Dieses Protokoll kann Wissenschaftlern, die an nichtlinearer Mikroskopie interessiert sind, helfen, die wichtigsten Komponenten, die Einrichtung und das Ausrichtungsverfahren eines Mikroskops auf der Grundlage der stimulierten Raman-Streuung zu verstehen. Die Hauptvorteile der SRS-Mikroskopie sind ihre Fähigkeiten, eine etikettenfreie Bildgebung auf der Grundlage des Vibrationskontrasts durchzuführen und ein Bild in wenigen Sekunden zu erfassen. Die SRS-Mikroskopie hat die etikettenfreie Bildgebung in neue Höhen getrieben, insbesondere Studien komplexer biologischer Strukturen wie Lipide, die für Zellen und zelluläre Architektur von grundlegender Bedeutung sind.
SRS-Signal wird als eine kleine Änderung in der Intensität des Sondenstrahls erkannt und kann durch Rauschen beschädigt werden. Daher ist ein genaues Zeichen entscheidend. Richten Sie zunächst den OPO und die Titan-Saphir-Laserstrahlen so aus, dass beide das Mikroskop erreichen.
Als nächstes platzieren Sie die Detektoren des Laserstrahlpositionssensors in zwei Positionen zwischen dem dichroitischen Spiegel eins und dem Spiegel sechs. Die erste Position befindet sich in der Nähe von dichroitischem Spiegel eins und die zweite ist in der Nähe von Spiegel sechs. Verwenden Sie für jede Position die Sensoren, um die X- und Y-Koordinaten des OPO-Strahls zu erkennen.
Wichtig ist, dass die X- und Y-Koordinaten des Titan-Saphir-Laserstrahls in beiden Positionen der Detektoren des Sensors vom gleichen OPO sind. Wenn in einigen Positionen die Koordinaten nicht übereinstimmen, stimmen Sie die Neigung des angrenzenden Spiegels zum Ausgleich ab. Befolgen Sie das gleiche Verfahren, um die Titan-Saphir-Strahlpositionen in Bezug auf OPO für den Pfad zwischen den Sechs- und Siebener-Pfaden des Spiegels auszurichten.
Installieren Sie einen zusätzlichen Spiegel auf einer Flip-Flop-Halterung zwischen Spiegel sechs und sieben und kippen Sie die Halterung des Spiegels, um den Strahl in den Autokorrelator zu lenken. Schalten Sie den Autokorrelator-Controller ein, starten Sie die Softwareanwendung auf dem Computer, der ihn steuert, und stellen Sie die Strahlabstandseinstellungsschraube des Autokorrelators auf 8,35 Millimeter in die normale Position. Stoppen Sie dann den Titan-Saphir-Strahl und lösen Sie den OPO-Strahl vom zusätzlichen Spiegel auf den Eingangsspiegel des Autokorrelators.
Versuchen Sie, den Eingangsspiegel einzustellen, um das Laserpulssignal zu maximieren, wie hier gezeigt. Als nächstes stoppen Sie den OPO-Strahl und lösen Sie den Titan-Saphir-Strahl vom Flip-Flop-Spiegel auf den Eingangsspiegel und in den Autokorrelator. Wiederholen Sie die optimale Strahleinstellung, bis das hier gezeigte Autokorrelatorsignal erreicht ist.
Stellen Sie nun die Strahlabstandseinstellungsschraube auf die Kreuzposition auf 7,30 Millimeter ein. Lösen Sie beide Träger und scannen Sie die verzögerte Linie, um die beiden Träger zu überlappen. Erhalten Sie das resultierende Kreuzkorrelatorsignal, wie hier gezeigt.
Drehen Sie dann den Flip-Flop-Spiegel, so dass die Strahlen Spiegel sieben und den Scankopf des Mikroskops erreichen können. Entfernen Sie den Kondensator und verwenden Sie die Escape-Taste, um die 60-fache subjektive Linse vorübergehend zurückzuziehen. Drehen Sie dann das Nasenstück, um die 60x subjektive Linse vom optischen Pfad zu entfernen.
Als nächstes montieren Sie den Detektor mit der externen mechanischen Halterung am oberen Teil des Mikroskops. Verbinden Sie den Ausgang des Detektors über einen 50 Ohm Low Pass Filter mit einem Oszilloskop. Schalten Sie nun den Prozessor ein, der den Scannerkopf steuert, und projizieren Sie den OPO-Strahl in den Scannerkopf des Mikroskops.
Überwachen Sie das OPO-Signal und maximieren Sie die vom Detektor gemessene Leistung mit einem XY-Übersetzer. Wechseln Sie dann den Strahl vom OPO-Laser zum Titan-Saphir-Laser und stellen Sie sicher, dass auch für den Titan-Saphir-Laser ein Signal erhalten ist. Dies weist darauf hin, dass beide Träger gut ausgerichtet sind.
Finalisieren Sie die Strahlausrichtung, indem Sie das Nasenstück zurückdrehen, um das 60x subjektive einzuführen. Verwenden Sie dann die Refokus-Taste am Mikroskop, um den endgültigen Fokus auf die 60-fache Mikroskopobjektivlinse wiederzuerlangen. Platzieren Sie schließlich das Ziel mit einer Vergrößerung von 40x anstelle des Kondensators, ohne die Probe zu berühren oder zu stören.
Stellen Sie die Leistung der vor dem Mikroskop gemessenen Titan-Saphir- und OPO-Laser auf 30 Milliwatt für beide Strahlen ein. Stellen Sie dann die Wellenlänge des OPO-Lasers auf einen anderen Wert gegenüber dem vorherigen ein, so dass Pumpe und Sonde nicht in Resonanz mit der Schwingungsfrequenz der Perlen sind. Lassen Sie als Nächstes beide Strahlen los, so dass sie in das Mikroskop gelangen.
Führen Sie die Computer-Übersetzung scanngesteuert aus, und zeichnen Sie die gemessene Intensität mit dem Sperrverstärker für jede Position der Verzögerungsleitung auf. Warten Sie, bis der Scan der Verzögerungszeile abgeschlossen ist. Stellen Sie nun die Wellenlänge des OPO wieder auf 1076 Nanometer ein, so dass Pumpe und Sonde mit der Schwingungsfrequenz der Perlen in Resonanz sind.
Führen Sie die Computer-Übersetzer-Scanverzögerungszeile aus, und warten Sie, bis die Scan-Verzögerungszeile abgeschlossen ist. Schließlich legen Sie die erhaltene Überlappungsstrahlposition und die Verzögerungslinie für die nächste Erfassung von stimulierten Raman-Streubildern fest. Um die räumliche Synchronisation der Strahlen zu optimieren, beginnen Sie mit dem Anhalten des Titan-Saphirstrahls und reduzieren Sie die OPO-Leistung auf acht Milliwatt.
Schließen Sie als Nächstes den Auslese-Detektor an die Datenerfassungskarte an. Führen Sie das Datenerfassungsprogramm zusammen mit der Rasterkonsole des Mikroskops aus. Wenn Sie fertig sind, speichern Sie die Datei und verarbeiten Sie die Daten, um ein Bild wie das hier gezeigte zu erhalten.
Als nächstes stoppen Sie den OPO-Strahl und reduzieren Sie die Titan-Saphir-Leistung auf 2,5 bis 4,5 Milliwatt. Verbinden Sie den Detektor mit dem Einsperrverstärker und dessen Auslesungen mit der Datenerfassungskarte. Führen Sie dann das Datenerfassungsprogramm zusammen mit der Rasterkonsole des Mikroskops erneut aus.
Wenn Sie fertig sind, speichern Sie die Datei und verarbeiten Sie die Daten, um ein Bild wie das hier gezeigte zu erhalten. Führen Sie einen Stapel von Filtern zwischen dem 40-fachen Objektiv und der Photodiode ein, um die Pumpenimpulse zu entfernen und nur das Stoke-Signal zu erfassen. Stellen Sie dann das Pumpensignal auf 810 Nanometer mit einer fokussierten Leistung von acht Milliwatt ein.
Stellen Sie das Sondensignal auf 1076 Nanometer mit der gleichen fokussierten Leistung von acht Milliwatt ein, um eine typische Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindung von Polystyrol mit einer Raman-Verschiebung von 3054 inversen Zentimetern zu untersuchen. Schließen Sie den Detektor mit dem Einsperrverstärker und dem Auslesen des Einsperrverstärkers an die Datenerfassungskarte an. Legen Sie schließlich das Pixelformat und die Erfassungszeit im Mikroskopprogramm fest und führen Sie es und das Datenerfassungssystem aus, wodurch die Matrixdatei gespeichert wird, sobald sie abgeschlossen ist.
Hier wird eine Beispielmessung von einem einzelnen Punkt der Probe angezeigt. Wenn der Strahl nicht in Zeit oder Raum überlappt ist, ist das erhaltene Ergebnis aus Resonanz, wobei die Amplitude des Signals, gemessen durch einen Einsperrverstärker, Null ist. Die Phase dieses Signals springt jedoch zwischen negativen und positiven Werten.
Wenn die Balken im Raum überlappen, erhöht sich das Signal und erreicht sein Maximum, wenn die Strahlen in der Zeit perfekt überlappen, während die Phase beginnt, einen festen Wert während der Zeit zu erreichen, in der die Strahlen überlappen. In einem Übertragungsbild wird ein einzelner Strahl verwendet und die übertragene Strahlintensität aus der Probe wird durch eine Photodiode gemessen. Auf der linken Seite wurde das Übertragungsbild mit OPO erhalten, während auf der rechten Seite das Übertragungsbild mit Titan-Saphir erhalten wurde.
Hier wird ein typisches Beispiel für ein SRS-Bild gezeigt, in dem etikettenfreie Bilder von Polystyrolperlen mit durchmessern von drei Mikrometern berichtet werden. Um ein hochwertiges Bild auf Basis der SRS-Mikroskopie zu erhalten, ist die Ausrichtung eines Mikroskops entscheidend. Daher müssen alle im Protokoll angegebenen Schritte sorgfältig durchgeführt werden.
