Diese Arbeit wurde von der NSF Auszeichnung DBI 0852891 gefördert. Ein Teil dieser Arbeiten wurde auch durch das Zentrum für Biophotonik Science and Technology, einem ausgewiesenen NSF Science and Technology Center der University of California, Davis gelungen, unter Cooperative Agreement No PHY0120999 finanziert.

1. Einige Vorsicht ist bei der Vorbereitung und Platzierung eines Raman-Probe innerhalb dieses Systems getroffen werden. <ol><li> Da das System in der Regel nutzt eine sehr hohe numerische Apertur Ziele mit sehr geringen Arbeitsabstand, werden die Proben auf einem Deckglas platziert. Biologische Proben sind in der Regel auf einer Nr. 1 Dicke Deckglas in einem Attofluor Zellkammer (Invitrogen, Carlsbad, CA) montiert platziert. </li><li> Flüssige Proben, vor allem für den Menschen giftig sind in einer kleinen Glasflasche mit einem Deckglas zementiert, um die Öffnung durch eine Silikon-Epoxy-gelegt. Die Flasche wird dann für die Messung invertiert. </li><li> Da unser System hängt präzises Timing der Pumpe und Signalimpulse, sind wir gezwungen nicht auf die herkömmliche Fokuseinstellung unserer Mikroskop, das das Ziel übersetzt nach oben und unten verwenden. Dies addiert und subtrahiert optischen Weg von unserem System. Stattdessen legen wir unsere Proben auf einer zweiten Stufe auf der Oberseite des Mikroskops, dass ihre eigenen, unabhängigen Fokus Kontrolle hat montiert. </li></ol> 2. Um Zeit-gated Raman-Spektren lassen, muss der Anregungsstrahl gut vorbereitet sein. <ol><li> Wir beginnen mit Licht, das aus einem 2,4 W abstimmbare, gepulste Ti: Sapph Laser (Chameleon, Coherent Systems, Santa Clara, CA). Jeder Impuls in der 80 MHz Impulsfolge hat 30 nJ Energie, hat eine zeitliche Breite von 140 fs und hat ein Spektrum bei 808 nm mit einer spektralen Bandbreite von ca. 6 nm zentriert. </li><li> Um zu verhindern, Back-Reflexionen von Wiedereinstieg in den Laserresonator wird das Licht durch einen Faraday-Isolator weitergegeben. Ein Halbwellenplatte vor dem Faraday-Isolator gelegt ermöglicht eine kontinuierliche Optimierung der Gesamtleistung in das System gesendet werden. </li><li> Weil 6 nm ist eine zu breite Bandbreite für die meisten Raman-Modi zu lösen, wird der Strahl durch eine sehr schmale (0,8 nm FWHM, Andover Corporation, Salem, NH) Bandpassfilter bei 808 nm zentriert geschickt. </li><li> Das Licht wird dann durch eine achromatische Dublett (f = 100 mm) auf eine 5 mm β-Barium-Borat (BBO) Kristall (CASIX, Fuzhou, Fujian, VR China) auf die Wellenlänge von 808 nm bis 404 nm zu halbieren konzentriert. Die BBO-Kristall ist in eine Halterung mit Spitze und Neigefunktion gelegt, und auch auf eine Übersetzung der Bühne montiert. Zur Maximierung der Effizienz der Wellenlänge Umwandlung, muss der Kristall platziert genau symmetrisch um den Schwerpunkt des Dubletts, und mit seinen Kristall-Achse auf die Polarisation des einfallenden Strahls ausgerichtet. </li><li> Da die Effizienz der Wellenlänge Umwandlung polarisationsabhängigen kann die Kontrolle über die Menge des Lichts an der Probe, indem sie eine zweite Halbwellenplatte nach dem Faraday-Isolator erhältlich. Durch Drehen dieses Verzögerungsplatte, kann die Intensität des Lichts an der Probe unabhängig von der Intensität in der Pumpstrahl (die nachstehend erörtert werden) geschickt angepasst werden. </li><li> Die Wellenlängen-konvertierte Licht wird durch eine zweite achromatische Dublett (f = 500 mm) gewählt werden, dass der austretende Strahl groß genug, um den Rücken Apertur des Mikroskop-Objektivs zu füllen, und gerichtet in einem inversen Mikroskop (IX-71, Olympus ist rekollimierten, Center Valley, PA) mit Hilfe von zwei Kippspiegel. </li><li> Die Mikroskop-Objektiv, wobei das optische Element in die monolithische Komponente des Systems untergebracht ist, definiert der optischen Achse. So richten Sie den Anregungsstrahl zu dieser Achse, ist ein Spiegel in der Probe des Mikroskops platziert. Die beiden Kippspiegel werden dann iterativ optimiert unter Beachtung der Back-reflektierter Laserstrahl auf einen CCD-cam-era (μEye, IDS, Obersulm, Deutschland) an der Imaging-Anschluss des Mikroskops. Unter der Annahme, dass das Bild auf der Kamera auf dem Mikroskop-field-of-view zentriert ist, wird der Strahl auf der Achse, wenn der Brennfleck auf dem Mikroskop-Chip und die Übersetzung von dem Ziel entlang der z-Achse zentriert ist nicht ändert den Mittelpunkt der defokussiertem Strahl. </li><li> Wenn eine Probe in der Probe Ebene platziert und Bestrahlung mit Laserlicht Raman-Streuung auftritt. Eine dichroitische Filter unterhalb des Mikroskop-Objektivs platziert trennt die Wellenlängen verschoben Raman-Streulicht (und Fluoreszenz) von der Anregungsstrahl, die Leitung der Raman-Streulicht auf der Seite Port des Mikroskops. Das Mikroskop wurde modifiziert, um alle Objektive in diesem Weg, so dass das Signal Licht aus dem Mikroskop kollimiert entsteht entfernen. </li><li> Da das Signal austretende Strahl aus dem Mikroskop ist größer als die Apertur des Glan-Thompson-Polarisatoren eine 0.47x Teleskop aus zwei achromatischen Dubletts (f1 = 75 mm, f2 = 35 mm) gebaut wird verwendet, um den Strahl zu schrumpfen. </li><li> Das Signal Licht wird dann durch eine polarisierte Glan-Thompson Polarisator orientiert bei 0 ° in Bezug auf vertikale im Laborsystem, und auf einen dichroitischen Spiegel, wo sie mit den Pumpstrahl rekombiniert wird. </li></ol> 3. Um für die optische Tor mit höchster Effizienz zu betreiben, muss bei der Vorbereitung der Pumpstrahl (Kerr Balken) als auch eingenommen werden. <ol&gt; <li> Der Pump-Puls wird zunächst durch 0.35x mit einem Teleskop mit zwei achromatischen Dubletts (f1 = 35 mm, f2 = 100 mm) gebaut, um die endgültige Größe des Signals Strahl Spiel vergrößert. </li><li> Der Pumpstrahl wird dann in eine Delay-Line aus einem rechtwinkligen Prisma auf eine lineare Übersetzung Bühne, die abgestimmt auf zeitliche Überlappung der Pumpe und Signalimpulse (Abstimmung auf unten diskutiert werden) sicherstellen können platziert werden zusammen verschickt. </li><li> Nach der Delay-Line wird der Strahl durch einen Halbwellenplatte und Polarisator, die unter 45 ° zur vertikalen geschickt im Laborsystem. Dies gewährleistet die richtige Polarisationszustand des Pumpstrahl, wenn es das nichtlineare Medium erreicht. </li><li> Das Licht wird dann von zwei Kippspiegel, eins mit piezo-elektrischen Steuerungen, die verwendet werden, um eine Feineinstellung der Position der Pumpstrahl reflektiert werden, so dass es Überschneidungen räumlich mit dem Signal Strahl. Die Überlappung ist durch die Beobachtung der Pumpe und Signal Balken an zwei Standorten, einem in der Nähe und man weit von dem dichroitischen Spiegel, wo die Strahlen in Kombination erhalten. Durch den Einsatz der ersten Kippspiegel der beiden Strahlen an der Nahpunkt, und der Piezo-Spiegel die Strahlen am äußersten Punkt überschneiden, kann die Pumpe Strahl exakt kollinear mit dem Signal Strahl getroffen werden. </li><li> Mit den beiden Strahlen kombiniert, sind die Kerr-Gate-und Sammelsystem bis zu den gesammelten Zeit-gated-Signal maximieren gesetzt. </li></ol> 4. Mit den beiden Strahlen kombiniert, sind die Kerr-Gate-und Sammelsystem bis zu den gesammelten Zeit-gated-Signal maximieren gesetzt. <ol><li> Die Pumpe und Signal Balken werden zunächst durch einen dichroitischen Filter, einem Außendurchmesser von 6 hat bei 404 nm, um restliche Anregungslicht von spannenden Raman-Streuung innerhalb der nichtlinearen Medium zu verhindern weitergegeben. </li><li> Die Pumpe und Signal Strahlen werden dann sowohl durch eine achromatische Dublett (f = 35 mm) in einen 1 cm Schichtdicke Quarzküvette mit dem nichtlinearen Material konzentriert. Jede nichtlineare Material mit einem entsprechend hohen nichtlinearen Index (höher als CS 2), und entsprechend kurzen zeitlichen Reaktion (&lt;2 ps), können hier genutzt werden. Für diese Experimente verwenden wir Schwefelkohlenstoff, CS 2, dass eine nicht-lineare Index n 2 = 3,1 x 10 -18 m 2 / W. hat Das Licht wird dann durch eine zweite Dublett mit einer Brennweite identisch mit dem ersten rekollimierten. </li><li> Die Strahlen werden dann durchlaufen und Glan-Thompson-Analysator auf einer rotierenden Halterung, und dann durch eine Reihe von Absorption und Interferenz-Filter, die haben einen Außendurchmesser von 10 bei 808 nm kombiniert. </li><li> Schließlich ist das Signal Licht durch eine achromatische Dublett (f = 35 mm) in eine 50 um Multimode-Glasfaser, wo die Faser in eine Bühne, die Übersetzung in x, y und z können montiert ist fokussiert Die Faser wird dann zu einem kommerziellen Imaging-Spektrographen mit angeschlossener CCD-Kamera (SP2300i und Pixis 100B bzw. beide von Princeton Instruments, Trenton hergestellt, NJ) gekoppelt. </li><li> So richten Sie die Sammelstellen gesammelt Signal zu maximieren, wird der Analysator auf 0 ° und eine Probe von Toluol ist in der Probe Ebene platziert. Durch die Anpassung der x, y, und z steuert der Faser montieren, werden die gesammelten Raman-Signal optimiert. </li><li> Um eine ordnungsgemäße räumliche und zeitliche Überlappung der Pumpe und Signal Balken, ist ein Spiegel in der Probe des Mikroskops platziert. Die 404 nm-Filter aus dem System entfernt. Mit den Analysator um 90 ° gedreht das retroreflektierte 404 nm Strahl wird in den Spektrographen mit der Intensität so eingestellt, dass es nicht in die Sättigung der Kamera gesendet. Mit dem Pumpstrahl aus, wird der Analysator gedreht werden, um die übertragenen 404 nm Signal zu minimieren. Mit dem Pumpstrahl wieder eingeschaltet, wird die Verzögerung der Bühne langsam dran, bis die Übertragung der 404 nm-Licht beginnt zu steigen. Dann durch eine iterative Optimierung der Verzögerung der Bühne, die piezo-elektrische Spiegel, und die x-, y-und z-Kontrollen der Faser, maximiert man die Signal. </li><li> Da die retroreflektierten 404 nm Strahl und das Raman-Streulicht leicht unterschiedliche Wege durch das System zu übernehmen, werden letzte Anpassungen, indem eine starke Raman Streuer (wie Toluol) auf die Probe Bühne und die leicht Tweaking die Ausrichtung, indem Sie die gemacht Verzögerungsstufe, piezeo-elektrische Spiegel, und x, y, und z steuert der Faser zur Optimierung der Raman-Signal. </li></ol> 5. Sammlung ein einziges Mal-gated Raman-Spektrum erfordert Erwerb mehrerer Spektren für System-Artefakte zu korrigieren. <ol><li> Mit der Analysator auf 0 °, der Anregungsstrahl auf und der Pumpstrahl off gesetzt ist, wird ein &quot;unbeschrankten&quot; Spektrum aufgenommen, was das Spektrum, das ohne den Vorteil der Zeit-Gating-System erworben werden würde. </li><li> Mit der Analysator auf 90 °, der Anregungsstrahl und der Pumpstrahl noch aus, ist ein Hintergrund-Spektrum aufgenommen, die die Menge an Streulicht undicht durch die Polarisatoren und andere Elemente in das System. </li><li> Mit dem Analysator übrigen bei 90 °und alle Strahlen auf, die &quot;gated&quot; Spektrum aufgenommen, die die Raman-Streulicht durch die gekreuzten Polarisatoren durch die Anwesenheit der Pumpstrahl erlaubt. </li><li> Schließlich mit dem Analysator noch bei 90 °, der Anregungsstrahl ab und die Pumpe Strahl auf, wird ein zweiter Hintergrund Spektrum aufgenommen, was den Beitrag der &quot;gated&quot; Spektrum der Restmengen von 808 nm Licht in den Spektrographen. </li><li> Zusätzlich wird ein Spektrum mit allen Laser abgenommen, die Charakterisierung der Grundlinie &quot;dunkel&quot; Signalpegel der Kamera und Elektronik. </li><li> Da die Spektren erfordern oft langwierige Integration Zeiten ist es unerlässlich, diese Integration Zeit in mehrere Teile (Frames) zu brechen, um die richtige Korrektur der kosmischen Strahlung ermöglichen - ein häufiges Problem beim Erfassen von Daten über Spannweiten von mehreren Minuten. </li></ol> 6. Einmal erworben, sind mehrere Verarbeitungsschritte hilfreich, um die Qualität und das Erscheinungsbild der Daten zu verbessern. <ol><li> Zunächst werden alle Spektren dunkel durch Subtraktion von der &quot;dunklen&quot; Spektrum korrigiert. </li><li> Zur Korrektur der kosmischen Strahlung, die mehrere Frames darstellen eine Akquisition zu einander auf einer Pixel-by-Pixel-Basis verglichen. Für jedes Pixel eines Rahmens, der außerhalb von 2 mittlere Abweichungen vom Mittelwert für dieses Pixel in allen Frames fällt, ist, dass Pixelwerts durch den Medianwert über alle Frames ersetzt. </li><li> Die kosmische Strahlung korrigiert Frames werden dann gemittelt und geglättet durch eine Savitzky-Golay-Filter 1. </li><li> So extrahieren Sie die &quot;wahre&quot; gated-Spektrum, subtrahieren wir den &quot;Anregungs-only&quot; und &quot;Pumpe-only&quot;-Spektren aus den gemessenen gated-Spektrum. </li><li> Schließlich werden die gated und unbeschrankten Spektren dann Hintergrund durch Subtraktion eines 5-ter Ordnung polynomial, ermittelt nach der Methode von Lieber und Mahadevan-Jansen 2 behoben. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Schematische Darstellung des Kerr-Gating-System. Die Pumpe Strahlengang ist in rot dargestellt, während die SHG Weg in blau dargestellt ist. Der Pfad, Raman-und Fluoreszenz überlagert sind in grün dargestellt, während der Pfad, wo die Fluoreszenz wurde zeitlich hat herausgefiltert gelb dargestellt ist. Abkürzungen wie folgt: BPF, Bandpassfilter, CCD, Charge-Coupled Device; DCM, dichroitischen Spiegel, FI, Faraday-Isolator; λ / 2, Halbwelle Platte; LPF, lang-Pass-Filter, NLM, nichtlineare Medium; P, Polarisator ; SHG, second harmonic generation Kristall. <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2 oben:. Raw-Spektren von Cumarin in Immersionsöl aufgelöst. Rote Kurve zeigt das Spektrum mit dem Tor offen gehalten (Analysator für maximale Übertragungs-Set) aufgenommen. Schwarze Kurve zeigt das Spektrum mit dem Analysator für minimale Transmission und ein Pumpstrahl angewandt wird (gated-Spektrum) ausgerichtet genommen. Blaue Kurve zeigt den spectum mit dem Analysator für minimale Übertragung und keine Pumpstrahl angewendet ausgerichtet genommen (Tor geschlossen gehalten). Grüne Kurve zeigt das Spektrum nur mit der Pumpstrahl angewendet genommen. Gestrichelte Linien zeigen magenta Spektralbereich in der unten abgebildeten. Alle Spektren wurden mit einem 11-Punkte, 3. Ordnung Savitzky-Golay-Filter geglättet. Unten: Spektren von Cumarin in Immersionsöl nach Fluoreszenz Hintergrundsubtraktion aufgelöst. Rote Kurve ist das Spektrum mit dem Tor offen gehalten, und die blaue Kurve ist der gated-Spektrum. Die gated Spektrum zeigt deutlich die gewundenen hoher Wellenzahl peak Charakteristik Öle.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+automated+background+subtraction+from+Raman+spectra+containing+known+contaminants.">Method for automated background subtraction from Raman spectra containing known contaminants.</a> The Analyst. 134, 1198-1202 (2009).</li><li>De Luca, A. C., Mazilu, M., Riches, A., Herrington, C. S., Dholakia, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+fluorescence+suppression+in+modulated+Raman+spectroscopy.">Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 738-745 (2010).</li><li>Evans, C. 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Das Gebiet der biomedizinischen Raman-Spektroskopie hat zunehmendes Interesse in den letzten paar Jahren nicht mehr gesehen als Ergebnis seiner demonstriert Potenzial zur Lösung einigen schwierigen Herausforderungen in der biologischen Diagnostik. Zum Beispiel haben Raman-Spektren wurde gezeigt, dass diagnostische Wert in Krebsfrüherkennung 3, 4, 5, 6 haben. Raman-Spektroskopie hat auch in bakteriellen Quantifizierung 7, 8 und bakteriellen Wirkstoff Antwort 9 verwendet wurde. Es wurde ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Catalog Number </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Objektive </td><td> ThorLabs </td><td> Verschiedene </td><td> Alle Objektive mit einer maximalen Übertragungsrate Verluste von jeweils 1% haben </td></tr><tr><td> Tunable Ti: Sapph Laser </td><td> Kohärent </td><td> Chamäleon </td><td> 30 nJ, 200 fs, 80 MHz </td></tr><tr><td> 40X Ölimmersionsobjektiv </td><td> Olymp </td><td> UApo/340 </td><td> NA = 1,35 </td></tr><tr><td> Inversen Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> IX-71 </td><td> Modifiziert, um alle Objektive in seitlichen Anschluss entfernen </td></tr><tr><td> Halbwelle Platte </td><td> Thorlabs </td><td> AHWP05M-600 </td><td></td></tr><tr><td> Glan-Thompson-Polarisator </td><td> Thorlabs </td><td> GTH10M </td><td> ~ 10% Übertragungsverluste </td></tr><tr><td> Spektrometer </td><td> PI Acton </td><td> SP2300i </td><td></td></tr><tr><td> CCD </td><td> PI Acton </td><td> Pixis 100B </td><td></td></tr><tr><td> Mathematischen Software </td><td> The MathWorks </td><td> MATLAB </td><td> Version 2008a </td></tr><tr><td> Faraday-Isolator </td><td> EOT </td><td> BB8-5I </td><td></td></tr><tr><td> Piezo-elektrische Spiegel </td><td> Newport </td><td> AG-M100 </td><td></td></tr><tr><td> BBO-Kristall </td><td> CASIX </td><td> Brauch </td><td> 1 mm Dicke </td></tr><tr><td> Bandpass-Filter 1 </td><td> Andover </td><td> 008FC14 </td><td> 808 ± 0,4 nm </td></tr><tr><td> Dichroitischen Spiegel </td><td> Semrock </td><td> FF662-FDI01 </td><td> Bandkante bei 662 nm </td></tr><tr><td> Long-Pass-Filter </td><td> Semrock </td><td> BLP01-405R </td><td> Bandkante bei 417 nm </td></tr><tr><td> Bandpass-Filter 2 </td><td> Semrock </td><td> FF02-447/60 </td><td> 417-447 nm </td></tr><tr><td> CS 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 335266 </td><td> 99% Reinheit </td></tr><tr><td> Cumarin 30 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 546127 </td><td> 99% Reinheit </td></tr><tr><td> Immersionsöl </td><td> Cargille </td><td> 16242 </td><td> Typ DF </td></tr></tbody></table>

rejection of fluorescence background in resonance and spontaneous raman microspectroscopy

Raman-Spektroskopie wird häufig durch eine starke Fluoreszenz-Hintergrund geplagt, vor allem für biologische Proben. Wird eine Probe mit einem Zug der ultraschnellen Impulsen, ein System, das zeitlich trennen kann spektral überlappende Signale auf einer Pikosekunden-Zeitskala isolieren können gespannt ist prompt angekommen Raman-Streulicht aus späten Ankunft Fluoreszenzlicht. Hier besprechen wir den Bau und Betrieb einer komplexen nichtlinearen optischen System, das all-optische Schaltelemente verwendet in der Form eines Low-Power-optischen Kerr Tor zum Raman-und Fluoreszenz-Signale zu isolieren. Ein einziger 808 nm-Laser mit 2,4 W Durchschnittsleistung und 80 MHz Wiederholrate ist gespalten, mit ca. 200 mW von 808 nm Licht, das auf &lt;5 mW von 404 nm Licht geschickt, um die Probe zu Raman-Streuung zu erregen umgewandelt. Die restlichen nicht umgesetzten 808 nm Licht wird dann zu einem nichtlinearen Medium, wo es als die Pumpe für die all-optischen Shutter geschickt. Der Verschluss öffnet und schließt in 800 fs mit einem maximalen Wirkungsgrad von etwa 5%. Mit diesem System sind wir in der Lage, erfolgreich getrennt Raman-und Fluoreszenz-Signale bei einer 80 MHz Wiederholrate mit Pulsenergien und mittleren Leistungen, die biologisch unbedenklich bleiben. Da das System keine freien Kapazitäten in Bezug auf die optische Leistung hat, haben wir ausführlich mehrere Design und Ausrichtung Überlegungen, die Hilfe bei der Maximierung des Durchsatzes der Anlage. Wir diskutieren auch unser Protokoll für den Erhalt der räumlichen und zeitlichen Überlappung der Signal-und Pumpstrahlen innerhalb der Kerr-Medium, sowie ein ausführliches Protokoll für Spektrenerfassung. Schließlich berichten wir einige repräsentative Ergebnisse der Raman-Spektren in Gegenwart von starken Fluoreszenz mit unserer Zeit-Gating-System erhalten.

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Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Wir diskutieren den Bau und Betrieb einer komplexen nichtlinearen optischen System, das ultraschnelle all-optische Schaltelemente verwendet zu isolieren Raman von Fluoreszenz-Signalen. Mit diesem System sind wir in der Lage, erfolgreich getrennt Raman-und Fluoreszenz-Signale nutzen Pulsenergien und mittleren Leistungen, die biologisch unbedenklich bleiben.

Ablehnung des Fluorescence Resonance Hintergrund in und Spontane Raman Mikrospektroskopie

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

rejection-fluorescence-background-resonance-spontaneous-raman

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K Aufrufe.  University of California, Davis. Wir diskutieren den Bau und Betrieb einer komplexen nichtlinearen optischen System, das ultraschnelle all-optische Schaltelemente verwendet zu isolieren Raman von Fluoreszenz-Signalen. Mit diesem System sind wir in der Lage, erfolgreich getrennt Raman-und Fluoreszenz-Signale nutzen Pulsenergien und mittleren Leistungen, die biologisch unbedenklich bleiben.

Serie: Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Fluorescence Lifetime Imaging für molekulare Rotoren in lebenden Zellen

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Forschung

Biotechnik

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

Lumineszenz-Resonanzenergietransfer zu Konformationsänderungen in Membranproteinen in Säugerzellen exprimiert Studieren

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, 4-dimensionale Bilder über die Auswirkungen der modulierende Schubspannung auf entwickelnden Zebrafisches Herzen erfassen

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

Spontane Bildung und Neuordnung der künstlichen Lipid Nanotube Netze als Bottom-Up-Modell für endoplasmatische Retikulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

Echtzeit-, zweifarbige stimulierte Raman-Streubildgebung des Mausgehirns für die Gewebediagnose

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...