Wir bedanken uns bei Steffen Koch für seine technische Unterstützung und Shannon Lee Layland (beide Fraunhofer IGB Stuttgart) für seine hilfreichen Anregungen zum Manuskript. Diese Arbeit wurde finanziell von der Attract-Programm der Fraunhofer-Gesellschaft und des BMBF (beide KS-L.) Unterstützt.

1. Vorbereitung der biologischen Probe <ol><li> Präparation von lebenden Zellen <ol><li> Herstellung von adhärenten Zellen <ol><li> Seed in vitro-kultivierten oder frisch isolierten Zellen auf einem Glasboden-Spiegel (Greiner BioOne / Deutschland) und inkubieren sie bei 37 ° C und 5% CO 2 bis Zellhaftung abgeschlossen ist. </li><li> Kulturmedium entfernen und danach vorsichtig waschen dreimal mit PBS vor Messung. Halten der Zellen mit PBS oder Zellkulturmedium während des gesamten Messverfahrens bedeckt. </li></ol></li><li> Herstellung von Zellen in Suspension <ol><li> Trennen in vitro-kultivierten Zellen nach Anspruch gemeinsame Protokolle (z. B. Trypsin-EDTA, Zellabschabung), zentrifugiert und die Zellen erneut zu suspendieren des erhaltenen Zellpellet wurde in PBS oder Zellkulturmedium. </li><li> Übertragen Sie 100 ul der Zellsuspension (Konzentration: max. 100.000 Zellen / ml) auf einem Glasboden Gericht. </li></ol></li></ol></li><li> Vorbereitung der natIVE-Gewebe <ol><li> Nach der Ernte der Gewebe, übertragen Sie sie auf sterile, eiskaltem PBS und bewahren Sie sie nicht länger als 12 Stunden bei 4 ° C oder auf Eis vor Messung. Frühere Experimente haben gezeigt, dass eine verlängerte Lagerzeit (kalte Ischämiezeit&gt; 12 Stunden bei 4 ° C) im spektralen Veränderungen durch natürliche Abbauprozesse geführt. </li><li> Die Messungen müssen mit dem Gewebe in PBS oder Medium bedeckt, um eine Beschädigung der ECM-Proteinen und Zellen aufgrund von Gewebe Trocknung vermeiden durchgeführt werden. </li></ol></li></ol> 2. Raman-Spektrometer Unsere maßgeschneiderten Raman-Spektrometer kombiniert eine Standard-Fluoreszenzmikroskop (Olympus IX 71) mit einem Raman-Spektrometer, die den direkten Vergleich von Hellfeld-und Fluoreszenz-Aufnahmen mit der Raman-Spektren ermöglicht. Die grundlegenden Einrichtung besteht aus einem 784 nm Diodenlaser (Toptica Photonik AG / Deutschland), ein Kerbfilter für die Trennung von der Raman-gestreute Licht von dem Anregungslicht, ein Mikroskop einnd einen Spektrographen (Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor / USA) mit einer Charge Coupled Device (CCD-Kamera) für den Nachweis von spektralen Informationen (von Soft Imaging Systems / Deutschland F-View) optimiert. 3. Steuerung von Laser-Funktion <ol><li> Starten Sie die Software Andor Solis (Andor / Großbritannien) und stellen Sie die Temperatur des CCD-Kamera bis -60 ° C, um den Lärm durch thermisch induzierte Ströme in der Kamera zu minimieren. </li><li> Legen Sie einen Silizium-Wafer auf dem Mikroskoptisch für die Kalibrierung. </li><li> Schalten Sie den Laser und stellen Sie die Leistung auf 85 mW. </li><li> Verwenden Sie die Software Zelle B (Olympus / Deutschland), um den Laser auf den Wafer zu konzentrieren, bis XY erscheint. </li><li> Messen Sie den Silizium-Wafer mit einer einzigen Integrationszeit von 1 s mit einem 60x Objektiv Luft. </li><li> Ändern der Einheit der x-Achse von Pixel-Zahl, um Raman-Verschiebung (cm -1) im Andor Solis Software. </li><li> Variieren Sie den Laser-Fokus des Silizium-Peak bei 520 cm -1 indas gesammelte Spektrum, um die maximal mögliche Intensität dieser Raman-Band zu finden. Der Mindestbetrag zählt muss höher als 11.000, um eine erfolgreiche Kalibrierung haben. </li></ol> 4. Raman-spektroskopische Messungen Alle Messungen werden bei Raumtemperatur durchgeführt. <ol><li> Grundeinstellungen <ol><li> Verwenden Sie einen 60x Wasserimmersionsobjektiv (Olympus / Deutschland) mit einer numerischen Apertur von 1,2, um das Spektrum der Proben zu sammeln. </li><li> Ändern Sie die Einstellungen Akquisition bis 10 Integrationen / 10 Sekunden für insgesamt 100 Sekunden pro Messung. </li></ol></li><li> Messung der adhärenten Zellen <ol><li> Nehmen Sie den Glasboden Schüssel mit den Zellen und legen Sie es auf dem Mikroskoptisch. </li><li> Um ein besseres Signal zu erhalten und sicherzustellen, Reproduzierbarkeit, fokussieren Sie den Laser auf den Zellkern, drehen Sie das Mikroskop Licht aus und sammeln Sie das Spektrum. </li><li> Messen eines Referenz-Spektrum des Hintergrundrauschens Esehr 10 Spektren durch Bewegen des Laserfokus neben der Zelle. Es ist wichtig zu bedenken, dass, wenn die Schärfe ein neuer Hintergrund für jede Tiefenschärfe müssen gesammelt werden. </li></ol></li><li> Messung von Zellen in Suspension <ol><li> Übertragen Sie 100 ul der Zellsuspension in den Glasboden Schüssel und legen Sie es auf das Mikroskop Bühne. </li><li> Fokus des Lasers auf der Mitte der Zelle, drehen Sie den Mikroskop Licht aus und sammeln Sie das Spektrum. </li><li> Messen eines Referenz-Spektrum des Hintergrundrauschens alle 10 Spektren durch Bewegen des Laserfokus neben der Zelle. Beim Wechsel des Fokus, muss ein neuer Hintergrund für die neue Tiefenschärfe erfasst werden. </li></ol></li><li> Die Messung der nativen Geweben <ol><li> Nehmen Sie die Probe und setzen Sie es in einem Glasboden Gericht. Der interessierende Bereich (ROI) ist ausgerichtet mit Blick auf den Boden der Schale. </li><li> Füllen Sie die Schale mit PBS genug, um die Probe zu decken. </li><li> Legen Sie ein Deckglas über die Probe, jede mov vermeidenement der Probe während der Messung. </li><li> Stellen Sie den Laser-Fokus in die Struktur von Interesse (Tiefenauflösung ist Laser-und Gewebe-abhängig) und sammeln Sie die Spektren. </li><li> Sammeln einer Referenz-Spektrum des Hintergrundrauschens alle 10 Spektren durch Bewegen des Laserstrahl auf aus dem gesamten Gewebebereich. Beim Wechsel des Fokus, muss ein neuer Hintergrund für die neue Tiefenschärfe erfasst werden. </li></ol></li><li> Die Messung der Immunfluoreszenz (IF)-markierten Kryoschnitten <ol><li> § frisch, Snap-gefrorenen Gewebeproben mit einem Standard-cryotom und montieren sie auf Silica-beschichtete Deckgläser. </li><li> Färben der Kryoschnitte nach einem Routine-Protokoll für IF, die nur einen kurzen Fixierungsschritt (max. 10 Minuten mit 4% Paraformaldehyd) und unter Verwendung geeigneter Antikörper für die Detektion des Proteins von Interesse. </li><li> Führen Raman-Messungen Fokussierung in dem Bereich, wo Fluoreszenz auftritt. </li></ol></li><li> Elastin Abbauversuche <ol><li> Place die ventricularis der Schweine seziert Aortenklappensegel (Elastin-reich, Blut anströmseitigen Schicht des Herzens Klappensegel) mit Blick auf die Unterseite der Glasboden Gericht. </li><li> Messen Sie die nativen Gewebe als &quot;nicht inkubierten Kontrolle&quot; bei 30 zufällig gewählten Punkten in der gesamten Gewebeoberfläche mit Schwerpunkt in den fibrillären Strukturen. </li><li> Teilen Sie die Probe in 3 Abschnitte und legen Sie sie in separate 2,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 2 ml einer Elastase-Lösung (5 U / ml, Worthington / Deutschland) gefüllt. </li><li> Inkubieren Sie das Gewebe entweder 15 oder 30 Minuten bei 37 ° C </li><li> Nach einer Inkubationszeit von entweder 15 oder 30 Minuten, entfernen Sie das Gewebe von der Eppendorf-Röhrchen und waschen Sie vorsichtig mit PBS, um vollständig zu stoppen der enzymatischen Reaktion. </li><li> Messen Sie jede Probe bei 30 zufällige Punkte, wobei der Schwerpunkt in den fibrillären Strukturen. </li></ol></li></ol> 5. Datenverarbeitung und-analyse <ol><li> Raman-Spektren Verarbeitung Die Vorbehandlung dererzeugten Spektren erfolgte mit OPUS-Software (Bruker Optik GmbH / Deutschland). <ol><li> Um Störsignale aus dem Glas und Medium sowie zu reduzieren, um Variationen von Veränderungen in der Ausrichtung während der Messung zu vermeiden, subtrahiert die entsprechenden Hintergrund-Spektrum von dem gesammelten Spektren. </li><li> Reduzieren Sie die Spektren der Wellenzahl Region zwischen 400-1800 cm -1, die die höchste Menge an Informationen bietet. </li><li> Bei Bedarf Normalisierung der Spektren der maximalen Spitze. Die Normalisierung Faktoren aus den Intensitätsschwankungen und systematische Ausfälle, die Vereinfachung der Nachweis von strukturellen Veränderungen in der Probe-Spektren. </li><li> Führen Sie eine Baseline-Korrektur, um die Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Experimente zu erhöhen. </li></ol></li><li> Raman-Spektren Analyse Die Raman-Spektren wurden mit Hilfe der PCA mit The Unscrambler (CAMO / Norwegen) Software. Diese multivariate Analyse erkennt Unterschiede und Gemeinsamkeiten innerhalb der spektralen DatenSets. Jedes Spektrum wird als ein einzelner Punkt in einem mehrdimensionalen Raum auf den gesammelten Zählungen für jeden Raman-Verschiebung der Basis aufgetragen. Jedes Prinzip Komponente (PC) beschreibt eine bestimmte Menge der gesamten Informationen in den Originaldaten enthalten. Der erste PC ist derjenige, der die höchste Quelle der Variation enthält. Jeder PC enthält folgende, in Ordnung, weniger Informationen als die vorherige. Jede Variable hat einen Wert und eine Beladung auf jedem PC. Durch Auftragen PCs (= Scores), können wichtige Zusammenhänge Probe ausgesetzt sein. Die Belastungen beschreiben den Beitrag jedes analysierte Variable an die PCA. <ol><li> Beschriften Sie jede Gruppe von Messungen durch die Schaffung von Zeile reicht für jede Probe-Gruppe. </li><li> Verwenden Sie die folgenden Grundeinstellungen für das PCA: Kreuzvalidierung, die NIPALS Algorithmus, keine Rotation und die Analyse starten. Diese Einstellungen sind abhängig von Spektren. </li><li> Führen Sie die PCA. </li></ol></li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Raman-spECTRA von anhaftenden Zellen erzeugt weisen oft ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis und eine geringe Signalintensität (Abb. 1). 11 Aufgrund der Tatsache, dass der Laserfokus in der Nähe der Glasboden, der Einfluss der Störung eingestellt werden muss Glas-Signal ist recht hoch, was Maskierung der eigentlichen Probe-Signal. Folglich könnte die Probe Signal minimiert oder sogar beseitigt werden während eines nachfolgenden Abzug des Hintergrunds. Somit ziehen wir es vor Zellen in Suspension zu verwenden für unsere Raman-spektroskopische Analyse, wie sie den Nachweis von mehr detaillierte spektrale Informationen möglich ist. Jedoch zeigen die Spektren von adhärenten und Suspensionszellen die gleichen Haupt-Peaks unterscheiden sich nur in ihrer Intensität. Zur Charakterisierung der verschiedenen Zelltypen innerhalb einer Suspension, ist keine Vorbehandlung erforderlich. Die mittlere Raman-Spektren und Standardabweichung von menschlichen Fibroblasten, mesenchymale Stammzellen (MSCs), Chondrozyten und Keratinozyten in Suspension gemessenenin Abbildung 2 dargestellt. Alle Raman-Spektren sind ähnlich strukturiert, mit Gipfeln, die aus typischen Biomolekülen wie Proteinen, Nukleinsäuren und Lipiden (siehe Tabelle 1). Für 12 dieser Zelltypen, der Spektralbereich zwischen 600 und 1800 cm -1 enthält die meisten relevanten spektralen Informationen, durch die deutliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Zelltypen (Abb. 2A) nachweisbar. Beispielhafte, betonte wir ein Spektralbereich (1280-1350 cm -1) zeigt klare strukturelle Unterschiede, die zugeordnet werden Molekülschwingungen von Kollagen und Lipiden ist. Im Gegensatz dazu sind morphologische Analysen nicht geeignet für die Identifizierung und Unterscheidung der meisten Zellen (2B-I). Während der Unterschied zwischen Chondrozyten und Hautzellen zu beobachten ist (Abb. 2D, H gegen B, F und E, I), sind Fibroblasten und MSCs schwer zu trennen unter ausschließlicher Verwendung von Hellfeld-micrsocopieren (Abb. 2 B, F gegen C, G). 13 Raman-spektroskopische Analyse von nativem Gewebe, insbesondere von ECM-Proteine, erfordert, dass ein ROI kann durch Hellfeld-Abbildung visualisiert, um in der Lage, auf die jeweilige Struktur zu konzentrieren. Für die Zuordnung eines Proteins an einer spezifischen Fingerabdruck-Spektrum, erzeugten wir Raman-Spektren von kommerziell erhältlichen reinen Proteinen und immunhistologisch gefärbten Gefrierschnitte. Hier haben wir festgestellt, das Fingerabdruck-Spektren der elastischen Fasern in nativen Geweben Vergleich lyophilisierten Elastin und Immunfluoreszenz-gefärbten Kryoschnitten Verwendung eines Antikörpers gegen Elastin. Da jedoch Elastin verfügt über eine hohe Autofluoreszenz, die in den Raman-Spektren reflektiert wird, ist die Datenanalyse Herausforderung (3A). Um das systematische Versagen aufgrund von Probe-spezifische Eigenschaften wie Autofluoreszenz, eine angemessene Verarbeitung der Datenmengen zu reduzieren, ist von entscheidender Bedeutung. In unseren Daten einalyses, verwendeten wir Normierung auf die deutlich höhere Signalintensität des reinen Proteins Elastin beseitigen und so, konnten wir vergleichbare Raman-Spektren zu erzeugen (3B). Elastin ist eines der stabilsten ECM-Proteine ​​im Körper und ist daher sehr schwer abbaubar. 14. In unserem experimentellen Aufbau, Abbau induzierte Elastin wir bei gesunden Schweinen Aortenklappensegel indem eine enzymatische Verdauung. Die Anwendung der multivariaten Analyse PCA, identifizierten wir signifikante Unterschiede zwischen den Raman-Spektren von enzymatisch behandelten Proben und native Steuerelemente (Abb. 3C). Diese spektralen Unterschiede wurden in der Lade-Spektrum bei 861, 1003 und 1664 cm -1 beobachtet. Erwartete strukturelle Veränderungen der Elastin-Fasern durch längere Belichtungszeiten zu Elastase wurden von HART-Färbung (Abb. 4), die ebenfalls in deutlicher trennbar Punktzahl Cluster wurden reflektiert (Abb. 3C) gezeigt. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig1.jpg" /> Abbildung 1. Mittlere Raman-Spektren von freistehenden und adhärente Fibroblasten. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig2.jpg" /> 2. (A) Mittlere Raman-Spektren und Standardabweichung von vier verschiedenen primären isolierten Zelltypen (Fibroblasten, MSCs, Chondrozyten und Keratinozyten). Der Rahmen unterstreicht den Spektralbereich von 1280 - 1350 cm -1 mit strukturellen Unterschieden. (BE) Hellfeld-Bilder von Einzelhäusern (B) Fibroblasten, (C) MSCs, (D) und Chondrozyten (E) Keratinozyten. Maßstabsbalken entspricht 20 um. (FI) Hellfeld-Abbildungen von den anhängenden (F) Fibroblasten, (G) MSCs, (H) Chondrozyten und (I) Keratinozyten. Scale-bar gleich 200 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig3.jpg" /> Abbildung 3. (A) Raman-Spektren ohne Normalisierung der lyophilized Elastin (blaue Linie), Immunfluoreszenz (IF)-markierten Kryoschnitten (orange Linie) und elastischen Fasern (rote Linie) im nativen Aortenklappensegel gemessen. Die hohe Signalintensität von lyophilisierten Elastin wird durch Autofluoreszenz verursacht. (B) Raman-Spektren nach der Normalisierung, um systemische Fehler zu beseitigen. (C) Spielstände und Belastungen der Vergleich zwischen unbehandelten Kontrollgruppe (rot) und enzymatisch abgebaut (blau und grün) elastischen Fasern innerhalb der nativen Gewebe. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig4.jpg" /> Abbildung 4. Hirschzungenfarn gefärbten Schweinen Aortenklappensegel. Elastische Fasern sind visualisiert in schwarz. (A) und (B) zeigen unbehandelten Kontrollgruppe und (C) und (D) zeigen Gewebeproben, die dem Elastin abbauenden Enzym Elastase für 30 Minuten ausgesetzt wurden. <table border="1"><tbody><tr><td> Wellenzahl in cm -1 </strong&gt; </td><td colspan="2"> Belegung 12 </td></tr><tr><td> 717-719 </td><td> CN </td><td> Phospholipide </td></tr><tr><td> 785-788 </td><td> DNA / RNA-Basen, OPO-Backbone </td><td> DNA / RNA </td></tr><tr><td> 1003 - 1005 </td><td> Phenylalanin </td><td> Protein </td></tr><tr><td> 1220-1280 </td><td> Amid-III </td><td> Protein </td></tr><tr><td> 1445-1447 </td><td> CH 2 </td><td> Protein / Lipid </td></tr><tr><td> 1655-1680 </td><td> Amid IC = C </td><td> Protein-Lipid </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Raman-Banden, die in Spektren aller Zelltypen (Fibroblasten, MSCs, Chondrozyten und Keratinozyten) erkannt werden.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Raman-Spektroskopie ist ein geeignetes Instrument, um biologische Proben, wie In-vitro-kultivierten Zellen und ECM-Proteine ​​sowie Zellen in natürlichem Gewebe analysieren. 11,15,16 Hier haben wir gezeigt, dass dieses berührungslose, ermöglicht Label-freien Technik der Unterscheidung verschiedener Zelltypen und der Nachweis von ECM Proteinabbau die ausschließlich auf der biomolekularen Zusammensetzung dieser biologischen Proben. Der große Vorteil der Raman-Spektroskopie ist die Fähigkeit, nicht invasiv zu quantifizieren die biochemische Fingerabdruck einer Probe durch die entstehende Raman-Spektren. Im Gegensatz zu Infrarot-Spektroskopie, die ähnliche Informationen liefert, können Raman-Spektren von wässrigen Proben gesammelt werden, wie die Raman-Streuung von Wasser ist schwach. Darüber hinaus wird die Raman-Spektroskopie ausschließlich auf dem Nachweis der Rückstreuung von monochromatischem Licht basiert, weshalb keine Probe Verarbeitung wird vor Messung erforderlich ist. Diese Attribute machen RaMann-Spektroskopie eine vielversprechende Alternative für potenzielle In-vivo-Imaging-Applikationen. In dieser Hinsicht ist kohärente Anti-Stokes Raman-Spektroskopie (CARS) eine sehr interessante Technik, da sie schneller und empfindlicher Erfassung von Daten auf den gleichen Schwingungs-Signale in unseren Experimenten verwendeten Basis ermöglicht. 15,16 Andere alternative Methoden, einschließlich Multiphotonen-induzierter Autofluoreszenz und Erzeugung der zweiten Harmonischen Bildgebung wurden zuvor als geeignet erwiesen für die Überwachung der biologischen Proben nicht-oder minimal invasiv. 17 Allerdings sind diese bildgebenden Verfahren sind mit sehr hohen Kosten verbunden und werden an Autofluoreszenz-erzeugenden Moleküle beschränkt. Darüber hinaus ist Raman-Spektrometer leicht mit herkömmlichen optischen Mikroskopen verbinden. Diese Eigenschaften machen die Raman-Spektroskopie ein wertvolles Werkzeug, um biologische Proben in physiologischen Umgebungen zu studieren. Eines der aktuellen Einschränkungen unserer Raman-Spektroskopie ist eingerichtetDie relativ kleine Laserfokus (250 nm Halbwertsbreite (FWHM) seitliche und 700 nm FWHM axial), die von einer hohen numerischen Apertur Objektiv (NA = 1,2) erzeugt wird. Obwohl eine hohe numerische Apertur ermöglicht, eine gute Menge des emittierten Raman-Licht was in einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis zu decken, erzeugt die hohe NA nur eine kleine Auswahl Fokus innerhalb der Probe, die typischerweise viel kleiner als eine Zelle. Um Raman-Spektren von verschiedenen Zellen vergleichen zu können, ist die Sammlung von einer repräsentativen Spektrum wesentlich, das ist schwierig, mit einem kleinen Schwerpunkt zu erhalten. Um dieses Problem anzugehen, sind wir auf einem Prozess, um das Signal Sammlung an verschiedenen Stellen innerhalb der Zelle (= Raman-spektroskopische Mapping), was zu einer spektralen Mittelung und Nachgeben gegenüber einem repräsentativen Spektrum automatisieren arbeiten. Darüber hinaus wird diese Technik einen Überblick über die Verteilung der spezifischen Raman-Banden, zum Beispiel des Proteins innerhalb einer Zelle. Biol.miologische Proben sind sehr komplex und bestehen aus einem heterogenen Gemisch von Biomolekülen, die mit dem gesammelten Ramanspektren wirken. Daher ist die spektrale Muster sehr komplex und die Überwachung eines einzigen Typ eines Moleküls in einem Raman-Spektrum nur schwer mit der Überlagerung verschiedener Signale Molekül zu erreichen. Darüber hinaus kann intrinsische Fluoreszenz der Probe zu maskieren wertvolle Informationen schwächerer Raman-Signale. Interessanterweise wird in einigen unserer früheren Studien haben wir festgestellt, in den Raman-Spektren Autofluoreszenz als wichtigste Unterscheidungsmerkmal zwischen Zelltypen (MSCs und Fibroblasten) mit einem geeigneten Analyse-Tool. 13. Wir auch festgestellt, dass die Veränderung der gesamtwirtschaftlichen Raman-Signalintensität kann als dienen ein Indikator für den Zustand von Kollagen und kollagenen Fasern innerhalb der ECM von Aortenklappensegel. 9 jedoch bei der Analyse des Zustandes von Elastin in diesen Geweben, waren wir nicht in der Lage, ähnliche Ergebnisse zu erkennen. Wie in der Folge genanntens Abschnitt waren wir nur in der Lage, Veränderungen der spezifischen Raman-Banden in den Elastase-behandelten Proben erkennen, wenn auf die nativen Kontrollen verglichen. Wir haben nicht einen Rückgang des gesamten Raman-Signal in den enzymatisch behandelten Proben wie erwartet. Diese Beobachtungen führten zu einem Score-Diagramm, das nicht verraten wollte eine klare Cluster-Bildung wie in der vorherigen Studie beobachtet. 9 Im Gegensatz dazu der Einfluss der enzymatischen Behandlung wurde im Rahmen der PCA Ergebnisse nachweisbar. Wir gehen davon aus, dass diese Diskrepanzen zwischen den beiden ECM-Proteine, Elastin und Kollagen, auf morphologischen Unterschieden und unterschiedlichen enzymatischen Abbauprozessen beruhen: innerhalb der Aortenklappe Flugblatt, ist die Kollagen-reiche Zone (fibrosa) eine durchgehende Schicht, die durch das Lösen wird enzymatische Behandlung, wobei das Elastin enthaltende Zone (ventricularis) eine Netzwerk-Konfiguration, führen nach der Exposition gegenüber Elastase (4) angezeigt wird. Einzel-Messungen vor Ort waren daher nicht entspreaß, solche kleinen Brüche innerhalb der Elastin-Netzwerk zu erkennen. Hier würde ein Raman-Mapping des Gewebes zu helfen, um Netzwerk-Übersicht zu identifizieren. Eine weitere Herausforderung bei Raman-Spektroskopie von biologischen Proben ist, die Messung zu reduzieren. Eine Lösung ist, die Laserleistung, die geeignet, solange die biologischen Proben nicht durch Photo-Schäden betroffen ist zu erhöhen. Alle unsere aktuellen Experimente sind Proof-of-principle-Studien mit Schwerpunkt auf der Grundlagenforschung, allerdings ist unser übergeordnetes Ziel zu Raman-Spektroskopie für klinische Anwendungen einschließlich der regenerativen Medizin (z. B. Qualitätskontrolle von Tissue-Engineering-Produkten), vor der Transplantation Transplantat Überwachung und Umsetzung Krebsdiagnostik.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Elastase </td><td> Worthington </td><td> LS006363 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Elastin-Antikörper </td><td> Sigma </td><td> HPA018111 </td><td> 1:75; Citratpuffer </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td></td></tr><tr><td> Glasboden Gerichte </td><td> Greiner BioOne </td><td> 627860 </td><td></td></tr><tr><td> Die Unscrambler </td><td> CAMO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opus </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-contact, label-free monitoring of cells and extracellular matrix using raman spectroscopy

Zerstörungsfreie, berührungslose und Label-freien Technologien zur Zell-und Gewebekulturen zu überwachen sind auf dem Gebiet der biomedizinischen Forschung benötigt werden. 5.1 jedoch derzeit verfügbaren Methoden erfordern Routine Verarbeitungsschritte und die Integrität der Probe verändern. Raman-Spektroskopie ist ein schnelles Verfahren, das die Messung von biologischen Proben ermöglicht, ohne die Notwendigkeit für weitere Verarbeitungsschritte. . Dieser Laser-basierte Technologie erkennt die inelastische Streuung von monochromatischem Licht 6 Wie jede chemische Schwingung zu einem bestimmten Raman-Bande (Wellenzahl in cm -1) zugeordnet ist, verfügt jeder biologischen Probe eines typischen spektralen Muster aufgrund ihrer inhärenten biochemische Zusammensetzung 7. - 9 Im Raman-Spektren, die Peakintensitäten korreliert mit der Menge der vorliegenden molekularen Bindungen. 1 Ähnlichkeiten und Unterschiede der spektralen Datensätze unter Verwendung einer multivariaten Analyse (zB Hauptkomponentenanalyse (PCA)) detektiert werden kann. 10 </sup&gt; Hier führen wir die Raman-Spektroskopie an lebenden Zellen und nativen Geweben. Die Zellen werden entweder auf Glasboden ausgesät oder in der Schwebe gehalten unter normalen Bedingungen der Zellkultur (37 ° C, 5% CO 2) vor der Messung. Native Gewebe präpariert und in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° C vorherigen Messungen. Je nach unserer experimentellen Aufbau, wir dann entweder auf dem Zellkern oder extrazellulären Matrix (ECM) Proteine, wie Elastin und Kollagen konzentriert. Bei allen Untersuchungen werden mindestens 30 Zellen oder 30 zufällige Punkte von Interesse innerhalb des ECM gemessen. Daten Bearbeitungsschritte enthalten Hintergrund-Subtraktion und Normalisierung.

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Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Raman-Spektroskopie ist eine geeignete Technik für die berührungslose, Label-freie Analyse lebender Zellen, Tissue-Engineering-Konstrukten und nativen Geweben. Quellenspezifische spektralen Fingerabdrücke können generiert und analysiert werden mit multivariaten Analyse.

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

non-contact-label-free-monitoring-cells-extracellular-matrix-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.8K Aufrufe.  Eberhard Karls University, Tübingen. Raman-Spektroskopie ist eine geeignete Technik für die berührungslose, Label-freie Analyse lebender Zellen, Tissue-Engineering-Konstrukten und nativen Geweben. Quellenspezifische spektralen Fingerabdrücke können generiert und analysiert werden mit multivariaten Analyse.

Serie: Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Forschung

Biotechnik

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Einem mikrofluidischen Biochip-basierte Elektrochemische für Markierungsfreie DNA-Hybridisierungsanalyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Ein Markierungsfreie Technik für die Raum-zeitliche Imaging von Single Cell Sekrete

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Herstellung von extrazellulären Matrix Proteinfasern für Brillouin-Spektroskopie

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-Chip: Eine Label-freie Studie von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Herstellung einer Niere Cortex extrazelluläre Matrix abgeleitet Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used method, but has the drawback that it requires fluorescent labeling, which can interfere with the activity of the molecules. Also, photobleaching and photodamage are concerns. In the case of microtubules, we have found that images of similar quality to TIRF can be obtained using interference reflection microscopy (IRM). This suggests that IRM might be a general technique for visualizing the dynamics of large biomolecules and oligomers in vitro. In this paper, we show how a fluorescence microscope can be modified simply to obtain IRM images. IRM is easier and considerably cheaper to implement than other contrast techniques such as differential interference contrast microcopy or interferometric scattering microscopy. It is also less susceptible to surface defects and solution impurities than darkfield microscopy. Using IRM, together with the image analysis software described in this paper, the field of view and the frame rate is limited only by the camera; with a sCMOS camera and&#160;wide-field&#160;illumination&#160;microtubule length can be measured with precision up to 20 nm with a bandwidth of 10 Hz.&#160;

This protocol is a guide for implementing interference reflection microscopy on a standard fluorescence microscope for label-free, high-contrast, high-speed imaging of microtubules using in vitro surfaces assays.

Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie für etikettenfreie High-Speed-Bildgebung von Mikrotubuli

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Optical Trapping of Plasmonic Nanoparticles for In Situ Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Characterizations

Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) enables the ultrasensitive detection of analyte molecules in various applications due to the enhanced electric field of metallic nanostructures. Salt-induced silver nanoparticle aggregation is the most popular method for generating SERS-active substrates; however, it is limited by poor reproducibility, stability, and biocompatibility. The present protocol integrates optical manipulation and SERS detection to develop an efficient analytical platform to address this. A 1064 nm trapping laser and a 532 nm Raman probe laser are combined in a microscope to assemble silver nanoparticles, which generate plasmonic hotspots for in situ SERS measurements in aqueous environments. Without aggregating agents, this dynamic plasmonic silver nanoparticle assembly enables an approximately 50-fold enhancement of the analyte molecule signal. Moreover, it provides spatial and temporal control to form the SERS-active assembly in as low as 0.05 nM analyte-coated silver nanoparticle solution, which minimizes the potential perturbation for in vivo analysis. Hence, this optical trapping-integrated SERS platform holds great potential for efficient, reproducible, and stable molecular analyses in liquids, especially in aqueous physiological environments.

Optical Trapping of Plasmonic Nanoparticles for In Situ Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Characterizations

The present protocol describes a convenient approach to integrating optical trapping and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) to manipulate plasmonic nanoparticles for sensitive molecular detection. Without aggregating agents, the trapping laser assembles plasmonic nanoparticles to enhance the SERS signals of target analytes for in situ spectroscopic measurements.

Optisches Einfangen plasmonischer Nanopartikel für In-situ-oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie-Charakterisierungen

Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) enables the ultrasensitive detection of analyte molecules in various applications due to the enhanced electric ...