós-operação. </li><li> Administrar uma gota de medicamento Metacam alívio da dor (1,5 mg / ml ou 0,05 mg / gota) para a cavidade oral antes da cirurgia. </li><li> Anestesiar ratos usando aprovado orientação IACUC, por exemplo, com uma cetamina, acepromazina, ea mistura de xilazina (KAX) e aplicar Pomada Vet Puralube para os olhos para evitar a secagem. Evite o uso de anestésicos inalantes que possam afetar NALT. Anesthesia pode ser confirmado pela ausência de resposta a um reflexo beliscadura suave dos dedos dos pés. </li><li> Administrar 1 ml de solução salina (0,9% de sódio USP injecção de cloreto) por via subcutânea entre as omoplatas usando uma agulha de calibre 22-28 e seringa para evitar a desidratação potencial do rato após a cirurgia. Também administrar 0,1 mL de Respiram por via subcutânea entre as omoplatas usando uma agulha de calibre 22-28 e seringa para promover a respiração saudável durante e após a cirurgia. </li><li> Fornecer suporte térmico para o mouse durante todas as manipulações posteriores. </li><li> Posicione o mouse anestesiados em decúbito dorsal, e usar dois loops separados de sutura cirúrgica, em torno dos incisivos superiores e inferiores suavemente para forçar a abertura da boca, expondo o palato superior. </li><li> Usar uma lâmina cirúrgica No. 11 para fazer uma incisão de aproximadamente 3 mm de comprimento para baixo da linha média do palato superior no local da NALT. </li><li> Insira um microcurette 0,5 mm na incisão e raspe com as bordas paraperturbar o NALT. </li><li> Cauterizar a incisão para parar o sangramento com um laço direto bem em uma unidade térmica cautério. </li><li> Continuar a apoiar térmico enquanto se recupera do mouse para a plena consciência e atividade. </li><li> Fornecer rato com uma solução salina por via subcutânea até três vezes por dia, 1 ml por injecção entre as omoplatas, para evitar a desidratação como medicação para a dor necessário e por via oral uma vez por dia durante 3 dias pós-cirurgia. Determinar a desidratação através da realização de um teste de pele tenda para verificar turgor da pele. Agarrar a pele e pelagem entre as lâminas de ombros de modo que é tenda para cima. Se a pele rapidamente retorna para a posição normal, anterior, o rato não é desidratado. Se a pele permanece elevada e move-se lentamente, o rato se encontra num estado de desidratação e requer salina. Fornecer alimento molhado por pelo menos três dias após a cirurgia para permitir tempo suficiente para a recuperação. </li><li> Antes de quaisquer procedimentos experimentais, os ratos para observar 8-10 dias seguindo o ganho de peso. Recuperação do peso pobresgeralmente indica cura palato incompleta, e esses ratos devem ser retirados estudos posteriores. </li></ol> 3. Preparando NALT para Histologia e avaliar o sucesso de Cirurgia NALT <ol><li> O sucesso da cirurgia NALT deverá ser verificado por histologia, como descrito abaixo. Depois de completar todos os estudos experimentais, preparar ratos para coleções cranianos por eutanásia utilizando aprovado orientação IACUC. Evite o uso de anestésicos inalantes que possam afetar NALT. </li><li> Segure a nuca do mouse sacrificados. Remover o mandíbula inferior do resto do crânio cortando através dos processos condilares com uma tesoura de ambos os lados. </li><li> Começando pela nuca, retire a pele e pêlo do crânio por lentamente descascar e cortar para o lado ventral do crânio. </li><li> Cuidadosamente remover a pele em torno da área nasal e cortar a pele fora da ponta do focinho para remover completamente. </li><li> Retire o crânio da sagacidade vértebrasha recorte da tesoura. </li><li> Insira uma tesoura no forame magno e cortar na metade do crânio ao longo da linha média para permitir a permeação de formol para os tecidos moles durante a fixação. </li><li> Corrigir crânio em 10% formalina tamponada neutra (NBF) durante 24 horas à temperatura ambiente. </li><li> Para descalcificar, colocar a amostra e cassete separada, envolta em gaze para evitar Rexyn de tocar no osso, em garrafa com a mistura de ácido fórmico. Incubar durante 12 horas à temperatura ambiente, em seguida, lavar continuamente sob água da torneira durante cerca de 20 minutos. </li><li> Apare a amostra para o septo e órbitas passado o olho com uma lâmina de barbear. </li><li> Amostra e cassete pode ser armazenado por curto prazo em NBF 10%. </li><li> Coloque amostra para um processador de tecidos para o processamento durante a noite. Isto é feito para remover a água a partir da amostra, em preparação para inclusão em parafina. </li><li> Remover o tecido processado, incorporar em um bloco de parafina com o focinho para baixo, e deixe-a arrefecer. </li><li> Apare rOUGH 15 uM secções transversais do bloco com um micrótomo automatizado, aproximando-se a localização aproximada da NALT, em seguida, continuar o corte em 5 secções iM para a montagem em lâminas de vidro em um banho de água 44,3 ° C. </li><li> Hematoxilina e eosina (H e E) de coloração histológica deve ser usado para avaliar a ablação NALT. </li></ol> 4. Coleta de amostras biológicas de ratos 4,1 Soro <ol><li> Cuidadosamente elevando a temperatura do corpo com uma lâmpada de calor irá aumentar o fluxo sanguíneo. Colher sangue por cortando a veia lateral da cauda com uma lâmina cirúrgica. Permitir que o sangue a escorrer livremente dentro de um tubo separador Microtainer soro. </li><li> Aplique uma pressão suave para nick com material absorvente, como gaze ou toalha, para parar o fluxo de sangue. </li><li> Permitir que a coagulação do sangue nas Microtainers durante 30 minutos, em seguida, centrifuga entre 6-15 x 1000 g durante pelo menos 90 segundos. </li><li> Transferência separados soro de Microtainer para um tubo de Eppendorf limpo paraarmazenamento a -80 ° C. </li></ol> 4,2 Saliva <ol><li> Segurar o rato anestesiado verticalmente enquanto pipetagem 20-30 fosfato uL estéril tamponada (PBS) entre a bochecha ea gengiva. Coletar a saliva diluída dirigindo ponta da pipeta entre a bochecha ea gengiva. </li><li> Transferir a saliva diluída a um tubo fresco contendo 10 ul de inibidor de protease 2x e armazenar a -20 ° C. </li></ol> 4.3 As secreções nasais <ol><li> Euthanize do mouse antes de recolher secreções nasais, usando a orientação IACUC aprovado. Evite o uso de anestésicos inalantes que possam afetar NALT. </li><li> Segurando o mouse verticalmente, com cuidado pipetar 30 uL de PBS estéril em uma narina e recolher lavar de outra narina. </li><li> Transferir lavagem para um tubo fresco contendo 10 ul de inibidor de protease 2x e armazenar a -20 ° C. </li></ol> 4.4 As secreções vaginais <ol><li> Introduzir a ponta de uma micropipeta para dentro da abertura de the vulva de um mouse eutanásia, lavar a vagina com 50 mL de PBS estéril e recolher todo o fluido por micropipeta. </li><li> Transferir lavagem para um tubo fresco contendo 10 ul de inibidor de protease 2x e armazenar a -20 ° C. </li></ol> 5. Antigénio de anticorpos específicos ou citocinas nas amostras recolhidas podem ser medidos por ELISA ou outro método quantitativo. 6. Os resultados representativos A Figura 1 fornece uma representação esquemática geral de passos envolvidos com o processamento do tecido NALT contendo para análise ex vivo. Na Figura 2 (A, B), o tamanho do palato é mostrado, bem como o local da incisão durante a cirurgia de ablação (A), como indicado pela linha pontilhada. A localização do NALT são indicadas por setas na área pré-molares em um excisado palato hematoxilina-corados na Figura 2 (C), mostrando os tecidos paralelas. A Figura 3apresenta passos da cirurgia ruptura NALT, mostrando a exposição do palato superior para o acesso a NALT (A, B), a ablação (C), e cauterização final da incisão (D). Um típico H e E secção transversal da área do seio nasal em torno do NALT antes da cirurgia é mostrado na Figura 3E, enquanto uma imagem de ruptura NALT pelo microcurette directamente após a cirurgia aparece na Figura 3F. Permitindo tempo suficiente para a recuperação de uma cirurgia, as incisões deve ser fechado ea cavidade nasal desprovido de NALT (Figura 3G). Típicos resultados experimentais obtidos usando estas técnicas são mostradas na Figura 4, comparando os sobrenadantes de cultura de tecidos e as amostras biológicas a partir de um estudo de uma vacina de subunidade estafilocócica (STEBVax). Os ratinhos foram administrados por STEBVax intranasal (IN) ou intraperitoneal (ip) rotas. A vacina foi formulada com um adjuvante que ativa o receptor Toll-like 4 vias 3,1<html> 4, e os controlos foram dadas apenas a solução salina ou vacina sem adjuvante. NALT Cultured obtido a partir de grupos experimentais secretada específicas de antigénio imunoglobulinas em meio que era mensurável por ELISA. Neste exemplo (Figura 4A), os resultados indicam que as maiores quantidades de IgA foram libertados por NALT obtido a partir de ratinhos vacinados com uma vacina de subunidade combinado com adjuvante. As amostras biológicas (tais como saliva, soro, secreções nasais, secreções vaginais) adquiridos a partir de controlo ou NALT livres de ratinhos pode ser usado para determinar o perfil da in vivo a resposta imune a antigénios nasais para comparação com os resultados de cultura de tecidos. Na Figura 4B, IgA e IgG respostas na vacinação foram significativamente reduzida sem NALT funcional. Os níveis de antigénio específico IgA foram geralmente maior do que a IgG em secreções mucosas (saliva, lavagens nasais) de ratinhos vacinados. upload/3960/3960fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Esquemático de NALT recolha e cultura ex vivo. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig2.jpg" /> Figura 2. Visualização do palato rato que indica a posição de incisão NALT e cirurgia. Tamanho e localização do palato superior, com incisão da cirurgia indicada pela linha pontilhada (A); palato superior cortado (B) ou corados em hematoxilina (C) para ver o NALT paralelo na área pré-molar do palato (manchas roxas escuras na face anterior do palato ). NALT indicado pelas setas. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig3.jpg" /> Figura 3. Ruptura NALT cirúrgica. As principais fases da cirurgia interrupção NALT: vista supina do palato superior do mouse antes da cirurgia (A); incisão mediana feita em palato superior para acessar o NALT (B); microcurette sonda inserida através de uma incisão na linha média para interromper estrutura NALT emTegrity (C); cauterização de incisão na conclusão da operação (D). As imagens microscópicas das cavidades nasais e coradas H &amp; E, antes da cirurgia (E), imediatamente após a cirurgia (F), e um sucesso curado, rato NALT-livre (G). <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig4.jpg" /> Figura 4. Vacinas específicas de anticorpos de NALT cultivadas, saliva e secreções nasais recolhidos a partir de ratinhos vacinados. Camundongos de controle NALT livres ou normal ou foram vacinadas em IP com STEBVax, e amostras biológicas foram coletadas. Os níveis de anticorpos de amostras em triplicado foram medidos através de ELISA. (A) NALT foram removidos a partir de ratos de controlo (não manipulada cirurgicamente) e cultivadas para examinar as respostas de anticorpos. A vacina específica resposta de IgA em cultura durante Em ratinhos vacinados foi estatisticamente diferente dos controlos de (teste t de Student-, p ≤ 0,01, em comparação com nenhuma adjuvante ou nenhuma vacina). (B) uma ruptura NALT substancialmente reduzida respostas de anticorpos específicosa IN vacinação. Houve diferenças significativas entre os níveis de anticorpos específicos de NALT e NALT + grupos (sem cirurgia cirurgia ou controle) para todas as comparações, exceto resultados saliva IgG (teste t de Student, p ≤ 0,05).

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Não há conflitos de interesse declarados.

Apresentamos métodos colectivos para o desenvolvimento de um modelo animal, a obtenção de amostras biológicas, e ensaios de análise dos NALT-associados respostas imunes 1-4. Há fatores adicionais a serem considerados durante a execução destes métodos. Padrão técnicas estéreis para cirurgia e cultura de tecidos devem ser seguidas. Uma combinação de agentes antibacterianos e antifúngicos utilizados durante o isolamento e cultura, assim como a manutenção dos instrumentos esterilizados, área de trabalho e paladares desinfectadas irá reduzir o risco de contaminação. Saliva, lavagens nasais e semelhantes amostras de secreção mucosa devem ser inspecionados para potencial contaminação com sangue, como de anticorpos séricos são geralmente encontrados em concentrações mais elevadas. Além disso, as secreções mucosas só deve ser ligeiramente diluída para análise, porque as concentrações mais baixas de anticorpos estão presentes nessas amostras em comparação com soro. Ratos deve ser mantido quente directamente após a cirurgia para prédesabafar Hipotermia decorrente de anestesia potencial. Alternativas ratos em repouso em seus lados durante a recuperação pós-cirurgia para minimizar a respiração irregular. O procedimento cirúrgico é mais eficiente, com três indivíduos que trabalham juntos para completar estas tarefas: uma realização da cirurgia, uma para ajudar a segurar a boca aberta, e um para fornecer o cuidado pós-cirúrgico, como os ratos recuperar da anestesia. É necessário utilizar H e E coloração de cranianos secções transversais na extremidade de todos os procedimentos experimentais ou em estudos para verificar o sucesso da operação para cada rato. Os resultados da cirurgia são possíveis: a ablação NALT completa e bilateral, a ablação incompleta ou NALT intacta. Uma vez que nem todas as cirurgias irá resultar na perda completa da NALT, os animais com NALT residual ou intactos podem ser utilizados como controlos internos. Outro resultado potencial é que o paladar não curar completamente, deixando uma abertura de ligação da nasal e as cavidades orais. Incompletocura do palato irá resultar em baixo peso e falha de crescimento, e estes indivíduos devem ser removidos a partir de estudos. Examinando as respostas primeira vacina com o modelo de rato irá servir para estabelecer um papel para NALT no resultado do estudo pretendido (resposta de anticorpos, a sobrevivência, etc.) A remoção cirúrgica do NALT facilita a determinação das contribuições nasais a imunidade local e sistêmica. A abordagem cirúrgica descrita aqui é o método mais direto para a obtenção de um modelo de mouse sem NALT. Seleccione knock-out modelos de ratos foram relatados para NALT falta, mas estes animais também são deficientes em citocinas ou quimiocinas essenciais para o desenvolvimento de outros tecidos linfóides secundários, e pode conter defeitos adicionais 12,13. Além disso, os métodos descritos aqui foram desenvolvidos para análise de vários aspectos de respostas imunes que originam dentro das passagens nasais. Os resultados experimentais são baseados em estudos utilizando o palat toda a parte superiore do rato para cultura de tecidos, embora seja possível que as secções podem ser utilizados. Finalmente, o modelo NALT cultivadas é útil para a realização de experiências completamente em cultura de tecidos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> De aço inoxidável esterilizadas lâminas cirúrgicas, No. 11 </td><td> Miltex </td><td> 4-311 </td><td></td></tr><tr><td> Cabo da faca, No. 3 </td><td> Miltex </td><td> 4-7 </td><td></td></tr><tr><td> 48-poços de cultura placas da célula </td><td> Costar </td><td> 3548 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Soro de bovino fetal, inactivado pelo calor </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> Concentração final: 10% em volume em meios de cultura </td></tr><tr><td> Sulfato de estreptomicina </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td> Concentração final: 100 mcg / ml </td></tr><tr><td> Penicilina </td><td> Sigma </td><td> P7794 </td><td> Final Conc: 100 UI / mL </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397-10ML </td><td> Concentração final: 50 ug / mL </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td> Concentração final: 1 ug / mL </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0887 </td><td> Concentração final: 10 mM </td></tr><tr><td> Microcentrífuga Eppendorf Tubes </td><td> Eppendorf </td><td> 022364111 </td><td></td></tr><tr><td> Nutra-gel de cerejeira Comida Rato Molhado Flavored </td><td> Bio-Servir </td><td> S4798 TRAY- </td><td></td></tr><tr><td> Metacam </td><td> Boehringer Ingelheim </td><td> 601531000 </td><td> Uma gota de 1,5 mg / ml suspensão oral </td></tr><tr><td> Ketamina </td><td> Pfizer </td><td> 00856440301 </td><td> Co finalnc: 6,06 mg / mL </td></tr><tr><td> Acepromazina </td><td> Vedco </td><td> VEDC207 </td><td> Final Conc: 0,061 mg / mL </td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Lloyd </td><td> 4811 </td><td> Final Conc: 0,667 mg / mL </td></tr><tr><td> Puralube Pomada Vet </td><td> Pharmaderm Saúde Animal </td><td> 1621 </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% de sódio USP Injecção de Cloreto </td><td> Baxter </td><td> 2B1302 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 milímetros Microcurette </td><td> Roboz </td><td> RS-6350 </td><td></td></tr><tr><td> Unidade Cauterização Térmica </td><td> Geiger </td><td> 150-S/150A-S </td><td></td></tr><tr><td> TCU Dica substituição, Loop Fino Direto </td><td> Geiger </td><td> 214 </td><td></td></tr><tr><td> Tesoura cirúrgica </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10% formalina tamponada neutra </td><td> Sigma </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido fórmico </td><td> Pescador </td><td> A119P-4 </td><td> Misturar 426 mL de ácido fórmico em 1047 mL de água da torneira, em seguida, adicionar 45 mL Rexyn 101 (H) </td></tr><tr><td> Rexyn 101 (H) </td><td> Pescador </td><td> R231-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek VIP E150/E300 </td><td> Sakura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micrótomo rotativo </td><td> Leica </td><td> RM2255 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxilina de Mayer </td><td> Sigma </td><td> MHS16-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Gill No.1 Hematoxilina </td><td> Sigma </td><td> GHS116 </td><td></td></tr><tr><td> Eosina B </td><td> Sigma </td><td> 2853 </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer separador de soro </td><td> BD Médico </td><td> 365956 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaH 2 PO 4, 140 mM de NaCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Cocktail de inibidores da protease, EDTA-livre </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78415 </td><td></td></tr></tbody></table>

examining the role of nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (nalt) in mouse responses to vaccines

Os tecidos da nasofaringe-associados (linforreticular NALT) encontrados em seres humanos, roedores, e outros mamíferos, contribuir para a imunidade nos seios nasais 1-3. O NALT são duas paralelas em forma de sino estruturas localizadas nas passagens nasais acima do palato duro, e são geralmente considerados como componentes secundários do sistema da mucosa linfóide associado 4-6. Localizado dentro do NALT são compartimentos discretos de linfócitos B e T intercaladas com apresentadoras de antigénio de células dendríticas 4,7,8. Estas células estão rodeados por uma camada de células epiteliais, intercaladas com M-células que são responsáveis ​​para a recuperação de antigénio a partir das superfícies das mucosas das passagens de ar 9,10. Linfócitos ingênuas que circulam através da NALT estão preparados para responder aos primeiros encontros com patógenos respiratórios 7. Enquanto NALT desaparecer em seres humanos até a idade de dois anos, os órgãos do anel linfático de Waldeyer e da mesma forma estruturada continuam a persistir ªroughout vida 6. Em contraste com os seres humanos, os ratinhos reter NALT durante toda a vida, proporcionando assim um modelo animal conveniente para o estudo das respostas imunitárias originários dentro dos seios nasais 11. As culturas de célula única suspensões de NALT não são práticos devido a baixos rendimentos de células mononucleares. No entanto, a biologia NALT pode ser examinada por cultura ex vivo do órgão intacta, e este método tem a vantagem adicional de manter a estrutura de tecido natural. Para os estudos in vivo, os modelos de nocaute genético apresentando defeitos limitados a NALT não estão atualmente disponíveis devido a uma má compreensão da via de desenvolvimento. Por exemplo, enquanto linfotoxina-ct ratinhos knockout atrofiaram NALT, placas de Peyer, nódulos linfáticos periféricos, células dendríticas foliculares e outros tecidos linfóides também são alterados nestes ratos geneticamente manipulados 12,13. Como uma alternativa para ratinhos knockout de genes, p ablação cirúrgicaermanently elimina NALT da passagem nasal, sem afetar outros tecidos. O modelo de rato resultante foi usado para estabelecer relações entre as respostas de NALT e imune às vacinas 1,3. Colecção de série do soro, saliva, lavagens nasais e secreções vaginais é necessário para o estabelecimento da base da resposta do hospedeiro à vacinação, enquanto que as respostas imunitárias originários directamente a partir NALT pode ser confirmada por cultura de tecidos. Os procedimentos a seguir descrevem as cirurgias, cultura de tecidos e coleta de amostra necessários para examinar locais e sistêmicos resposta imune humoral a vacinação intranasal (IN).

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Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Métodos para examinar as contribuições dos tecidos da nasofaringe associados linforreticular (NALT) para nasais e sistêmicas respostas imunes de camundongos de vacinas intranasais são descritos. Nós demonstramos um procedimento cirúrgico para estabelecer um modelo de camundongo NALT-dependente e<em&gt; Ex vivo</em&gt; Culturas de NALT extraído.

Analisar o papel dos Nasopharyngeal-associado do tecido linforreticular (NALT) nas respostas do rato para Vacinas

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

examining-role-nasopharyngeal-associated-lymphoreticular-tissue-nalt

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

25.7K visualizações.  U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. Métodos para examinar as contribuições dos tecidos da nasofaringe associados linforreticular (NALT) para nasais e sistêmicas respostas imunes de camundongos de vacinas intranasais são descritos. Nós demonstramos um procedimento cirúrgico para estabelecer um modelo de camundongo NALT-dependente e Ex vivo Culturas de NALT extraído.

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Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Imunologia e Infecção

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Um modelo de mouse transiente Transientized IL-8 para o<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoramento de Longo Prazo de Respostas Inflamatórias

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpressão e purificação do ser humano<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferase em<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected antigen or a combination of antigens into a plasmid, which enables a tailor-made and safe design. The administration of DNA vaccines into host cells leads to the expression of antigens that stimulate both humoral and cell-mediated immune responses. This report describes a protocol for the cloning of antigen sequences into the pCMV-EGFP plasmid, the immunization of adult zebrafish with the vaccine candidates by intramuscular microinjection, and the subsequent electroporation to improve intake. The vaccine antigens are expressed as green fluorescent protein (GFP)-fusion proteins, which allows the confirmation of the antigen expression under UV light from live fish and the quantification of expression levels of the fusion protein with ELISA, as well as their detection with a western blot analysis. The protective effect of the vaccine candidates is tested by infecting the fish with Mycobacterium marinum five weeks postvaccination, followed by the quantification of the bacteria with qPCR four weeks later. Compared to mammalian preclinical screening models, this method provides a cost-effective method for the preliminary screening of novel DNA-based vaccine candidates against a mycobacterial infection. The method can be further applied to screening DNA-based vaccines against various bacterial and viral diseases.

Here we describe a protocol for the immunization of the adult zebrafish (Danio rerio) with a DNA-based vaccine and demonstrate the validation of a successful vaccination event. This method is suitable for the preclinical screening of vaccine candidates in various infection models.

Imunização do adulto Zebrafish para o rastreio pré-clínica de vacinas baseadas em DNA

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to eradicate tumors. However, its application is limited by the development of graft-versus-host disease (GVHD), a major complication of BMT. GVHD is evoked when T-cells in the donor grafts recognizealloantigen expressed by recipient cells and mount unwanted immunological attacks against recipient healthy tissues. Thus, traditional therapies are designed to suppress donor T-cell alloreactivity. However, these approaches substantially impair the GVL effect so that the recipient&#39;s survival is not improved. Understanding the effects of therapeutic approaches on BMT, GVL, and GVHD, is thus essential. Due to the antigen-presenting and cytokine-secreting capacities to stimulate donor T-cells, recipient dendritic cells (DCs) play a significant role in the induction of GVHD. Therefore, targeting recipient DCs becomes a potential approach for controlling GVHD. This work provides a description of a novel BMT platform to investigate how host DCs regulate GVH and GVL responses after transplantation. Also presented is an effective BMT model to study the biology of GVHD and GVL after transplantation.

Graft-versus-host disease is a major complication after allogeneic bone marrow transplantation. Dendritic cells play a critical role in the pathogenesis of graft-versus-host disease. The current article describes a novel bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in the development of graft-versus-host disease and the graft-versus-leukemia effect.

Plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas na doença enxerto-versus-hospedeiro

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

Transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA Transcrito in vitro

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...