Il sostegno è stato fornito da Becton Dickinson Technologies. Le opinioni espresse in questa presentazione sono quelle degli autori e non pretende di riflettere la politica ufficiale del governo degli Stati Uniti. La ricerca è stata condotta nel rispetto della legge sulla protezione degli animali e di altre leggi federali e regolamenti in materia di animali ed esperimenti che coinvolgono animali e aderisce ai principi stabiliti nella Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio, National Research Council, 1996. L&#39;impianto in cui è stata condotta questa ricerca è pienamente accreditata dall&#39;Associazione per la valutazione e accreditamento dei Laboratory Animal Care International.

1. Raccolta NALT e Culturing <ol><li> Euthanize topo, utilizzando approvato guida IACUC. Evitare l&#39;uso di anestetici inalatori che possono influenzare NALT. Trasferimento topi ad un asettico spazio di lavoro o di biosicurezza cabinet. Rimuovere la mascella inferiore del mouse e pulire la zona superiore palato con batuffoli imbevuti d&#39;alcol e iodio. </li><li> Utilizzare una lama chirurgica No. 11 nel manico del coltello per tagliare con cura chirurgica e delle accise il palato superiore, seguendo il contorno interno degli incisivi del mouse e dei denti molari. </li><li> Staccare delicatamente il palato con le pinze, facendo attenzione a non strappare il palato. </li><li> Questo passaggio è necessario per ridurre la contaminazione di culture ed è progettato per l&#39;elaborazione palati più. Inserire palati in pozzetti individuali nella prima colonna di una sterile 48-pozzetti pre-riempito con 250 pl di mezzo di coltura completo (37 ° C) costituito da RPMI 1640 integrato con 10% siero fetale bovino, 100 pg / ml streptomicina, 100 UI / ml penicillina, 50 ug / ml di gentamicinae 1 pg / ml fungizone / amfotericina. I media dovrebbero essere tamponata con carbonato di palati se vengono coltivate in una CO 5% 2/95% di aria umida incubatore (37 ° C), o in alternativa utilizzare HEPES 10 mM pH 7,4, per i non-CO 2 cultura. </li><li> Per lavare i palati, usare una pinza per spostare palati in ogni pozzetto successivo in una fila, con attenzione toccando la piastra tra un lavaggio e, fino a quando il palato ha subito un totale di otto lavaggi. </li><li> Trasferire il palato in una nuova sterile 48-pozzetti contenente 250 pl di fresco, mezzo di coltura completo (37 ° C) in pozzetti. </li><li> Collocare le piastre contenenti le palati in un incubatore a 37 ° C per coltura per tutta la durata dello studio. </li><li> Raccogliere campioni per analisi asetticamente trasferendo 100 pl di mezzo da pozzetti di coltura in provette Eppendorf ogni 24 ore, sostituendo con 100 pl di 37 ° coltura fresco C terreno. </li><li> Centrifugare i campioni coltura mezzi a 380 xg per 10 minuti, 4 ° C, a detriti pellet. </li><li> Trasferire il supernatante dal campione centrifugato a nuove provette Eppendorf e conservare a -20 ° C fino al momento analizzare. </li><li> Antigene-specifica IgG, IgM e IgA, o citochine secrete sono misurate in tessuto-coltura surnatanti mediante le normali metodica immunoenzimatica (ELISA). </li></ol> 2. Ablazione chirurgica delle NALT <ol><li> Femmina BALB / c topi, da 7 a 9 settimane di età, sono soggetti idonei, ma altri ceppi sono anche accettabili. Fornire gel-like cibo umido tre giorni prima della chirurgia per acclimatarsi sostituto del mouse per cibo e acqua, che sarà gestito post-operatorio. </li><li> Somministrare una goccia di sollievo dal dolore Metacam farmaco (1,5 mg / ml o 0,05 mg / drop) nella cavità orale prima dell&#39;intervento. </li><li> Anestetizzare topi usando approvato guida IACUC, per esempio, con ketamina, acepromazina, e miscela xilazina (KAX) e applicare una pomata Puralube Vet su occhi per prevenire l&#39;essiccazione. Evitare l&#39;uso di anestetici inalatori che possono influenzare NALT. Anesthesia può essere confermata l&#39;assenza di risposta riflessa ad un pizzicotto dolce delle dita dei piedi. </li><li> Somministrare 1 ml di soluzione fisiologica (0,9% di cloruro di sodio USP di iniezione) per via sottocutanea tra le scapole utilizzando un 22-28 gauge e la siringa per prevenire la disidratazione potenzialità del mouse dopo l&#39;intervento. Anche amministrare 0,1 mL di Respiram per via sottocutanea tra le scapole utilizzando un 22-28 gauge e la siringa per promuovere la respirazione sana durante e dopo l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Fornire supporto termico al mouse durante tutte le manipolazioni successive. </li><li> Posizionate il mouse anestetizzato in posizione supina, e utilizzare due anelli separati di sutura chirurgica circa gli incisivi superiori e inferiori a sollevare delicatamente aperto la bocca, esponendo il palato superiore. </li><li> Utilizzare un No. 11 lama chirurgica praticare un&#39;incisione di circa 3 mm di lunghezza lungo la linea mediana del palato superiore nel sito del NALT. </li><li> Inserire un microcurette 0,5 mm nel incisione e raschiare delicatamente sotto i bordi perinterrompere la NALT. </li><li> Cauterizzare l&#39;incisione per arrestare l&#39;emorragia con un ciclo dritto bene su un gruppo termico cauterio. </li><li> Continua supporto termico, mentre recupera il mouse verso la piena consapevolezza e l&#39;attività. </li><li> Fornire il mouse con soluzione salina per via sottocutanea fino a tre volte al giorno, 1 ml per iniezione tra le scapole, per prevenire la disidratazione, come farmaci per il dolore necessario, e per via orale una volta al giorno per 3 giorni post intervento chirurgico. Determinare la disidratazione eseguendo un test tenda di pelle per verificare turgore della pelle. Afferrare pelle e del pelo tra le lame spalle in modo che sia tented alto. Se la pelle ritorna rapidamente al normale, posizione precedente, il mouse non è disidratato. Se la pelle rimane elevata e si muove lentamente, il topo è in uno stato di disidratazione e richiede salina. Fornire cibo umido per almeno tre giorni dopo un intervento chirurgico per un tempo sufficiente per il recupero. </li><li> Prima di tutte le procedure sperimentali, osservare i topi per 8-10 giorni, monitorando l&#39;aumento di peso. Peso scarso recuperodi solito indica la guarigione incompleta palato, e questi topi dovrebbero essere ritirati dal ulteriori studi. </li></ol> 3. Preparazione NALT per l&#39;istologia e valutare il successo di Chirurgia NALT <ol><li> Il successo della chirurgia NALT deve essere accertata da istologia come descritto di seguito. Dopo aver completato tutti gli studi sperimentali, preparare i topi per le collezioni cranici da eutanasia utilizzando approvato guida IACUC. Evitare l&#39;uso di anestetici inalatori che possono influenzare NALT. </li><li> Afferrare la nuca del mouse eutanasia. Rimuovere la mandibola inferiore dal resto del cranio tagliandoli attraverso i processi condilari con forbici su entrambi i lati. </li><li> A partire dalla nuca, togliere la pelle e la pelliccia dal cranio lentamente pelatura e taglio verso il lato ventrale del cranio. </li><li> Rimuovere con cura la pelle intorno alla zona nasale e tagliare la pelle al largo della punta del muso per rimuovere completamente. </li><li> Staccare il cranio dalla wit vertebresnip ha delle forbici. </li><li> Inserire le forbici nel forame magno e tagliare a metà il cranio lungo la linea mediana per consentire la permeazione di formalina nei tessuti molli durante la fissazione. </li><li> Fissare cranio in 10% formalina tamponata neutra (NBF) per 24 ore a temperatura ambiente. </li><li> Per decalcificazione, posizionare il campione e la cassetta separata, avvolto in una garza per impedire Rexyn di toccare l&#39;osso, in bottiglia con la miscela di acido formico. Incubare per 12 ore a temperatura ambiente, poi lavare continuamente sotto acqua di rubinetto per circa 20 minuti. </li><li> Tagliare il campione al setto nasale e passate orbite l&#39;occhio con una lama di rasoio. </li><li> Campione e cassette possono essere conservati a breve termine nel 10% NBF. </li><li> Porre campione su un processore tessuto per l&#39;elaborazione notte. Questo viene fatto per rimuovere l&#39;acqua dal campione in preparazione per paraffina. </li><li> Rimuovere il tessuto trasformati, incorporare in un blocco di paraffina con il muso verso il basso, e lasciarlo raffreddare. </li><li> Trim rough 15 um sezioni trasversali del blocco con un microtomo automatizzato, avvicinando la posizione approssimativa del NALT, poi continuare il taglio in sezioni 5 micron per il montaggio su vetrini in un bagno di acqua 44,3 ° C. </li><li> Ematossilina ed eosina (H &amp; E) colorazione istologia dovrebbero essere utilizzati per valutare l&#39;ablazione NALT. </li></ol> 4. Raccolta di campioni biologici provenienti da topi 4,1 Siero <ol><li> Con attenzione elevando la temperatura corporea con una lampada di calore aumenta il flusso sanguigno. Prelevare il sangue per intaccare la vena laterale della coda con una lama chirurgica. Lasciare che il sangue gocciolare liberamente in un tubo separatore di siero Microtainer. </li><li> Applicare una leggera pressione al nick con materiale assorbente, come la garza o un asciugamano, per fermare il flusso di sangue. </li><li> Lasciare che il sangue coaguli nelle Microtainers per 30 minuti, quindi centrifugare tra 6-15 x 1000 g per almeno 90 secondi. </li><li> Commutazione separato dal siero Microtainer in una provetta pulita per Eppendorfconservazione a -80 ° C. </li></ol> 4,2 Saliva <ol><li> Tenete il mouse anestetizzato verticale durante il pipettaggio 20-30 fosfato ul sterile soluzione salina tamponata (PBS) tra la guancia e la gengiva. Raccogliere la saliva diluita dirigendo punta della pipetta tra la guancia e la gengiva. </li><li> Trasferire la saliva diluito in una nuova provetta contenente 10 L di inibitori della proteasi 2x e conservare a -20 ° C. </li></ol> 4.3 secrezioni nasali <ol><li> Eutanasia del mouse prima di raccogliere le secrezioni nasali, utilizzando approvato guida IACUC. Evitare l&#39;uso di anestetici inalatori che possono influenzare NALT. </li><li> Tenendo il mouse verticalmente, con attenzione pipettare 30 microlitri di PBS sterile in una narice e raccogliere risciacquo da altra narice. </li><li> Trasferimento risciacquo in una nuova provetta contenente 10 pl di inibitori della proteasi 2x e conservare a -20 ° C. </li></ol> 4.4 secrezioni vaginali <ol><li> Inserire la punta di una micropipetta nell&#39;apertura di thvulva e del mouse eutanasia, lavare la vagina con 50 microlitri di PBS sterile e raccogliere tutto il liquido dalla micropipetta. </li><li> Trasferimento risciacquo in una nuova provetta contenente 10 pl di inibitori della proteasi 2x e conservare a -20 ° C. </li></ol> 5. Anticorpi antigene-specifici o citochine nei campioni raccolti possono essere misurate mediante ELISA o un altro metodo quantitativo. 6. Risultati rappresentativi La Figura 1 fornisce una vista schematica generale di fasi coinvolte con l&#39;elaborazione del NALT contenente tessuto per l&#39;analisi ex vivo. In Figura 2 (A, B), la dimensione del palato è mostrato, così come la posizione del incisione ablazione durante l&#39;intervento chirurgico (A), come indicato dalla linea tratteggiata. La posizione di NALT sono indicati da frecce nella zona premolare su un asportato ematossilina-tinto palato in Figura 2 (C), mostra i tessuti paralleli. Figura 3presenta passaggi della chirurgia interruzione NALT, mostrando l&#39;esposizione del palato superiore per l&#39;accesso a NALT (A, B), ablazione (C), e la cauterizzazione finale della incisione (D). Un tipico EE sezione trasversale della zona del seno nasale circostante il NALT prima dell&#39;intervento chirurgico è mostrato in Figura 3E, mentre un&#39;immagine di perturbazione NALT dal microcurette direttamente dopo l&#39;intervento appare in figura 3F. Un tempo sufficiente per il recupero da un intervento chirurgico, le incisioni devono essere chiusi e la cavità nasale privo di NALT (Figura 3G). Tipici risultati sperimentali ottenuti con queste tecniche sono mostrati nella Figura 4, confrontando supernatanti di coltura dei tessuti e campioni biologici da uno studio di un vaccino a subunità stafilococco (STEBVax). I topi sono stati somministrati STEBVax da intranasale (IN) o intraperitoneale (IP) rotte. Il vaccino è stato formulato con un adiuvante che attiva il recettore Toll-like 4 percorso di 3,1<html> 4, e controlli sono stati dati solo soluzione salina o vaccino senza adiuvante. NALT Cultured ottenuti da gruppi sperimentali secreto antigene-specifiche immunoglobuline in mezzo che era misurabile con il metodo ELISA. In questo esempio (Figura 4A), i risultati indicano che le grandi quantità di IgA sono stati rilasciati dal NALT ottenuti da topi vaccinati con un vaccino a subunità combinato con adiuvante. I campioni biologici (come siero, saliva, secrezioni nasali, secrezioni vaginali) acquisiti dal controllo o NALT-topi senza può essere utilizzato per analizzare la risposta in vivo immunitaria agli antigeni nasali per confronto con i risultati delle colture tissutali. In figura 4b, IgA e IgG risposte nella vaccinazione erano significativamente ridotta senza NALT funzionale. I livelli di antigene-specifica IgA erano generalmente superiori IgG nelle secrezioni mucose (saliva, lavaggi nasali) dei topi vaccinati. upload/3960/3960fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Schema di raccolta NALT e la coltura ex vivo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig2.jpg" /> Figura 2. Visualizzazione del palato topo che indica la posizione di incisione NALT e chirurgia. Dimensioni e posizione del palato superiore con incisione chirurgica indicata con linea tratteggiata (A); palato superiore escluso (B) o colorate in ematossilina (C) per visualizzare il NALT parallelo nella zona premolare del palato (tinto viola scuro sul lato anteriore del palato ). NALT indicato dalle frecce. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig3.jpg" /> Figura 3. NALT interruzione chirurgica. Le fasi principali della chirurgia interruzione NALT: vista supina del palato superiore del mouse prima dell&#39;intervento chirurgico (A); incisione sulla linea mediana fatta palato superiore per accedere al NALT (B); microcurette sonda inserita attraverso un&#39;incisione mediana per interrompere struttura in NALTgrità (C); cauterizzazione di incisione a conclusione dell&#39;intervento (D). Immagini al microscopio delle cavità nasali, colorati H &amp; E, prima della chirurgia (E), subito dopo l&#39;intervento chirurgico (F), e un successo guarito, NALT-free di topo (G). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig4.jpg" /> Figura 4. Vaccino anticorpi specifici da NALT colta, saliva e secrezioni nasali raccolti dai topi vaccinati. Topi di controllo NALT-free o normale sono stati vaccinati o IP con STEBVax e campioni biologici sono stati raccolti. I livelli anticorpali dei campioni in triplicato sono stati misurati usando ELISA. (A) NALT sono stati rimossi dai topi di controllo (non chirurgicamente manipolata) e messe in coltura per esaminare la risposta anticorpale. Il vaccino-specifica risposta di IgA in coltura per IN topi vaccinati era statisticamente differente da controlli (Student t-test, p ≤ 0,01, rispetto al non adiuvante o no vaccino). (B) interruzione NALT sostanzialmente ridotto risposte anticorpali specifichea IN vaccinazione. Ci sono state differenze significative tra i livelli di anticorpi specifici di NALT-and NALT + gruppi (non intervento chirurgico o di controllo) per tutti i confronti, tranne saliva risultati IgG (Student t-test, p ≤ 0,05).

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Abbiamo presentato metodi collettivi per lo sviluppo di un modello animale, per ottenere campioni biologici e saggi per l&#39;esame delle risposte immunitarie NALT-associate 1-4. Ci sono altri fattori da considerare durante l&#39;esecuzione di questi metodi. Tecniche standard di sterili per la chirurgia e la cultura del tessuto devono essere seguite. Una combinazione di agenti antibatterici e antifungini utilizzati durante isolamento e la coltura, oltre a mantenere strumenti sterilizzati, zona di lavoro, e palati disinfettati ridurrà il rischio di contaminazione. Saliva, lavaggi nasali e simili campioni di secrezione mucosa dovrebbe essere ispezionata potenziale contaminazione con il sangue, come gli anticorpi sierici si trovano generalmente in concentrazioni più elevate. Inoltre, secrezioni mucose deve essere leggermente diluito in analisi per basse concentrazioni di anticorpi sono presenti in questi campioni rispetto al siero. I topi devono essere tenuti al caldo subito dopo l&#39;intervento chirurgico per presfogare la potenziale anestesia indotta l&#39;ipotermia. Alternate i topi riposano sul fianco durante il recupero post-intervento chirurgico per ridurre al minimo la respirazione irregolare. La procedura chirurgica è più efficiente con tre individui che lavorano insieme per completare questi compiti: uno di eseguire l&#39;intervento chirurgico, uno per aiutare a tenere la bocca aperta, e uno per fornire assistenza post-chirurgica, come i topi riprendersi dall&#39;anestesia. È necessario utilizzare la colorazione H e E di cranici sezioni trasversali al termine di tutte le procedure sperimentali o studi per verificare il successo della chirurgia per ciascun topo. Esiti di chirurgia possibili sono: NALT ablazione completa e bilaterale, ablazione incompleta o NALT intatto. Poiché non tutti gli interventi chirurgici comporta la perdita completa del NALT, animali con NALT residuo o intatto può essere utilizzato come controllo interno. Un altro risultato potenziale è che il palato non riesce a guarire completamente, lasciando un&#39;apertura che collega il naso e le cavità orali. Incompletoguarigione del palato si tradurrà in basso peso e ritardo della crescita, e questi individui dovrebbero essere rimossi dagli studi. Esaminando le risposte primo vaccino con il modello di topo servirà a stabilire un ruolo per NALT nel risultato di studio previsto (risposta anticorpale, la sopravvivenza, ecc.) Chirurgicamente rimuovendo il NALT facilita la determinazione dei contributi nasali per l&#39;immunità locale e sistemica. L&#39;approccio chirurgico qui descritto è il metodo più diretto per ottenere un modello murino privo di NALT. Selezionare knock-out modelli murini sono stati segnalati NALT mancanza, ma questi animali sono anche carenti di citochine e chemochine essenziali per lo sviluppo di altri tessuti linfatici secondari, e possono ospitare ulteriori difetti 12,13. Inoltre, i metodi descritti qui sono stati sviluppati per esaminare diversi aspetti della risposta immunitaria originari all&#39;interno dei passaggi nasali. I nostri risultati sperimentali si basano su studi che usano il palato tutta la parte superioree dal mouse per coltura tissutale, anche se è possibile che le sezioni possono essere utilizzati. Infine, il modello NALT coltivato è utile per eseguire esperimenti completamente in coltura tissutale.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Lame in acciaio inossidabile chirurgico sterile, N. 11 </td><td> Miltex </td><td> 4-311 </td><td></td></tr><tr><td> Knife Handle, No. 3 </td><td> Miltex </td><td> 4-7 </td><td></td></tr><tr><td> 48 e piastre di coltura cellulare </td><td> Costar </td><td> 3548 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino, inattivato al calore </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> Conc. finale: 10% in volume in terreni di coltura </td></tr><tr><td> Streptomicina solfato </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td> Conc. finale: 100 pg / mL </td></tr><tr><td> Penicillina </td><td> Sigma </td><td> P7794 </td><td> Conc finale: 100 UI / mL </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397-10ML </td><td> Conc. finale: 50 ug / mL </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td> Conc. finale: 1 ug / mL </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0887 </td><td> Conc. finale: 10 mM </td></tr><tr><td> Microcentrifuga Eppendorf Tubes </td><td> Eppendorf </td><td> 022364111 </td><td></td></tr><tr><td> Nutra-gel Cherry alimentare mouse Flavored Wet </td><td> Bio-Serve </td><td> S4798-VASSOIO </td><td></td></tr><tr><td> Metacam </td><td> Boehringer Ingelheim </td><td> 601531000 </td><td> Una goccia di 1,5 mg / ml sospensione orale </td></tr><tr><td> Ketamina </td><td> Pfizer </td><td> 00856440301 </td><td> Co finalenc: 6,06 mg / mL </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Vedco </td><td> VEDC207 </td><td> Conc. finale: 0,061 mg / mL </td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Lloyd </td><td> 4811 </td><td> Conc. finale: 0,667 mg / mL </td></tr><tr><td> Puralube Vet Pomata </td><td> Pharmaderm Animal Health </td><td> 1621 </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% cloruro di sodio USP di iniezione </td><td> Baxter </td><td> 2B1302 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 millimetri Microcurette </td><td> Roboz </td><td> RS-6350 </td><td></td></tr><tr><td> Cautery unità termica </td><td> Geiger </td><td> 150-S/150A-S </td><td></td></tr><tr><td> TCU Tip Replacement, Straight Loop fine </td><td> Geiger </td><td> 214 </td><td></td></tr><tr><td> Forbici chirurgiche </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10% di formalina tamponata neutra </td><td> Sigma </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Acido formico </td><td> Pescatore </td><td> A119P-4 </td><td> Mescolare 426 ml di acido formico in 1047 ml di acqua del rubinetto, quindi aggiungere 45 mL Rexyn 101 (H) </td></tr><tr><td> Rexyn 101 (H) </td><td> Pescatore </td><td> R231-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek VIP E150/E300 </td><td> Sakura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microtomo Rotary </td><td> Leica </td><td> RM2255 </td><td></td></tr><tr><td> Ematossilina di Mayer </td><td> Sigma </td><td> MHS16-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Ematossilina Gill No.1 </td><td> Sigma </td><td> GHS116 </td><td></td></tr><tr><td> Eosina B </td><td> Sigma </td><td> 2853 </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer Serum Separator </td><td> BD Medico </td><td> 365956 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaH 2 PO 4, 140 mM NaCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Cocktail inibitori della proteasi, EDTA-free </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78415 </td><td></td></tr></tbody></table>

examining the role of nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (nalt) in mouse responses to vaccines

I tessuti linforeticolari nasofaringeo-associati (NALT) che si trovano negli esseri umani, roditori ed altri mammiferi, contribuiscono a immunità nei seni nasali 1-3. Il NALT sono due parallele a forma di campana strutture localizzate nei passaggi nasali al di sopra del palato duro, e di solito sono considerati componenti secondari della mucosa-associato sistema linfatico 4-6. Situato all&#39;interno del NALT sono compartimenti distinti di linfociti B e T intervallati da cellule presentanti l&#39;antigene dendritiche 4,7,8. Queste cellule sono circondati da uno strato di cellule epiteliali intercalato con M-cellule che sono responsabili per il recupero antigene dalle superfici mucose delle vie respiratorie 9,10. Naive dei linfociti circolanti attraverso il NALT sono pronti a rispondere a primi incontri con agenti patogeni respiratori 7. Mentre NALT scompaiono negli esseri umani dall&#39;età di due anni, gli organi linfatici del Waldeyer Anello e, analogamente strutturato continuano a persistere °roughout vita 6. In contrasto con gli esseri umani, topi NALT mantenere per tutta la vita, fornendo così un modello animale conveniente per lo studio di risposte immunitarie originari all&#39;interno dei seni nasali 11. Colture di unicellulari sospensioni di NALT non sono pratici a causa di basse rese di cellule mononucleate. Tuttavia, biologia NALT può essere esaminato coltura ex vivo dell&#39;organo intatto, e questo metodo ha il vantaggio aggiuntivo di mantenere la struttura del tessuto naturale. Poiché in studi in vivo, i modelli che presentano difetti genetici knockout limitati a NALT non sono attualmente disponibili a causa di una scarsa comprensione del percorso di sviluppo. Per esempio, mentre linfotossina-a topi knockout sono atrofizzati NALT, placche di Peyer, linfonodi periferici, cellule follicolari dendritiche e di altri tessuti linfoidi sono alterati in questi topi geneticamente manipolati 12,13. In alternativa a topi knockout gene, p ablazione chirurgicaelimina ermanentemente NALT dal passaggio nasale senza influenzare altri tessuti. Il modello di topo risultante è stato utilizzato per stabilire relazioni tra le risposte NALT e immune ai vaccini 1,3. La raccolta di serie del siero, saliva, lavaggi nasali e secrezioni vaginali è necessario per stabilire la base delle risposte di accoglienza alla vaccinazione, mentre le risposte immunitarie provenienti direttamente dal NALT può essere confermata da coltura tissutale. Le procedure seguenti illustrano gli interventi chirurgici, la cultura dei tessuti e la raccolta dei campioni necessari per esaminare le risposte umorali locali e sistemici immunitarie a intranasale (IN) la vaccinazione.

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Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

I metodi per esaminare i contributi dei tessuti linforeticolari nasofaringeo associati (NALT) a risposte immunitarie nasali e sistemici di topi ai vaccini per via endonasale sono descritti. Abbiamo dimostrato una procedura chirurgica per stabilire una NALT-dipendente modello di topo e<em&gt; Ex vivo</em&gt; Culture di NALT estratti.

Esaminando il ruolo della rinofaringeo associata Tissue linforeticolare (NALT) nelle risposte mouse ai vaccini

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

examining-role-nasopharyngeal-associated-lymphoreticular-tissue-nalt

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

25.7K Views.  U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. I metodi per esaminare i contributi dei tessuti linforeticolari nasofaringeo associati (NALT) a risposte immunitarie nasali e sistemici di topi ai vaccini per via endonasale sono descritti. Abbiamo dimostrato una procedura chirurgica per stabilire una NALT-dipendente modello di topo e Ex vivo Culture di NALT estratti.

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Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Misurazione della carica batterica e Risposte immunitarie in topi infettati con Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Intranasale somministrazione di ricombinante Influenza vaccini nei modelli chimerico topo per studiare immunità delle mucose

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Un modello di topo transgenizzato IL-8 per il<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio a lungo termine delle risposte infiammatorie

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sovrapressione e purificazione dell&#39;uomo<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasi in<emEscherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected antigen or a combination of antigens into a plasmid, which enables a tailor-made and safe design. The administration of DNA vaccines into host cells leads to the expression of antigens that stimulate both humoral and cell-mediated immune responses. This report describes a protocol for the cloning of antigen sequences into the pCMV-EGFP plasmid, the immunization of adult zebrafish with the vaccine candidates by intramuscular microinjection, and the subsequent electroporation to improve intake. The vaccine antigens are expressed as green fluorescent protein (GFP)-fusion proteins, which allows the confirmation of the antigen expression under UV light from live fish and the quantification of expression levels of the fusion protein with ELISA, as well as their detection with a western blot analysis. The protective effect of the vaccine candidates is tested by infecting the fish with Mycobacterium marinum five weeks postvaccination, followed by the quantification of the bacteria with qPCR four weeks later. Compared to mammalian preclinical screening models, this method provides a cost-effective method for the preliminary screening of novel DNA-based vaccine candidates against a mycobacterial infection. The method can be further applied to screening DNA-based vaccines against various bacterial and viral diseases.

Here we describe a protocol for the immunization of the adult zebrafish (Danio rerio) with a DNA-based vaccine and demonstrate the validation of a successful vaccination event. This method is suitable for the preclinical screening of vaccine candidates in various infection models.

Immunizzazione di Zebrafish adulto per lo Screening preclinico di vaccini basati sul DNA

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to eradicate tumors. However, its application is limited by the development of graft-versus-host disease (GVHD), a major complication of BMT. GVHD is evoked when T-cells in the donor grafts recognizealloantigen expressed by recipient cells and mount unwanted immunological attacks against recipient healthy tissues. Thus, traditional therapies are designed to suppress donor T-cell alloreactivity. However, these approaches substantially impair the GVL effect so that the recipient&#39;s survival is not improved. Understanding the effects of therapeutic approaches on BMT, GVL, and GVHD, is thus essential. Due to the antigen-presenting and cytokine-secreting capacities to stimulate donor T-cells, recipient dendritic cells (DCs) play a significant role in the induction of GVHD. Therefore, targeting recipient DCs becomes a potential approach for controlling GVHD. This work provides a description of a novel BMT platform to investigate how host DCs regulate GVH and GVL responses after transplantation. Also presented is an effective BMT model to study the biology of GVHD and GVL after transplantation.

Graft-versus-host disease is a major complication after allogeneic bone marrow transplantation. Dendritic cells play a critical role in the pathogenesis of graft-versus-host disease. The current article describes a novel bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in the development of graft-versus-host disease and the graft-versus-leukemia effect.

Piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nella malattia di Graft-versus-Host

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

Trasfezione altamente efficiente dei macrofagi primari con mRNA trascritto in vitro

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...