Diese Studien wurden finanziert, zum Teil von der Kinderklinik Boston Urologie Endowment Fund Umsatz und den National Institutes of Health Zuschüsse NIBIB P41-EB002520 (Kaplan); NIDDK T32-DK60442 (Freeman); NIDDK 1K99-DK083616 (Mauney). Wir danken Dr. Peter Zvara von der University of Vermont um Unterstützung bei der Gründung der Technik für Zystostomieröhrchen Platzierung und Zystometrie.

Chirurgische Verfahren 1. Chirurgische Vorbereitung und Anästhesie <ol><li> Stellen Sie die sterilen OP-Bereich mit den notwendigen chirurgischen Instrumente: Rasieren Scheren, Pinzetten mit Zähnen, feine atraumatische Pinzetten, feinen Nadel Fahrer, Gaze, Metzenbaum Schere, Tenotomie Schere, Skalpell, 30-Gauge-Injektionsnadel, gefüllt Kochsalzlösung 1 ml-Spritze, vier 6-0 Polypropylen Nahtmaterial, 7-0 Polyglactin Naht, 4-0 Polyglactin Naht. </li><li> Betäuben das Tier mit Isofluran beim Einatmen in der Ansaugkammer. Bestätigen Sie vollständige Induktion des Tieres vor der Übertragung auf das OP-Feld. Sicherstellen, dass die Inhalationsnarkose Rohr in geeignete Position, um kontinuierliche Narkose haben ist. </li><li> Platzieren Sie das Tier in Rückenlage auf dem sterilen Tuch. [Für zystometrischen Analyse siehe Abschnitt unten im Tunnelbau die Zystostomie Katheter.] </li><li> Verwenden Sie die Rasur Schere, um das Fell aus dem Unterbauch entfernen. </li><li> Prep mit der Bauch seinTadine und 70% Ethanol. </li><li> Vor Einschnitt, einem Analgetikum, wie Buprenorphin (0,05-0,1 mg / kg) subkutan für perioperative Schmerzen Kontrolle injiziert werden. </li></ol> 2. Inzision und Freilegung der Blase <ol><li> Machen Sie eine 1-2 cm (je nach Größe des Tieres und ob Ratte oder Maus) untere Medianschnitt mit dem Skalpell durch die Haut. Vertiefen Sie den Einschnitt am unteren Teil des Schnittes durch den M. rectus kümmert sich nicht um die zugrunde liegende Darm oder Blase zu verletzen. </li><li> Mit Hakenpinzette, heben das Rektusmuskel sezieren und kostenlos die hintere Fläche des Muskels mit feinen Metzenbaum-Schere. </li><li> Inzision der Rest der Muskel in der Mittellinie für die gesamte Dauer Ihres Hautschnitt. </li><li> Geben Sie sich die Blase durch die Narben-Wunde (Abbildung 1). Die Blase ist in der Regel die meisten abhängigen Organ im Becken. (Beim Mann ist die Prostata eigentlich mehr abhängig und ist größer als diedekomprimiert Blase.) </li><li> Legen Sie eine Standnaht durch die hintere Wand der Blase, und dann noch durch die vordere Wand der Blase mit 6-0 Polypropylen Nahtmaterial. Setzen Sie zusätzliche Nähte seitlich. Binden Sie diese Nähte. Wenn die Fäden straff gehalten werden, wird die Blase haben eine quadratische Form mit Abmessungen von ungefähr 1 cm 2 (Abbildung 2). Seien Sie vorsichtig, nicht zu viel Spannung auf diesen Nähte haben, da sie leicht durch die Blase Gewebe gezogen werden. </li><li> Inzision der Blase in Längsrichtung durch die vordere Blasenwand (unmittelbar unterhalb der Kuppel der Blase) in der Mittellinie etwa 1 cm (1,5-2 cm in der Ratte Blase). </li></ol> 3. Anastomose der Scaffold <ol><li> Mit einer feinen Schere, schneiden Sie die Seide Gerüst auf die ungefähren Bereich der Blase Defekt. </li><li> Mit 7-0 Polyglactin Naht, die an einer Ecke des Gerüsts zu starten und zu nähen, um die Blase in einer kontinuierlichen, ausgeführtMode zu schaffen eine wasserdichte Abdichtung den ganzen Weg um den Defekt (Abbildung 3). </li><li> Testen der Integrität der Anastomose durch Füllen der Blase mit steriler Kochsalzlösung durch Einträufeln durch die Wand der Blase mit einer 30-Gauge Kanüle. Wenn ein Leck gefunden wird, kann dies mit einer zusätzlichen Naht unterbrochen 7-0 Polyglactin, um die Lücke zu schließen, geschlossen werden. </li><li> Reduzieren Sie die rekonstruierten Blase zurück in den Bauch. </li></ol> 4. Incisional Closure <ol><li> Vor der Schließung der Bauchwand, spritzen sie den M. rectus und des subkutanen Gewebes mit Bupivacain zur Lokalanästhesie (&lt;3 mg / kg von 0,25%). </li><li> Reapproximate der M. rectus mit einem kontinuierlichen, Laufen 4-0 Polyglactin Naht. </li><li> Schließen Sie die Haut mit einem kontinuierlichen, Laufen 4-0 Polyglactin Naht. </li><li> Reinigen und trocknen Sie den Schnitt (Abbildung 4). </li><li> Übertragen Sie das Tier in einen warmen, sauberen Käfig für das Erwachen aus der Narkose. </li></ol&gt; Die Schritte zum Zystostomie Platzierung des Katheters für zystometrischen Analyse sind wie folgt: 5. Untertunnelung der Zystostomie Katheter <ol><li> Stellen Sie die sterilen OP-Bereich mit den notwendigen chirurgischen Instrumente: Rasieren Scheren, Pinzetten mit Zähnen, feine atraumatische Pinzetten, feinen Nadel Fahrer, Gaze, Metzenbaum Schere, Schere Tenotomie, kleine gebogene Klemme, Skalpell, 6-0 Polypropylen, 4-0 Polyglactin Nahtmaterial, 3-0 Seidenfaden (4-0 Seidenfaden für Mäuse), 18G Nadel, 22G Nadel mit stumpfer Spitze, 25G Nadel, 1 ml Kochsalzlösung gefüllte Spritze, Polyethylen-Schlauch 50 (PE-50) schwenken, um eine Länge von ~ 10 cm. </li><li> Flare das Ende des PE-50-Schlauch durch leichtes Aussetzen einer Flamme. Achten Sie darauf, um das Ende abzuschmelzen oder zu verschließen, die das Lumen (dies kann durch Injektion von Kochsalzlösung durch eine 25G-Nadel mit dem &quot;nicht-aufgeweiteten&quot; Ende und die Gewährleistung Durchfluss überprüft werden). Dies dient als Anker, um das Rohr innerhalb der Blase (5) zu halten. </li><li&gt; Anesthetize das Tier, wie oben in Schritt 1.2. </li><li> Verwenden Sie die Rasur Schere, um das Fell sowohl aus dem Rücken des Tieres zwischen den Schulterblättern und den unteren Bauch auf der Ventralfläche zu entfernen. </li><li> Prep die Bereiche mit Betadin und 70% Ethanol. Platzieren Sie das Tier in Bauchlage auf dem Tuch. </li><li> Machen Sie einen Schnitt 1 cm auf dem Rücken zwischen den Schulterblättern. Mit dem Metzenbaum-Schere, entwickeln eine Ebene zwischen der Haut und der darunter liegenden Muskeln, indem man die Spitzen der Schere in der Ebene und breitet sie einen Tunnel rund um den ventralen Bauch zu schaffen. </li><li> Positionieren Sie das Tier in Rückenlage. Machen Sie Ihren Bauchschnitt und entlarven die Blase, wie oben in Schritten von 2,1 bis 2,4. Reduzieren Sie die Blase zurück in den Bauch. </li><li> Geben Sie eine kleine Klammer in Ihre subkutanen Tunnel in Schritt 5,6 ab Ihrem dorsalen Hautschnitt angelegt. Benutzen Sie Ihre Finger, um die intra-abdominale Inhalte, Pierce durch die Bauchdecke mit den Spitzen der Klammer in den Bauch zu schützen. </li><li> Fassen Sie die smooth Ende des PE-50-Schlauch mit der Klemme und ziehen es durch die Dorsalschnitt. Sicherstellen, dass die bulbed Ende nicht an der Bauchwand (6) gezogen wird. </li></ol> 6. Platzieren des Zystostomieröhrchen <ol><li> Geben Sie sich die Blase durch den Schnitt. Von diesem Punkt sollte die Blase mit einer feinen Pinzette behandelt werden, um Verletzungen der Blase, die Beschädigung oder Entzündung verursachen könnte, die verhindern kann zur Folge haben Ihre Ergebnisse zystometrischen bzw. mit zusätzlichen Unannehmlichkeiten für den tierischen nach der Operation. </li><li> Notieren Sie sich die vorgeschlagene Standort für die Zystostomieröhrchen. Es sei an der Kuppel der Blase (überlegen zu der Augmentation Segment) abgegeben werden. Dadurch wird verhindert, Knicken oder Okklusion des Rohres. </li><li> Mit dem 6-0 Polypropylen Nahtmaterial, platzieren Sie einen Tabaksbeutelnähte Stich an der Kuppel der Blase in der folgenden Weise: statt den ersten Wurf durch die Wand der Blase längs, quer zu dem vorgeschlagenen Standort für die Zystostomieröhrchen. Lassen Sie eine kleine Klammer am losen Ende, so dass die Naht nicht versehentlich herausgezogen den ganzen Weg durch. Legen Sie die nächste Wurf in einer Querrichtung, beginnend gehen zuerst in die Blasenwand leicht lateral der Ausfahrt von Ihrem ersten Wurf. </li><li> Ziehen Sie nicht die Naht stramm. Zeigen Sie mit der nächsten Naht parallel zu Ihrem ersten (längs) gehen in die Blase, nur um der Austrittsstelle des letzten, queren Naht kranial. Der vierte Wurf beginnt lateral der Ausgang der letzten Masche und am Ende neben dem Eingang für Ihren ersten Wurf. Bei korrekter Ausführung bildet dieser eine umlaufende Quadrat um den vorgeschlagenen Standort Katheter (Abbildung 7). </li><li> Verwendung einer 18G Nadel, die Blasenwand durchbohren in der Mitte des Tabaksbeutelnaht. Seien Sie vorsichtig, nicht zu tief zu durchdringen (gerade genug, um sein intraluminale). Legen Sie die Spitzen der feinen Pinzette in die Öffnung und sanft verteilen, um das Loch zu erweitern. </li><li> Legen Sie die bulbed Ende des Katheters in den Defekt in derBlase, bis es intraluminalen. Ziehen Sie die Tabaksbeutelnaht fest um den Katheter und binden Sie es nach unten. Dies sollte Cinch die Blasenwand um den Katheter halten es an Ort und Stelle (Abbildung 8). </li><li> Nehmen Sie ein Ende des Fadens und wickeln Sie es um den Katheter wieder und binden diese bis auf weiteres sichern den Katheter. </li></ol> 7. Testen Sie den Katheter und Schließen der Bauchwunde <ol><li> Mit einer 1 ml Spritze und Nadel 25G, führen Sie die Nadel in den Schlauch und langsam injizieren Kochsalzlösung, um die Blase zu dehnen. Beachten Sie für undichte um den Katheter. Sobald Sie aus der Harnröhre austritt sehen, absaugen Kochsalzlösung, um die Blase wieder zu entpacken. </li><li> Schließen Sie den Bauchschnitt wie oben in Schritten von 4,1 bis 4,4. </li></ol> 8. Das Schließen der dorsale Inzision und Befestigen des Katheters (für Ratten) <ol><li> Positionieren Sie das Tier anfällig. </li><li> Schneiden Sie die Katheter-Schläuche auf der Ebene der Haut mit der Schere. Setzen Sie einen stumpfen 22G tip Nadel in den Schlauch. </li><li> Schließen die Haut über dem Schlauch mit 4-0 Polyglactin in einer Weise ausgeführt. Lassen Sie die Nadelnabe Extrudieren von der Haut. </li><li> Platzieren Sie eine intravenöse Leitung Kappe auf dem stumpfen Nadel. Mit 3-0 Seidenfaden, sichern Sie die Katheterspitze an der Haut (Abbildung 9). </li><li> Reinigen Sie den Einschnitt. Übertragen Sie die Ratte in einen warmen, sauberen Käfig für das Erwachen aus der Narkose. </li></ol> 8. * Schließen der dorsale Inzision und Befestigen des Katheters (Für Mäuse oder Ratten) <ol><li> * Verschließen die distalen Ende des Katheters durch Knicken oder es mit einer Flamme, um das Ende zu schmelzen. </li><li> * Wickeln Sie das Ende des Schlauches und lassen Sie ihn in der subkutanen Tasche auf dem Rücken des Tieres (nicht abschneiden Schlauch um ihn zu kürzen) (Abbildung 10). </li><li> * Schließen Sie die Haut über den Schlauch mit 4-0 Polyglactin in einem laufenden Mode (Abbildung 11). </li><li> * Am Tag der Zystometrie, bereiten Sie die dorsale Inzision mit Betadine und 70% Ethanol. Öffnen Sie die dorsale Inzision unter Narkose und entfernen Sie die Coiled Tubing aus dem subkutanen Beutel. Schließen Sie den Einschnitt. Wecken Sie das Tier aus der Narkose und führen Zystometrie, wenn es ganz wach ist. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse - Chirurgische Verfahren Das rekonstruierte Blase sollte so wasserdicht wie möglich zu Komplikationen im Zusammenhang mit einer signifikanten Urin Leck (3) zu vermeiden. Schmerzen oder Beschwerden in der Regel manifestieren sich als Zittern oder Kratzen und Nagen an der Bauchschnitt. Dies kann mit tägliche subkutane Injektionen von einem nicht-steroidalen entzündungshemmenden wie Meloxicam (0,5-1,0 mg / kg subkutan) verwaltet werden. Typischerweise werden die Tiere nur mit den Injektionen für die ersten 3 Tage nach der Operation. Dies kann mit einem Opioid, wie Buprenorphin (0,05-0,1 mg / kg subkutane alle 8-12 Stunden), wie Bedarf ergänzt werden. Die Tiere sollten 3-mal täglich überwacht werden für die ersten 3 Tage nach der Operation, TWEis täglich zur postoperativen Tagen 3-5 und dann danach täglich bis zum Schmerz, Anzeichen einer Infektion, adäquate Wundheilung, Aktivität, Pflegen und Hautturgor bewerten. Antibiotika (Baytril, 5mg/kg subkutan alle 24 Stunden in einem Volumen von nicht mehr als 0,1 ml) werden für die ersten 72 Stunden nach der Operation gegeben, wie chirurgische Prophylaxe gegen Infektionen. Zeichen der Erholung sind normal normale Gehfähigkeit und Aktivität, geeignete Fress-und Trinkverhalten, das Fehlen von Schmerzen oder Leiden (keine Vokalisation) und normale Sozialisation mit cagemates. Eine Erholungszeit von mindestens 5-7 Tage sollten vor zystometrischen Analyse gegeben werden, um Heilung zu ermöglichen und Blase verringert Entzündung, die möglichen Auswirkungen auf die Ergebnisse. Zystometrische Analysen 10. Awake Zystometrische Analyse <ol><li> Setup mit MLT844 ADInstruments mit Datenerfassung und-auswertung mit LabChart v6 (ADInstruments) und Infusion mit einer 22 Harvard Spritzenpumpe (Harvard Appara beschriebentus, Holliston, MA), obwohl auch andere vergleichbare Systeme verfügbar sind (Abbildung 12). </li><li> Kalibrieren sowohl Volumen und Druck auf der Grundlage der Spezifikationen des zystometrischen verwendet. </li><li> Legen Sie die Tiere in metabolischen Käfigen (Käfige mit einem Drahtgeflecht Stock), die sich über einer Skala suspendiert sind. Die Waage ist mit einem Wandler verbunden. </li><li> Spülen Sie das System von Luftblasen und sorgen für kontinuierlichen Fluss von der Infusionspumpe. </li><li> Verbinden Sie den Daten-Capture-System an einen Computer und beobachten, für die Daten-Aufzeichnungen. Passen Sie die Skalierung entsprechend. Blasendruck und Urinvolumen wird kontinuierlich aufgezeichnet werden. </li><li> Zugriff auf die suprapubische Katheter mit einer 27G-Nadel über ein T-Rohr mit dem Druckwandler und der Infusionspumpe. Beginnen Sie die Infusion von physiologischer Kochsalzlösung bei 12,5 ul / min für die Maus und 100 &amp;mgr; l / min für die Ratte. </li><li> Lassen Sie das Muster für ungültig erklären Tracing zu stabilisieren (Blase Druckanstieg, gefolgt von einer Leere). Dies dauert in der Regel Angleirund 10-20 Minuten. Notieren Sie die Miktionszyklen für 45-120 Minuten oder mindestens 3-4 Zyklen Blasenentleerung. </li><li> Beachten gesamte Verfahren in Echtzeit, um Komplikationen, die zu Artefakten (zB Katheter Knicken, Verstopfung, usw.; siehe unten diskutiert) führen wird, zu beheben. </li><li> Stoppen Sie die Infusion, ziehen Sie den Katheter aus dem System, und senden Sie das Tier in seinen Käfig. </li></ol> 11. Unbewusste Zystometrische Analysis (Kein suprapubischen Katheter) <ol><li> Anesthetize das Tier mit Urethan (1-2 g / kg) intraperitoneal (ip) Injektion. </li><li> Setzen Sie die Blase, wie oben in Schritten von 1,3 bis 2,4. </li><li> Kalibrieren des Systems, wie in Schritt 9.2. Bereiten Sie das System wie in Schritt 9,4 bis 9,5. </li><li> Legen Sie eine 27G-Nadel über ein T-Rohr mit dem Druckaufnehmer und Infusionspumpe in der lateralen Seite der Blase verbunden. </li><li> Notieren Sie die Miktionszyklen für 45-90 Minuten. </li><li> Stoppen Sie die Infusion, entfernen Sie die Nadel aus der Blase und das Tier einschläfern. &lt;/ Li&gt; </ol> 12. Repräsentative Ergebnisse - Zystometrische Analysen Urodynamische Kurven können dann analysiert, um daraus Parameter wie nichtig Bände, Compliance, Peak Entleerungsdruck unter Kontraktion Intervall, Miktion Zykluszeit und Post nichtig Restvolumen werden. Cystometrogram kann in einer Füllung und einer Entleerung Phase unterteilt werden. Ein normaler Befüllung Phase ist der Teil des Miktionszyklus in dem Blase füllt mit sehr geringer Änderung des intravesikalen Druck. Eine normale Entleerung Phase der Verfolgung besteht aus einem stetigen Anstieg der intravesikale Druck entsprechend dem Detrusorkontraktion. Der höchste Druck während der Phase der Entleerung Tracing erreicht den Gipfel Entleerung Druck bezeichnet. Ein hoher Spitzenleistung Entleerung Druck könnte vermuten lassen, eine obstruktive Miktion Muster, ein hypercontractile Blase oder ein Knick in der SP-Katheter. Die Einhaltung kann durch den Erwerb des Verhältnis des Volumens instillierte Duri berechnet werdenng der Füllphase und die Veränderung des Drucks (Compliance = AV / AP). Ein hypocompliant Blase ist eine, die nicht in der Lage, angemessene Mengen Urin bei niedrigen Drücken unterzubringen ist. Die intercontraction Intervall kann durch Analysieren der Zeit zwischen zwei Kontraktionen auf der cystometrogram gesehen berechnet werden. Ein kurzes Intervall intercontraction deutet auf eine Reizblase. Die Miktion Zykluszeit bezieht sich auf die Zeit, die für eine gesamte Befüllung und Entleerung Phase zu vollenden und kann leicht ermittelt durch die Analyse der Ablaufverfolgung. Am Ende des Zystometrie, kann nach Blasenentleerung Rest (PVR) erhalten werden. Dies wird durch Ansaugen des Suprapubische nach dem Abschluss einer Detrusorkontraktion durchgeführt. Diese Parameter helfen der Prüfer objektiv untersuchen die Blase Dynamik als die Blase füllt und leert. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig1.jpg" /> Abbildung 1. Foto des Bauchschnittund Extrusion der Blase. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig2.jpg" /> Abbildung 2. Blasen-Schnitt mit der Exposition der Blase Lumen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig3.jpg" /> Abbildung 3. Integration des Implantats in die Blasenwand. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig4.jpg" /> Abbildung 4. Foto des geschlossenen Schnitt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig5.jpg" /> Bild 5. Aufgeweitete Ende des PE-50-Schlauch. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig6.jpg" /> 6. PE-50-Schlauch (Katheter) durch die Dorsalschnitt. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig7.jpg" /> Abbildung 7.Tabaksbeutelnaht. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig8.jpg" /> 8. Befestigen des Katheters in die Blase. <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig9.jpg" /> Abbildung 9. Secured Katheteransatz. <img alt="Abbildung 10" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig10.jpg" /> Abbildung 10. Coiled-Schlauch in subkutane Tasche. <img alt="Abbildung 11" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig11.jpg" /> Abbildung 11. Dorsal incisional Schließung. <img alt="Abbildung 12" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig12.jpg" /> Abbildung 12. Beispiel zystometrischen Set-up. <img alt="Abbildung 13" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig13.jpg" /> Abbildung 13. Vertreter Zystometrie Tracing.

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E., Talo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+rhabdosphincter+in+female+rat+voiding.">The role of the rhabdosphincter in female rat voiding.</a> BJU Int. 94, 138-142 (2004).</li><li>Malmgren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystometrical+evaluation+of+bladder+instability+in+rats+with+infravesical+outflow+obstruction.">Cystometrical evaluation of bladder instability in rats with infravesical outflow obstruction.</a> J. Urol. 137, 1291-1294 (1987).</li><li>Smith, P. P., Kuchel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+uroflow+cystometry+in+the+urethane-anesthetized+mouse.">Continuous uroflow cystometry in the urethane-anesthetized mouse.</a> Neurourol. Urodyn. 29, 1344-1349 (2010).</li><li>Cannon, T. W., Damaser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+anesthesia+on+cystometry+and+leak+point+pressure+of+the+female+rat.">Effects of anesthesia on cystometry and leak point pressure of the female rat.</a> Life Sci. 69, 1193-1202 (2001).</li><li>Smith, P. P., Hurtado, E., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cystometric+methods+in+female+rats.">Comparison of cystometric methods in female rats.</a> Neurourol. Urodyn. 27, 324-329 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Zystometrische Auswertungen von Biomaterial-Konfigurationen nach der Implantation und Augmentation Blase in kleinen Tiermodellen stellt einen wichtigen Schritt bei der Identifizierung Validierung optimalen strukturellen und mechanischen Eigenschaften der Matrix-Designs für den Einsatz in klinischen Situationen. In dieser Studie beschreiben wir chirurgische Verfahren für die Durchführung Blasenaugmentation bei Mäusen und Ratten sowie zystometrischen Techniken zur urodynamischen Eigenschaften von technischen Organe für funktionelle Beurteilungen zu bestimmen. Wir haben diese Techniken in mehreren Experimenten mit Mäusen und auch Ratten verwendet, wobei jedes Experiment, bestehend aus 30 + Nagetiere ohne nennenswerte Probleme. Unsere Forschungs-Labor ist ein Konglomerat von verschiedenen Grundlagenforscher und Ärzte Chirurgen und Chirurgen mit mindestens 5-6 Jahren von Post-Graduate-chirurgische Ausbildung erfolgen die verfahrensrechtlichen Aspekte dieser Experimente. Unabhängig von der Art der Biomaterial, das wichtigste difference zwischen Vermehrung der Blase bei Ratten im Vergleich zu Mäusen ist die Größe der Blase. Aufgrund der kleineren Größe Blase, eine Präparation und Eingliederung des Biomaterials mehr technisch schwierig in der Maus. Um die Visualisierung zu unterstützen, kann ein chirurgisches Mikroskop verwendet werden. Da die Größe der Blase bei Ratten größer ist, ist es daher einfacher, wenn mehr als eine Prozedur muss auf die Blase (zB Verstärkung und die Platzierung der Zystostomie Katheter) durchgeführt werden. Zusätzlich kann die Protokoll oberhalb beschreibt die Verwendung von PE-50-Schlauch für die Ratten-13, jedoch auch größere Katheter, bis PE-100 wurden verwendet, insbesondere für Langzeitstudien 14. Bei Mäusen, kann ein kleineres Kaliber wie PE-10-Schlauch 15,16 verwendet werden, aber es sollte beachtet werden, dass kleinere, biegsamer Röhrchen es nicht gestattet, Druckänderungen an den Wandler genau. Auch die alternative Methode zur Sicherung des Katheters auf dem Rücken (Schritt 8 * oben) wird in mi getanCE aufgrund ihrer geringeren Körpergröße und der stumpfen Spitze Nadel und Kappe IV sind zu schwerfällig. Der Nachteil dieser Methode ist die Notwendigkeit für die Anästhesie, um das Ende des Katheters in dem subkutanen Beutel vor Zystometrie extrahieren. Studien haben gezeigt, dass in den ersten ersten Tagen (0-4 Tage) nach der Platzierung der Katheter, Blase Zystometrie hohe Drücke und Überaktivität zeigte mit niedrigen Volumina Blasenentleerung. Diese Befunde erschien in der sechsten bis siebten Tag 14,17 stabilisieren und daher wahrscheinlich die optimalen Zeitpunkt zystometrischen Evaluierung. Allerdings führen die meisten Berichte in der Literatur Zystometrie innerhalb der ersten 3 Tagen nach der Katheterisierung 18, und das erklärt die großen Unterschiede in den oben genannten Parametern in Bezug auf Zeit. Verlassen des suprapubischen Katheter für eine Dauer länger als 3 Tage mit sich bringt wie das Risiko von Steinen, Umsiedlungen, Infektion, Hämaturie und Okklusion des Katheters mit Schutt Begleiterkrankungen. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Verschiedene Infusionsraten während Zystometrie haben aus 1-3mL/hr wurde für Mäuse und 15,16 10-11mL/hr für Ratten 13,19,20 beschrieben. Supraphysiologischen Infusionsraten kann zu falsch erhöhten Drucks 14. Wir verwenden eine Infusionsgeschwindigkeit von 12,5 ul / min (0,75 ml / h) für Mäuse und 100 &amp;mgr; l / min (6 ml / h) für Ratten in unserem Setup, aber niedrigere Sätze können ebenfalls verwendet werden. Die Temperatur der physiologischen Kochsalzlösung mindestens Raumtemperatur, obwohl warm (37 °) Kochsalzlösung ist optimal, um Blasenüberaktivität mit Einträufeln kalte Lösung hervorgerufen vermeiden. In Zystometrie wach, ist es entscheidend, für die Stabilisierung der für ungültig erklären lassen Muster wie das Tier wird angepasst, um den Käfig, die nach unserer Erfahrung erfordert einen Zeitraum von ~ 10-20 Minuten. Im Anschluss daran können regelmäßig Miktionszyklen für 45-120 Minuten oder bei mindestens 3-4 Entleerung Zyklen aufgezeichnet werden. Das Tier muss in Echtzeit überwacht werden, da das Tier frei moving und Komplikationen wie Verdrehen oder Knicken des Katheters kann verändern zystometrischen Analyse. Die Begrenzung Umgebungslärm während Zystometrie gewünscht wird, Tier-Bewegung und die anschließende Artefakte zu verringern. Unbewusste Zystometrie nicht über die damit verbundenen Probleme wie wach Zystometrie, sondern mehrere Anästhetika haben gezeigt, dass spontane Kontraktionen der Blase zu verhindern. Diese Hemmung entspricht direkt der voraussichtlichen Dauer der Wirkung der Anästhetika, dh wenn die betäubende Wirkung nachlässt, spontane Kontraktionen 14 wieder aufzunehmen. Darüber hinaus waren Drücke gemessen, wenn die Blase übergelaufen, statistisch größer an narkotisierten Ratten, die beide am Leben und post mortem, was auf einen Effekt auf die passiven Eigenschaften Einhaltung der Blasenwand. Dieser Effekt wird mit Pentobarbital 21, Ketamin gesehen, und Chloralose IM / IP, zusätzlich zu inhalativen Halothan und intrathekale nesacaine 14. Eine weitergehende Untersuchung verschiedener Anästhetika Bestätigungm dieser Befund mit Unterdrückung des Miktionsreflexes sowohl für inhalative (Isofluran und Methoxyfluran) und Barbiturat (Pentobarbital und thiobutabarbital) Anästhetika unter moderatem Niveau Anästhesie 17. Dieser Effekt wurde auch mit Licht-oder Beruhigungsmittel Ebenen der Narkose mit Medikamenten wie Fentanyl-Droperidol und Ketamin-Diazepam beobachtet, und wie in der vorherigen Studie, als die Narkose nachließ Wirkung, so auch die Hemmung 17. Für dieses Verfahren können Urethan intraperitoneale Injektionen verwendet werden, da nachgewiesen wurde, dass Reflex Miktion erhalten bleibt während gleichzeitig eine adäquate Anästhesie 17,22 werden. Außerdem wird kein Effekt hinsichtlich der Miktion Druck 23 beobachtet. Suprapubische Platzierung des Katheters für Zystometrie wird hier beschrieben, da Intraurethral Katheterisierung gezeigt wurde, dass höhere Blasendruck Kurven und niedrigeren Strömungsgeschwindigkeiten im Einklang mit relativ Blasenauslassobstruktion 24 aufweisen.Darüber hinaus ist intraurethrale Katheterisierung nur möglich in narkotisierten Tieren, und selbst dann, Katheterisierung kann schwierig sein, vor allem bei männlichen Nagetieren und Mäuse. Im Ergebnis ist die Wahl, für welches Modell für Blasenaugmentation und / oder zystometrischen Analyse verwenden abhängig von den Zielen des spezifischen Studie. Aus technischer Sicht das Rattenmodell klar hält den Vorteil, für den oben erörterten Gründen. Jedoch kann die Maus wurde in Studien, die die Funktion bestimmter Gen kodierten Endprodukte bei Erkrankungen der Harnwege, die aufgrund ihrer Empfindlichkeit für die genetische Manipulation verwendet werden. Dies ist im Allgemeinen nicht möglich bei der Ratte. Awake Zystometrie am genauesten imitiert die normalen physiologischen Zustand, in dem diese Tiere zu unterziehen ihre Miktionszyklen, und so dürfte sich eine zuverlässigere physiologische Bestimmung der Funktion der Blase geben. Darüber hinaus ist die verwirrende Variable der direkte Wirkung einernesthetics auf die Blasenfunktion wird vermieden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materialien: </td><td> Beschreibung / Verwendung: </td></tr><tr><td> Rasieren Scheren </td><td> Herstellung von Ratte / Maus für die Chirurgie </td></tr><tr><td> Sterilen Tüchern, Betadin, 70% Ethanol, steriler Gaze </td><td> Herstellung von sterilen OP-Feld </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Instrumente: </td></tr><tr><td> Skalpellklinge </td><td> Hautschnitt </td></tr><tr><td> Pinzetten mit Zähnen </td><td> Bearbeiten von Haut </td></tr><tr><td> Feinen Pinzette </td><td> Atraumatische (keine Zähne), keine Zacken oder mit feinen Zacken zu manipulieren </td></tr><tr><td> Kleine Nadeltrieb </td><td> Sharp Gewebedissektion </td></tr><tr><td> Metzenbaum-Schere </td><td> Bldder Einschnitt </td></tr><tr><td> Tenotomie Schere </td><td> Für Retraktion Nahtmaterial und zur subkutanen t entwickelnunnel (Zystostomie Katheter) </td></tr><tr><td> Kleine gebogene Klemmen </td><td> Subkutanen Tunnel (Zystostomie Katheter) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Nahtmaterial: </td></tr><tr><td> 6-0 Polypropylen Nahtmaterial </td><td> Blase Haltefäden und Tabaksbeutelnaht </td></tr><tr><td> 7-0 Polyglactin Naht </td><td> Anastomose von Gerüst zu Blase </td></tr><tr><td> 4-0 Polyglactin Naht </td><td> Schließung von Muskel / Haut </td></tr><tr><td> 3-0 oder 4-0 Seidenfaden </td><td> Die Sicherung der Katheterspitze die Haut </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Nadeln und Spritzen: </td></tr><tr><td> Nadel mit 18 Gauge </td><td> Durchstechen der Blase für Zystostomie Katheter </td></tr><tr><td> 25 und 30 Gauge-Nadeln </td><td> Prüfung auf Dichtheit Blase </td></tr><tr><td> 1 ml Kochsalzlösung filled Spritze </td><td></td></tr><tr><td> 22 Gauge Nadel mit stumpfer Spitze </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Zystostomie Katheter: </td></tr><tr><td> PE-50-Schlauch </td><td></td></tr><tr><td> Feuerzeug </td><td> Abfackeln PE-50-Schlauch </td></tr><tr><td> Kleine gebogenen Klemme </td><td> Entwickeln von subkutanen Tunnel </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Zystometrie: </td></tr><tr><td> MLT844 ADInstruments Datenerfassung und Software LabChart </td><td> Druck-Datenerfassung </td></tr><tr><td> Harvard 22 Spritzenpumpe (Harvard Apparatus, Holliston, MA) </td><td> Fluid Infusionspumpe </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Anästhetika (Unbewusste Zystometrie): </td></tr><tr><td> Ichsoflurane </td><td> Induktion / Aufrechterhaltung einer Vollnarkose </td></tr><tr><td> Urethan </td><td> Unconconscious Zystometrie </td></tr><tr><td> Bupivacain oder gleichwertige </td><td> Örtliche Betäubung </td></tr><tr><td> Meloxicam </td><td> Postoperativen Analgesie </td></tr><tr><td> Buprenorphin </td><td> Postoperativen Analgesie </td></tr></tbody></table>

evaluation of biomaterials for bladder augmentation using cystometric analyses in various rodent models

Die Nierenfunktion und Kontinenz von Urin hängen entscheidend von der richtigen Funktion der Harnblase, die den Urin speichert bei niedrigem Druck und treibt es mit einer genau orchestrierten Kontraktion. Eine Reihe von angeborenen und erworbenen urologischen Anomalien einschließlich Urethralklappen, benigner Prostatahyperplasie und sekundären neurogenen Blase an Spina bifida / Verletzungen des Rückenmarks kann in pathologischen Gewebeumbildung führt zu einer Beeinträchtigung der Compliance und reduzierter Kapazität 1 zur Folge. Funktioneller oder anatomischer Obstruktion der Harnwege wird häufig mit diesen Bedingungen verbunden und kann zu Harninkontinenz und Nierenschäden von der erhöhten Speicher-und Entleerungsdruck 2 führen. Chirurgische Implantation von Magen-Darm-Segmenten zu Orgel zu erweitern und reduzieren intravesikale Druck stellt die primäre chirurgische Behandlungsoption für diese Störungen, wenn medizinische Behandlung 3 ausfällt. Allerdings ist dieser Ansatz behindernED durch die Begrenzung der verfügbaren Spendergewebe, und ist mit erheblichen Komplikationen wie chronische Harnwegsinfektionen, metabolische Störung, Harnsteinbildung und sekundären Malignomen 4,5 assoziiert. Aktuelle Forschung in der Blase des Tissue Engineering ist stark auf die Identifizierung Biomaterial-Konfigurationen, die Regeneration von Geweben an defekten Stellen unterstützen können konzentriert. Herkömmliche 3-D-Gerüste aus natürlichen und synthetischen Polymeren wie Dünndarmsubmukosa und Poly-Glykolsäure abgeleitet habe einige kurzfristige Erfolge bei der Unterstützung von Urothel-und glatten Muskelzellen Regeneration sowie zur Erleichterung der Orgel erhöhte Speicherkapazität sowohl im Tiermodell und in der Abbildung gezeigt Klinik 6,7. Jedoch Mängel in Schafott mechanische Integrität und Biokompatibilität oft schädlichen Fibrose 8, Transplantat Kontraktur 9, 10 und Verkalkung führen, wodurch das Risiko des Versagens des Implantats und brauchen for sekundären chirurgischen Eingriffen. Darüber hinaus hat die Wiederherstellung der normalen Entleerung Eigenschaften unter Verwendung von Standard Biomaterial-Konstrukte für die Augmentation cystoplasty noch erreicht werden, und damit der Forschung und Entwicklung von neuartigen Matrizen, die diese Aufgabe erfüllen kann, wird benötigt. Um erfolgreich zu entwickeln und zu evaluieren optimale Biomaterialien für die klinische Blasenaugmentation, muss die Wirksamkeit der Forschung zunächst in standardisierten Tiermodellen unter Verwendung detaillierter chirurgischen Methoden und funktionelle Ergebnis Assessments durchgeführt werden. Wir haben zuvor die Verwendung eines Blasenaugmentation in Mäusen berichtet, um das Potenzial von Seidenfibroin-basierten Gerüsten Geweberegeneration und funktionellen Eigenschaften zu vermitteln Entleerung zu bestimmen. 11,12 Zystometrische Analysen dieses Modell haben gezeigt, dass Variationen in strukturellen und mechanischen Eigenschaften Implantat können die daraus resultierenden Eigenschaften der urodynamischen Gewebezüchtungen Blasen 11,12 beeinflussen. Positive Korrelationgen zwischen dem Grad der Matrix-vermittelte Regeneration der Gewebe bestimmt histologisch und funktionell Compliance und Leistungsfähigkeit von Zystometrie ausgewertet wurden in diesem Modell 11,12 demonstriert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass deshalb funktionale Auswertungen von Biomaterial-Konfigurationen in Nagetieren Blasenaugmentation Systeme können ein nützliches Format für die Beurteilung der Eigenschaften und zur Errichtung Gerüst in vivo Machbarkeit vor dem großen Tier-Studien und klinischen Einsatz sein. In der aktuellen Studie, werden wir verschiedene chirurgische Stadien der Blase Augmentation in beiden Mäusen und Ratten mit Seide Gerüste präsentieren und zeigen Techniken zur Narkose wach und Zystometrie.

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Evaluation of Biomaterials for Bladder Augmentation using Cystometric Analyses in Various Rodent Models

Chirurgische Stadien der Blase Augmentation beschrieben mit 3-D-Gerüste in Maus-und Ratten-Modellen. Um die Wirksamkeit der Biomaterial-Konfigurationen für den Einsatz in Blasenaugmentation zu testen, werden Techniken für beide wach und betäubt Zystometrie vorgestellt.

Bewertung von Biomaterialien für Blasenvergrößerung mit Zystometrische Analysen in verschiedenen Tiermodellen

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and ...

evaluation-biomaterials-for-bladder-augmentation-using-cystometric

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.1K Aufrufe.  Harvard Medical School. Chirurgische Stadien der Blase Augmentation beschrieben mit 3-D-Gerüste in Maus-und Ratten-Modellen. Um die Wirksamkeit der Biomaterial-Konfigurationen für den Einsatz in Blasenaugmentation zu testen, werden Techniken für beide wach und betäubt Zystometrie vorgestellt.

Serie: Evaluation of Biomaterials for Bladder Augmentation using Cystometric Analyses in Various Rodent Models

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

Herstellung von Micro-Gewebe mit Modulen von Collagen Gel enthaltenden Zellen

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Forschung

Biotechnik

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Sandwichartigen Mikroumgebungen zu nutzen Handy / Material-Interaktionen

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Synthese von Multi-walled Carbonnanotubes mit Silber-Nanopartikeln und Bewertung ihrer antibakteriellen Aktivitäten und zytotoxische Eigenschaften modifiziert

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Biologische Verträglichkeit Profil auf Biomaterialien für Knochenregeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Reinigung und Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus chinesischen Hamster-Ovarialzellen mit einem automatisierten Mikrobioreaktorsystem

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

Auswertung photosynthetischer Verhaltensweisen durch gleichzeitige Messungen von Blattreflexion simultanen und Chlorophyllfluoreszenzanalysen

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows assessment of bone substitution materials for oral and craniofacial bone regeneration in terms of bone growth and neovascularization support. Once animals are anesthetized and ventilated (endotracheal intubation), four cylinders made of polyether ether ketone (PEEK) are screwed onto the skull, on both sides of the median and coronal sutures. Five intramedullary holes are drilled within the bone area delimited by each cylinder, allowing influx of bone marrow cells. The material samples are placed into the cylinders which are then closed. Finally, the surgical site is sutured, and animals are awaken. Bone growth may be assessed on live animals by using microtomography. Once animals are euthanized, bone growth and neovascularization may be evaluated by using microtomography, immune-histology and immunofluorescence. As the evaluation of a material requires maximum standardization and calibration, the calvarial model appears ideal. Access is very easy, calibration and standardization are facilitated by the use of defined cylinders and four samples may be assessed simultaneously. Furthermore, live tomography may be used and ultimately a large decrease in animals to be euthanized may be anticipated.

Here we present a surgical protocol in rabbits with the aim to assess bone substitution materials in terms of bone regeneration capacities. By using PEEK cylinders fixed onto rabbit skulls, osteoconduction, osteoinduction, osteogenesis and vasculogenesis induced by the materials may be evaluated either on live or euthanized animals.

Calvarial-Modell der Knochenvergrößerung bei Kaninchen zur Beurteilung des Knochenwachstums und der Neovaskularisation in Knochensubstitutionsmaterialien

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

Primärklärung der CHO geernteten Zellkulturflüssigkeit mittels eines akustischen Separators

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...