Destek Becton Dickinson Technologies tarafından sağlanmıştır. Bu teslimiyet ifade Görüntüleme yazarlara aittir ve ABD hükümetinin resmi politikasını yansıtması iddiasında değildir. Araştırma Hayvan Refahı Yasası hayvanların ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı, Ulusal Araştırma Konseyi, 1996 Kılavuzunda belirtilen esaslara yapışır kapsayan hayvan ve deneyler ile ilgili diğer federal kanun ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmıştır. Bu araştırma yapılmıştır tesis Laboratuar Hayvan Bakımı Uluslararası Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği tarafından tamamen akredite edilmiştir.

1. NALT Toplanması ve Kültüre Alınması <ol><li> Onaylanmış IACUC rehberlik kullanarak farelerde Euthanize. NALT etkileyebilecek uçucu anestezik maddeler kullanmaktan kaçının. Aseptik bir çalışma alanı veya biyogüvenlik kabini fareler aktarın. Farenin alt çene çıkarın ve alkol ve iyot mendil ile üst damak temizleyin. </li><li> Dikkatli fare kesici ve azı dişlerin iç kontur takip ederek üst damak kesilmiş ve tüketim için cerrahi bıçak sapı bir No 11 cerrahi bıçak kullanın. </li><li> Damak gözyaşı özen forseps ile yavaşça geri soyma damak. </li><li> Bu adımda kültürlerin kirlenme azaltmak için gerekli olan ve çok sayıda damakları işlenmesi için tasarlanmıştır. Yer damakları steril bir 48-kuyulu plakalı tam kültür ortamı 250 uL ile önceden doldurulmuş birinci sütunda bireysel kuyulara (37 ° C)% 10 fetal bovin serumu, 100 ug / ml streptomisin, 100 ile takviye edilmiş RPMI 1640 oluşan UI / mL penisilin, 50 ug / ml gentamisinve 1 mcg / mL fungizone / amfoterisin. Ortam damakları bir% 5 CO2 /% 95 nemli hava inkübatöründe (37 ° C), ya da alternatif olarak non-CO 2 kültürü için 10 mM Hepes pH 7.4, kullanmak kültürlenmiştir halinde tamponlu karbonat olmalıdır. </li><li> Damakları yıkamak için, damak sekiz yıkar toplam uğramıştır kadar dikkatle, yıkar arasındaki plaka dokunarak, arka arkaya birbirini izleyen her kuyuya damakları taşımak için forseps kullanabilir. </li><li> Kuyularda taze, tam kültür ortamı (37 ° C) 250 uL içeren yeni bir steril 48-iyi plakasına damakları aktarın. </li><li> Çalışma süresi boyunca kültür için bir 37 ° C inkübatöre damakları ihtiva eden plakalar yerleştirin. </li><li> Aseptik taze 37 ° C kültür ortamı 100 mcL ile değiştirerek, Eppendorf tüpleri her 24 saat içine kültür kuyulardan orta 100 uL aktararak analiz için numune toplayın. </li><li> Pelet kalıntı ila 10 dakika, 4 ° C&#39;de, 380 x g&#39;de santrifüje kültür ortamı örnekleri. </li><li> Analiz etmek için hazır olana kadar -20 ° C&#39;de taze Eppendorf tüpleri ve mağaza santrifüje örnekten süpernatant aktarın. </li><li> Antijen spesifik IgG, IgM ve IgA, veya salgılanan sitokinler standart enzim bağlı immünosorbent testler (ELISA) ile doku kültürü Süpernatantları ölçülür. </li></ol> 2. NALT Cerrahi Ablasyon <ol><li> Dişi BALB / c farelerine, yaş, 7-9 haftalık, uygun bir konu bulunmaktadır, fakat diğer suşlar da kabul edilebilir. Ameliyat sonrası idare edilecektir yiyecek ve su yerine fare gelmesini üç gün önce ameliyat jel gibi ıslak gıda sağlayın. </li><li> Ameliyat öncesi ağız boşluğuna Metacam ağrı kesici (1.5 mg / ml ya da 0.05 mg / damla) ve bir damla idare. </li><li> Bir ketamin, Acepromazine, ve karışım Xylazine (KAX) ile, örneğin, uygun IACUC yol kullanılarak farelerin uyuşturmak ve kurumasını önlemek için göz üzerine Puralube Vet Merhem uygulanır. NALT etkileyebilecek uçucu anestezik maddeler kullanmaktan kaçının. Anesthesia ayak yumuşak bir kıstırma için refleks yanıtın yokluğunda tarafından teyit edilebilir. </li><li> Subkutan cerrahi sonra fare potansiyel dehidratasyonu önlemek için 22-28 gauge iğne ve şırınga kullanılarak kürek kemikleri arasında 1 ml serum fizyolojik (% 0.9 sodyum klorür enjeksiyonu USP) yönetin. Ayrıca ameliyat sırasında ve sonrasında sağlıklı solunum tanıtmak için 22-28 gauge iğne ve şırınga kullanılarak kürek kemikleri arasında subkütan Respiram 0,1 ml yönetmek. </li><li> Daha sonraki tüm manipülasyonlara sırasında fare termal destek sağlayın. </li><li> Bir yatar pozisyonda anestezi fare yerleştirin ve hafifçe damağın üst açığa ağzı açık gözetlemek alt ve üst dişlerin etrafında cerrahi dikiş iki ayrı döngüler kullanın. </li><li> NALT yerinde üst damağın orta hatta aşağı uzunluğunda bir kesi yaklaşık 3 mm yapmak için bir 11 No&#39;lu cerrahi bıçak kullanın. </li><li> Insizyon içine 0.5 mm microcurette yerleştirin ve hafifçe kenarından kazıyarakNALT bozabilir. </li><li> Bir termal koter ünitesi üzerinde bir düz ince döngü ile kanamayı durdurmak için kesi dağlamak. </li><li> Fare tam bilinç ve aktivite kurtarır ise termal destek devam edin. </li><li> 3 gün sonra ameliyat için günde bir kez gerekli ve ağızdan ağrı kesici ilaç gibi su kaybını önlemek için tuzlu subkutan kadar günde üç kez, kürek kemikleri arasında enjeksiyon başına 1 ml ile fare sağlayın. Derinin turgor kontrol etmek için bir cilt çadır testi tarafından dehidratasyon belirleyin. O kadar tente edilir, böylece kanatlar omuzları ile deri ve kürk kavrayabilir. Cilt hemen normal, önceki konumuna geri döner, fare susuz değildir. Cilt yüksek kalır ve yavaş hareket ederse, fare dehidratasyon bir devlet olduğunu ve tuzlu gerektirir. Kurtarma için yeterli zaman tanımak için ameliyattan sonra en az üç gün ıslak gıda sağlayın. </li><li> Herhangi bir deneysel işlemler öncesinde, kilo takip ederek 8-10 gün süreyle fareler gözlemlemek. Kötü ağırlığı kurtarmagenellikle tamamlanmamış damak iyileşme gösterir ve bu farelerin daha çalışmalardan kesilmelidir. </li></ol> 3. Histoloji için NALT hazırlanması ve NALT Cerrahi Başarı Değerlendirme <ol><li> Aşağıda tarif edildiği gibi NALT cerrahiye histolojik tarafından tespit olmalıdır. Tüm deneysel çalışmalar tamamlandıktan sonra, onaylanan IACUC rehberlik kullanarak euthanizing tarafından kranial koleksiyonları için fareler hazırlamak. NALT etkileyebilecek uçucu anestezik maddeler kullanmaktan kaçının. </li><li> Ötanazi farenin ense kavrayın. Her iki tarafta makas ile kondiler süreçlerle kırpma tarafından kafatası geri kalanından alt çene çıkarın. </li><li> Ense başlayarak, yavaş yavaş soyma ve kafatası ventral tarafına doğru keserek kafatası deri ve kürk çıkarın. </li><li> Dikkatle burun çevresindeki deri kaldırmak ve tamamen kaldırmak için burun ucunun kapalı cilt snip. </li><li> Omurlar zekâ gelen kafatası ayırınmakas ha kelepir. </li><li> Foramen magnum içine makas yerleştirin ve sabitleme sırasında yumuşak dokuların içine formalin nüfuz sağlamak için orta hat boyunca kafatası yarıya kadar kesti. </li><li> Nötr 10% in kafatası sabitlemek oda sıcaklığında 24 saat boyunca (NBF) tamponlu formalin. </li><li> Kirecini çıkarmak için, formik asit karışımı ile şişe içinde, kemik dokunmaktan Rexyn önlemek için gazlı bez sarılmış, örnek ve ayrı bir kaset yerleştirin. Oda sıcaklığında 12 saat boyunca inkübe, ardından yaklaşık 20 dakika boyunca su altında sürekli durulanır. </li><li> Bir jilet ile septum ve geçmişte göz yörünge için örnek kesin. </li><li> Örnek ve kaset% 10 NBF kısa süreli saklanabilir. </li><li> Gecede işleme için bir doku örneği işlemci üzerine yerleştirin. Bu parafine gömme hazırlıkları için numune su kaldırmak için yapılır. </li><li> Aşağı burun ile parafin blok gömmek işlenen doku, çıkarın ve soğumaya bırakın. </li><li> R TrimNALT yaklaşık konumunu yaklaşırken otomatik bir mikrotom ile bloğunun ough 15 mikron kesitleri, sonra 44.3 ° C su banyosunda cam slaytlar monte edilmek üzere 5 mikron bölümlerde kesme devam ediyor. </li><li> Hematoksilen ve eozin (H &amp; E) histoloji boyama NALT ablasyon değerlendirmek için kullanılmalıdır. </li></ol> 4. Fare ile Biyolojik örnekler Koleksiyonu 4.1 Serum <ol><li> Dikkatli bir ısı lambası ile vücut ısısı yükselen kan akışı artar. Bir cerrahi bıçak ile yanal kuyruk veni nicklemek kan toplayın. Kan Microtainer serum ayırıcı tüp içine serbestçe damla izin verin. </li><li> Kan akışını durdurmak için, gazlı bez veya havlu gibi emici bir malzeme ile nick hafifçe basınç uygulayın. </li><li> 30 dakika boyunca Microtainers içinde kan pıhtılaşmasına izin, ardından en az 90 saniye boyunca 6-15 x 1000 g arasında santrifüjlenir. </li><li> Için temiz bir Eppendorf tüpüne Microtainer serum ayrılmış aktarınDepolama -80 ° C&#39;de </li></ol> 4.2 Tükürük <ol><li> 20-30 uL steril fosfat pipetleme yanak ve diş eti çizgisi arasında (PBS) tamponlu ise dikey anestezi fare tutun. Yanak ve diş eti çizgisi arasında pipet yönlendirerek seyreltilmiş tükürük toplayın. </li><li> -20 ° C&#39;de 2x proteaz inhibitörü ve mağaza 10 uL içeren taze bir tüpe seyreltilmiş tükürük aktarın </li></ol> 4.3 Burun salgıları <ol><li> Onaylı IACUC rehberlik kullanarak, burun salgıları toplamaya önce fare Euthanize. NALT etkileyebilecek uçucu anestezik maddeler kullanmaktan kaçının. </li><li> Fare Holding dikey, özenle tek burun deliğine steril PBS 30 uL pipetleme ve diğer burun durulama toplamak. </li><li> -20 ° C&#39;de 2x proteaz inhibitörü ve mağaza 10 uL içeren taze bir tüp ile durulanmalıdır transfer </li></ol> 4.4 vajinal salgıları <ol><li> Th açıklığa mikropipet ucu eklemeBir ötenazi fare e vulva, steril PBS 50 uL ile vajina durulayın ve mikropipet bütün sıvı toplamak. </li><li> -20 ° C&#39;de 2x proteaz inhibitörü ve mağaza 10 uL içeren taze bir tüp ile durulanmalıdır transfer </li></ol> 5.. Toplanan örneklerde antijene spesifik antikorlar ya sitokinler ya da başka bir ELISA metodu kantitatif ile ölçülebilir. 6. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1 ex vivo analiz için NALT içeren doku ile ilgili işlem adım, genel bir şematik sağlar. Şekil 2 (A, B) &#39;de, damağın boyut olarak noktalı çizgi ile gösterildiği gibi, Ablasyon cerrahisi sırasında kesi konumu (A) yanı sıra, gösterilmiştir. NALT yerini paralel dokular gösteren, Şekil 2&#39;de, bir çıkarıldı hematoksilin lekeli damağın (C), üzerine premolar alanda oklarla gösterilmiştir. Şekil 3Üst NALT erişim için damağın (A, B), Ablasyon (C), ve kesi (D) nihai koterizasyon maruz gösteren, NALT bozulması cerrahi aşamaları göstermektedir. Doğrudan ameliyat sonrası microcurette tarafından NALT bozulması bir görüntü Şekil 3F görünür ederken ameliyat öncesi NALT çevreleyen nazal sinüs alanının Tipik H &amp; D kesiti, Şekil 3E &#39;de gösterilmiştir. Ameliyat sonrası iyileşme için yeterli zaman kalması insizyonlar kapatılmalı ve NALT (Şekil 3G) nazal kavite yoksun. Bu teknikler kullanılarak elde Tipik bir deney sonuçlarını stafilokok oian alt birim aşı (STEBVax) ile yapılan bir çalışmada doku kültür yüzer ve biyolojik örnekler karşılaştırılarak, Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. Farelerin burun içi (IN) veya intraperitonal (IP) yolları tarafından STEBVax uygulanmıştır. Aşı Toll benzeri reseptör 4 yolu 3,1 aktive bir adjuvan ile formüle edilmiştir<html> 4 ve kontrolleri sadece serum fizyolojik ya da aşının adjuvansız verildi. Deney gruplarında elde edilen ve kültürü NALT ELISA ile ölçülebilir olduğu ortama antijen spesifik immünglobulin salgılanır. Bu örnekte, (Şekil 4A), sonuç IgA büyük miktarlarda yardımcı maddesi ile birlikte, bir alt birim aşı ile aşılanmış fareler elde NALT tarafından yayımlanmıştır göstermektedir. Kontrol veya NALT free fare alınan biyolojik örnekler (serum, tükürük, burun salgıları, vajinal salgılar gibi) doku kültürü sonuçları ile karşılaştırma için burun antijenlere karşı in vivo immün yanıt profil kullanılabilir. Aşılama IN Şekil 4B olarak, IgA ve IgG yanıtları önemli ölçüde fonksiyonel NALT olmadan azalmıştır. Antijene özel IgA seviyeleri aşılanmış farelerin mukozal salgılar IgG (tükürük, burun yıkamalarından) &#39;den, genellikle daha yüksek olmuştur. upload/3960/3960fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. NALT toplama ve ex vivo kültür şematik. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig2.jpg" /> Şekil 2. NALT ve cerrahi kesi konumunu gösteren fare damak görselleştirilmesi. Boyut ve noktalı çizgi (A) ile gösterilir cerrahi kesi ile üst damak konumu, üst damak eksize (B) veya damak premolar bölgede (damağın ön tarafında lekeli koyu mor paralel NALT görüntülemek için hematoksilen (C) boyandı ). NALT oklarla gösterilen. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig3.jpg" /> Şekil 3. Cerrahi NALT bozulması. NALT bozulması cerrahi Anahtar aşamaları: ameliyattan önce farenin üst damak yatar görünümü (A); NALT (B) erişmek için üst damakta yapılan ensizyon; yılında NALT yapısını bozacak ensizyon yoluyla eklenmiş microcurette probtegrity (C), cerrahi (D) sonuca kesi koterizasyon. Cerrahi (E) önce burun boşlukları, H &amp; E boyalı, mikroskobik görüntüler; hemen cerrahi (F) sonra; ve bir başarıyla iyileşti, NALT-ücretsiz fare (G). <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig4.jpg" /> Şekil 4. Kültürlü NALT, tükürük ve aşılanmış farelerin toplanan burun salgılarından Aşı özgü antikorların. NALT-ücretsiz ya da normal kontrol fareleri IN veya STEBVax IP aşılandı ve biyolojik örnekleri alındı. Üç nüsha numune antikor düzeyleri ELISA yöntemi ile ölçüldü. (A) NALT kontrol fareleri (cerrahi manipüle değil) kaldırılır ve antikor yanıtları incelemek için kültüre edildi. Aşılanmış farelerde IN için kültür aşısı özgül IgA yanıtı (Student t-testi, p ≤ 0.01, hiç adjuvan ya da hiç aşı ile karşılaştırıldığında) kontrol grubundan istatistiksel olarak farklı değildi. (B) NALT kesinti belirli bir ölçüde azaltılmış antikor tepkisiaşı IN. Spesifik antikor düzeyleri arasında anlamlı bir fark yoktu NALT ve NALT tükürük IgG sonuçları (Student t-testi, p ≤ 0.05) hariç tüm karşılaştırmalar için + grup (hiçbir cerrahi ya da kontrol cerrahisi).

<ol>
	<li>Wiley, J. A., Tighe, M. P., Harmsen, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upper+respiratory+tract+resistance+to+influenza+infection+is+not+prevented+by+the+absence+of+either+nasal-associated+lymphoid+tissue+or+cervical+lymph+nodes.">Upper respiratory tract resistance to influenza infection is not prevented by the absence of either nasal-associated lymphoid tissue or cervical lymph nodes.</a> J. Immunol. 175, 3186-3196 (2005).</li><li>W, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+immunisation+with+conjugate+vaccine+protects+mice+from+systemic+and+respiratory+tract+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa.">Intranasal immunisation with conjugate vaccine protects mice from systemic and respiratory tract infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Vaccine. 24, 4333-4342 (2006).</li><li>Fernandez, S., Cisney, E. D., Hall, S. I., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+immunity+to+staphylococcal+toxic+shock+is+controlled+by+the+nasopharynx-associated+lymphoid+tissue.">Nasal immunity to staphylococcal toxic shock is controlled by the nasopharynx-associated lymphoid tissue.</a> Clin. Vaccine Immunol. 18, 667-675 (2011).</li><li>Asanuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+nasal-associated+lymphoid+tissue.">Isolation and characterization of mouse nasal-associated lymphoid tissue.</a> J. Immunol. Methods. 202, 123-131 (1997).</li><li>Casteleyn, C., Broos, A. M., Simoens, P., Van den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALT+(nasal+cavity-associated+lymphoid+tissue)+in+the+rabbit.">NALT (nasal cavity-associated lymphoid tissue) in the rabbit.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 133, 212-218 (2010).</li><li>Debertin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal-associated+lymphoid+tissue+(NALT):+frequency+and+localization+in+young+children.">Nasal-associated lymphoid tissue (NALT): frequency and localization in young children.</a> Clin. Exp. Immunol. 134, 503-507 (2003).</li><li>Csencsits, K. L., Jutila, M. A., Pascual, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal-associated+lymphoid+tissue:+phenotypic+and+functional+evidence+for+the+primary+role+of+peripheral+node+addressin+in+naïve+lymphocyte+adhesion+to+high+endothelial+venules+in+a+mucosal+site.">Nasal-associated lymphoid tissue: phenotypic and functional evidence for the primary role of peripheral node addressin in naïve lymphocyte adhesion to high endothelial venules in a mucosal site.</a> J. Immunol. 163, 1382-1389 (1999).</li><li>Zuercher, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal-associated+lymphoid+tissue+is+a+mucosal+inductive+site+for+virus-specific+humoral+and+cellular+immune+responses.">Nasal-associated lymphoid tissue is a mucosal inductive site for virus-specific humoral and cellular immune responses.</a> J. Immunol. 168, 1796-1803 (2002).</li><li>Park, H. S., Francis, K. P., Yu, J., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranous+cells+in+nasal-associated+lymphoid+tissue:+a+portal+of+entry+for+the+respiratory+mucosal+pathogen+group+A+streptococcus.">Membranous cells in nasal-associated lymphoid tissue: a portal of entry for the respiratory mucosal pathogen group A streptococcus.</a> J. Immunol. 171, 2532-2537 (2003).</li><li>Tyrer, P., Foxwell, A. R., Cripps, A. W., Apicella, M. A., Kyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pattern+recognition+receptors+mediate+M-cell+uptake+of+a+gram-negative+bacterium.">Microbial pattern recognition receptors mediate M-cell uptake of a gram-negative bacterium.</a> Infect. Immun. 74, 625-631 (2006).</li><li>Wu, A. W., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+lymphoid+tissue,+intranasal+immunization,+and+compartmentalization+of+the+common+mucosal+immune+system.">Nasal lymphoid tissue, intranasal immunization, and compartmentalization of the common mucosal immune system.</a> Immunol. Res. 16, 187-201 (1997).</li><li>Harmsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+organogenesis+of+nasal-associated+lymphoid+tissue+(NALT)+occurs+independently+of+lymphotoxin-alpha+(LT+alpha)+and+retinoic+acid+receptor-related+orphan+receptor-gamma,+but+the+organization+of+NALT+is+LT+alpha+dependent.">Cutting edge: organogenesis of nasal-associated lymphoid tissue (NALT) occurs independently of lymphotoxin-alpha (LT alpha) and retinoic acid receptor-related orphan receptor-gamma, but the organization of NALT is LT alpha dependent.</a> J. Immunol. 168, 986-990 (2002).</li><li>Rangel-Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CXC+chemokine+ligand+13,+CC+chemokine+ligand+(CCL)+19,+and+CCL21+in+the+organization+and+function+of+nasal-associated+lymphoid+tissue.">Role of CXC chemokine ligand 13, CC chemokine ligand (CCL) 19, and CCL21 in the organization and function of nasal-associated lymphoid tissue.</a> J. Immunol. 175, 4904-4913 (2005).</li><li>Morefield, G. L., Hawkins, L. D., Ishizaka, S. T., Kissner, T. L., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Toll-like+receptor+4+agonist+enhances+vaccine+efficacy+in+an+experimental+model+of+toxic+shock+syndrome.">Synthetic Toll-like receptor 4 agonist enhances vaccine efficacy in an experimental model of toxic shock syndrome.</a> Clin. Vaccine Immunol. 14, 1499-1504 (2007).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz biyolojik örnekler ve NALT ilişkili immün yanıtlar 1-4 incelenmesi için testler elde, bir hayvan modeli geliştirmek için ortak yöntemler sundu. Bu yöntemlerin uygulanması sırasında dikkate almanız gereken ek faktörler vardır. Cerrahi ve doku kültürü için standart steril teknikler takip edilmelidir. Izolasyon ve kültür gibi sterilize aletler, çalışma alanı ve dezenfekte damak bakımı sırasında kullanılan antibakteriyel ve antifungal bir kombinasyonu bulaşma riskini azaltacaktır. Serum antikorları genellikle yüksek konsantrasyonlarda bulunur gibi tükürük, burun yıkama ve benzeri mukozal sekresyon örnekleri, kan potansiyel kontaminasyon açısından kontrol edilmelidir. Antikorların daha düşük konsantrasyonlarda serumu ile karşılaştırıldığında, bu örnekler mevcut olduğundan daha fazla, mukozal salgılar sadece hafifçe analizi için seyreltilmiştir edilmelidir. Fareler öncesi doğrudan ameliyattan sonra sıcak tutulmalıdırpotansiyel anestezi bağlı hipotermi için önlem alınmalıdır. Onların yüzüne Alternatif dinlenme fareler ameliyat sonrası iyileşme sırasında düzensiz solunum aza indirmek için. Cerrahi işlem bu görevleri tamamlamak için birlikte çalışan üç kişinin daha verimlidir: fareler anestezi kurtarmak olarak cerrahi tedavi bir, ağız açık tutarak yardımcı olmak için, diğeri de ameliyat sonrası bakım sağlamak. Her fare için ameliyatın başarı doğrulamak için tüm deneysel prosedürleri veya çalışmaların sonunda kraniyal kesitler H &amp; E boyama kullanmak gereklidir. Olası cerrahi sonuçlar şunlardır: eksiksiz ve ikili NALT ablasyon, eksik ablasyon, veya bozulmamış NALT. Tüm cerrahi kalıntı veya bozulmamış NALT ile tam NALT kaybı, hayvanlar neden olur, çünkü iç kontroller olarak kullanılabilir. Başka bir olası sonuç damak burun ve ağız boşlukları bağlayan bir açıklık bırakarak, tamamen iyileşmek için başarısız olur. Eksikdamak iyileşme, düşük ağırlığı ve gelişme geriliği neden olacaktır ve bu kişilerin çalışma çıkarılmalıdır. Fare modeli ile ilk aşı yanıtı incelenmesi amaçlanan çalışma sonucu (antikor yanıtı, hayatta kalma, vb) NALT için bir rol kurmak için görev yapacak. Cerrahi NALT kaldırarak yerel ve sistemik bağışıklık burun katkıların belirlenmesi kolaylaştırır. Burada anlatılan cerrahi yaklaşım NALT yoksun bir fare modeli elde etmek için en doğrudan bir yöntemdir. Knock-out fare modelleri seçin eksikliği NALT bildirilmiş, ancak bu hayvanlar da sitokinler veya diğer ikincil lenfoid dokuların gelişimi için gereklidir kemokinler eksik olduğunu ve ek kusurları 12,13 barındıran olabilir edilmiştir. Ayrıca, burada açıklanan yöntemlerden burun pasajda içinde kaynaklanan bağışıklık yanıtlarını çeşitli yönlerini incelemek için geliştirilmiştir. Bizim deney sonuçları tüm üst palat kullanarak çalışmalarına dayanmaktadırdoku kültürü için fare e, bu bölümlerde kullanılan olasıdır ancak. Son olarak, kültür NALT doku kültürü modeli olarak tamamen deneyler için yararlıdır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Paslanmaz Çelik Steril Cerrahi Bıçaklar, No: 11 sayılı </td><td> Miltex </td><td> 4-311 </td><td></td></tr><tr><td> Bıçak Kolu, No: 3 </td><td> Miltex </td><td> 4-7 </td><td></td></tr><tr><td> 48-İyi Hücre Kültür Tabaklar </td><td> Costar </td><td> 3548 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum, İnaktive Isı </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> Final Conc: kültür ortamına hacimce% 10 </td></tr><tr><td> Streptomisin Sülfat </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td> Nihai Conc: 100 ug / ml </td></tr><tr><td> Penisilin </td><td> Sigma </td><td> P7794 </td><td> Final Conc: 100 UI / mL </td></tr><tr><td> Gentamisin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397-10ML </td><td> Final Conc: 50 mcg / mL </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td> Final Conc: 1 mcg / mL </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0887 </td><td> Nihai Conc: 10 mM </td></tr><tr><td> Eppendorf Mikrosantrifüj Tüpler </td><td> Eppendorf </td><td> 022364111 </td><td></td></tr><tr><td> Nutra-jel Kiraz Aromalı Fare Islak Gıda </td><td> Bio-Serve </td><td> S4798-TEPSİ </td><td></td></tr><tr><td> Metacam </td><td> Boehringer Ingelheim </td><td> 601531000 </td><td> 1.5 mg / mL Oral Süspansiyon bir damla </td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Pfizer </td><td> 00856440301 </td><td> Final Conc: 6.06 mg / ml </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Vedco </td><td> VEDC207 </td><td> Final Conc: 0.061 mg / ml </td></tr><tr><td> Ksilazin </td><td> Lloyd </td><td> 4811 </td><td> Final Conc: 0.667 mg / ml </td></tr><tr><td> Puralube Vet Merhem </td><td> Pharmaderm Hayvan Sağlığı </td><td> 1621 </td><td></td></tr><tr><td> % 0,9 Sodyum Klorür USP </td><td> Baxter </td><td> 2B1302 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 mm Microcurette </td><td> Roboz </td><td> RS-6350 </td><td></td></tr><tr><td> Termal Koter Ünitesi </td><td> Geiger </td><td> 150-S/150A-S </td><td></td></tr><tr><td> TCU Değiştirme İpucu, Düz Güzel Döngü </td><td> Geiger </td><td> 214 </td><td></td></tr><tr><td> Cerrahi Makas </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nötr% 10 Formalin Tamponlu </td><td> Sigma </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Formik asit </td><td> Balıkçı </td><td> A119P-4 </td><td> 1047 ml musluk suyu içine 426 ml formik asit karıştırın, daha sonra 45 ml Rexyn 101 (H) eklemek </td></tr><tr><td> Rexyn 101 (H) </td><td> Balıkçı </td><td> R231-500 </td><td></td></tr><tr><td> Doku-Tek VIP E150/E300 </td><td> Sakura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Döner Mikrotom </td><td> Leica </td><td> RM2255 </td><td></td></tr><tr><td> Mayer&#39;in Hematoksilen </td><td> Sigma </td><td> MHS16-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Gill No.1 Hematoksilen </td><td> Sigma </td><td> GHS116 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin B </td><td> Sigma </td><td> 2853 </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer Serum Ayırıcı </td><td> BD Medical </td><td> 365956 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfat Tamponlu Salin </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaH 2 PO 4, 140 mM NaCl, pH 7.4 </td></tr><tr><td> Proteaz İnhibitör Kokteyl, EDTA-free </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78415 </td><td></td></tr></tbody></table>

examining the role of nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (nalt) in mouse responses to vaccines

İnsanlarda, kemirgenlerden ve diğer memelilerde bulunan nazofarenks ilişkili lenforetiküler dokular (NALT), 1-3 nazal sinüslerde bağışıklık katkıda bulunur. NALT sert damak yukarıda burun pasajda bulunan iki paralel çan şeklindeki yapılardır ve genellikle mukoza ilişkili lenfoid sistemin 4-6 ikincil bileşenleri olarak kabul edilir. Dendritik hücreler 4,7,8 antijen sunan serpiştirilmiş B ve T lenfositlerinin ayrık bölümlerdir NALT içinde yer alır. Bu hücreler hava yollarını 9,10 mukoza yüzeylerinden antijen alımı için sorumlu M-hücreleri ile ardalanmalı bir epitel hücre tabakası ile çevrilidir. NALT dolaşan Naif lenfositler solunum patojenleri 7 ile ilk karşılaştığında yanıt gurur duyuyoruz. NALT iki yaş insanlarda yok olurken, Waldeyer Yüzükler ve benzer yapıdaki lenfatik organlarda th devam devamömrü 6 roughout. İnsanlarda aksine, farelerin dolayısıyla nazal sinüslerde 11 içinde kaynaklanan immün yanıtların çalışma için uygun bir hayvan modeli sunan, hayatı boyunca NALT korurlar. NALT tek hücre süspansiyonları kültürleri nedeniyle mononükleer hücrelerden, düşük verimler için pratik değildir. Bununla birlikte, NALT biyolojisi bozulmadan organın ex vivo kültürlenmesi ile incelendi ve bu yöntem, doğal doku yapısı sürdürmenin ilave bir avantajı vardır edilebilir. In vivo çalışmalar için NALT sınırlı kusurları başvuran genetik nakavt modelleri gelişim süreçleri zayıf bir anlayış nedeniyle henüz mevcut değildir. Lenfotoksin-α nakavt fareler NALT körelmiş olurken Örneğin, Peyer en yamalar, periferik lenf düğümleri, foliküler dendritik hücreler ve diğer lenfoid dokularda da bu genetik olarak manipüle farelerde 12,13 ile değiştiği saptanmıştır. Gen knockout farelerde alternatif, cerrahi ablasyon p olarakermanently diğer dokulara etkilemeden nazal pasajdan NALT ortadan kaldırır. Çıkan fare modeli aşılar 1,3 NALT ve immün yanıtı arasındaki ilişkileri kurmak için kullanılmıştır. Serum, tükürük, burun yıkama ve vajinal salgıların Seri toplama NALT doğrudan kaynaklanan bağışıklık yanıtlarını doku kültürü ile teyit edilebilir ise, aşı konakçı tepkileri temelinde kurulması için gereklidir. Aşağıdaki yordamlar gerekli ameliyatları, doku kültürü ve örnek toplama intranazal (IN) aşılama için yerel ve sistemik hümoral yanıtlarda incelemek için özetledik.

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines at JoVE.com

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Intranazal aşılara farelerin burun ve sistemik immün yanıtlar için nazofaringeal ilişkili lenforetiküler dokular (NALT) katkılarını incelemek için Yöntemler açıklanmıştır. Biz NALT bağımlı fare modeli kurmak için bir cerrahi prosedür göstermek ve<em&gt; Ex vivo</emAyıklanan NALT of&gt; kültürleri.

Aşılar Fare yanıtlar içinde Nazofaringeal ilişkili lenforetiküler Doku (NALT) Rolü incelenmesi

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

examining-role-nasopharyngeal-associated-lymphoreticular-tissue-nalt

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

25.4K Görüntüleme.  U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. Intranazal aşılara farelerin burun ve sistemik immün yanıtlar için nazofaringeal ilişkili lenforetiküler dokular (NALT) katkılarını incelemek için Yöntemler açıklanmıştır. Biz NALT bağımlı fare modeli kurmak için bir cerrahi prosedür göstermek ve Ex vivo kültürleri.

Video: Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Ile Enfekte Fare Bakteriyel Yük ve Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV Co-enfeksiyon Bağlamında Sıtma için Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Modeli

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

Rolü seğirmesi Motilitesi görselleştirme ve Karakterizasyonu<em&gt; PilG</em&gt; &#39;de<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Bir IL-8 Geçici Transgenize Edilmiş Fare Modeli<emIn vivo</em&gt; İnflamatuvar Yanıtların Uzun Vadeli İzlenmesi

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması<em&gt; Cis</em&gt; -prenıltransferaz in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected antigen or a combination of antigens into a plasmid, which enables a tailor-made and safe design. The administration of DNA vaccines into host cells leads to the expression of antigens that stimulate both humoral and cell-mediated immune responses. This report describes a protocol for the cloning of antigen sequences into the pCMV-EGFP plasmid, the immunization of adult zebrafish with the vaccine candidates by intramuscular microinjection, and the subsequent electroporation to improve intake. The vaccine antigens are expressed as green fluorescent protein (GFP)-fusion proteins, which allows the confirmation of the antigen expression under UV light from live fish and the quantification of expression levels of the fusion protein with ELISA, as well as their detection with a western blot analysis. The protective effect of the vaccine candidates is tested by infecting the fish with Mycobacterium marinum five weeks postvaccination, followed by the quantification of the bacteria with qPCR four weeks later. Compared to mammalian preclinical screening models, this method provides a cost-effective method for the preliminary screening of novel DNA-based vaccine candidates against a mycobacterial infection. The method can be further applied to screening DNA-based vaccines against various bacterial and viral diseases.

Here we describe a protocol for the immunization of the adult zebrafish (Danio rerio) with a DNA-based vaccine and demonstrate the validation of a successful vaccination event. This method is suitable for the preclinical screening of vaccine candidates in various infection models.

Yetişkin zebra balığı bağışıklama DNA tabanlı aşıların preklinik tarama için

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...