Integra dermalen Regeneration Vorlage wurde freundlicherweise von Integra Lifesciences Corporation. Finanzierungsquellen zur Unterstützung der Arbeit: (. Nr 15090007) Diese Arbeit wurde teilweise durch die CIRM-BMBF Früh Translational II Award und dem FONDAP Zentrum für Genom Regelung sowohl JTE finanziert.

1. Herstellung der Gerüste <ol><li> Erzeugen Proben der Gerüste durch die Verwendung von 12 mm-Biopsie Schläge. </li><li> Bioaktive Moleküle oder Zellen einzuführen in das Gerüst, abtropfen lassen die Gerüste durch sanft drückte sie mit einer sterilen Gaze. Dann rehydrieren die Gerüste durch Zugabe von 160 ul einer Lösung, die biologisch aktiven Moleküle oder Zellen von Interesse enthält. Überprüfen Sie den Erfolg der Bioaktivierung mit Zellen durch Stoffwechseltests, wie MTT-Assays. </li><li> Falls erforderlich, korrigieren die Verbindungen oder Zellen innerhalb des Gerüsts getestet werden durch die Bereitstellung von ihnen, zum Beispiel in einem Fibrin-Thrombin-Lösung oder einem Hydrogel, wieder durch Rehydratation, wie in Schritt 1.2 beschrieben. Hinweis: Dieser Schritt kann hilfreich sein, wenn Verbindungen oder Zellen nicht mechanisch mit dem Material zu befestigen. Man kann auch kontrollieren die Freisetzung Dynamik der Verbindungen .. </li><li> Bereiten Sie die titanisierten Maschen, die unter jedem Gerüst in jedem Experiment und der Kontrollgruppe gestellt werden, durch cutting aus rund geformte Stücke, etwa 14 mm im Durchmesser. HINWEIS: Die titanisierten mesh arbeitet als eine physikalische Grenze erforderlich ist, um das regenerierte Gewebe vom Wundbett zu begrenzen. </li></ol> 2. Tiere <ol><li> Vor der Umsetzung des vorgestellten Modells finden Sie in den entsprechenden Tierschutzgesetze und die Erlaubnis von den örtlichen Behörden. In dieser Arbeit wurden alle Experimente mit Mäusen durchgeführt, nach der aktuellen deutschen Tierschutzgesetz und von der Regierung von Oberbayern (Regierung von Oberbayern) zugelassen. </li><li> Sorgfältig auswählen, das Tier und Dehnung. Obwohl das Modell bei Mäusen festgestellt, kann es zu den üblichen Tieren, wie Ratten, Kaninchen und Schweinen übersetzt werden. </li><li> Falls Sie sich mit Pelztiere arbeiten, rasieren die Rücken der Tiere vor der Implantation der Gerüste. HINWEIS: Diese Arbeit setzt Mäuse von 6 bis 8 Wochen mit einem Körpergewicht zwischen 20 g und 25 g, jedoch unterschiedlichen Alters und body Gewichten können ebenfalls verwendet werden. </li></ol> 3. Anästhesie <ol><li> Führen Sie die Operation unter sterilen Bedingungen. Um die normale Körpertemperatur des Tieres zu erhalten, verwenden Sie eine Wärmematte. </li><li> Vor der Anästhesie inhalativ erhalten die Tiere Buprenorphin in einer Dosis von 0,05-0,1 mg / kg Körpergewicht subkutan alle 8 Stunden. </li><li> Legen Sie das Tier unter inhalativen Anästhesie (Isofluran) oder gleichwertig gelten Standardverfahren. Anästhesie bestätigen entweder durch leichtes Zusammendrücken des Tieres Zehen oder durch eine Haut Prise. </li><li> Um zu verhindern Exsikkose injizieren 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung subkutan in den Beginn des Betriebs. </li></ol> 4. Exzision der Haut <ol><li> Legen Sie das Tier in Bauchlage und markieren Sie die Mittellinie des Maus ist wieder mit einer feinen Spitze permanenten Stift (Abbildung 1A). </li><li> Definieren Sie die Exzision Bereich. Legen Sie die Mängel in der in Figu gezeigten Bereichre 1C. Beachten Sie, dass, wenn die Mängel zu kaudal platziert, sind Tiere anfälliger für die Verbände und die Gerüste entfernen. </li><li> Erstellen bilaterale Defekte mit einem 10 mm-Biopsie Punch (Abbildung 1B). Der Stempel sollte sorgfältig gegen die Haut gedrückt werden und darf nicht verwendet werden, um komplett durch die Haut geschnitten, aber die Exzision Bereich (1C &amp; 1E) abzugrenzen. </li><li> Vorsichtig heben Sie die markierten Haut mit einer Pinzette und einzuschneiden entlang der markierten Kreis mit feinen chirurgischen Schere (1F). Im Falle von Blutungen, sorgfältig zu komprimieren mit steriler Gaze. Eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Exzision ist in Abbildung 1 dargestellt. HINWEIS: Der Defekt wird mit einem kleineren Punch als die für die Erzeugung der Gerüste durch die Elastizität der Haut erstellt, um die Erweiterung der Mangel auszugleichen. </li></ol> 5. Gerüst Implantation <ol><li> Um Platz zu machen für die TitaNetz erfasst, verlängern die Trennung der Haut und des darunterliegenden Gewebes an der Wundränder für 2-4 mm (Abbildung 2A). </li><li> Legen Sie die titanisierten direkt auf das Wundbett und unter den Wundrändern (2A &amp; B) in den Defekt Netz. </li><li> Ort Gerüste direkt über das Netz. </li><li> Naht der Gerüste zu den benachbarten Wundränder mit 4 bis 6 einzelne Knoten, so dass die Kanten leicht über das Gerüst (Abbildung 2C). HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von biologisch abbaubaren Nähten. </li><li> Naht eine transparente Wundverband über die Mängel, das Schafott zu schützen und ermöglicht die Überwachung der Wundfläche (2D). </li></ol> 6. Postoperative Pflege <ol><li> Halten Sie eine Maus pro Käfig zum gegenseitigen Manipulation des Verbandes und Gerüsten abzuwenden. </li><li> Bewerten Sie die allgemeinen Zustand des Tieres auf einer täglichen Basis durch die Beobachtung der motorischen Aktivität, Körpergewicht, Anzeichen von Schmerzen, Toleranzin die Umkleide und Auto-Verstümmelung. Überwachen auch den Wundbereich zu Blutungen, lokale und systemische Infektionszeichen und der Position des Aufzugs. </li><li> Um die Schmerzen des Tieres zu minimieren, injizieren Buprenorphin täglich in einer Dosis von 0,05-0,1 mg / kg Körpergewicht oder äquivalente Analgetika. </li><li> Wenn die Maus entfernt oder Schäden die Wundauflage, ersetzen oder bringen Sie ihn in Narkose. </li></ol> 7. Euthanasie und Explantation des Gerüsts <ol><li> In gewünschten Zeitpunkten, zu opfern, die Tiere durch Überdosis Pentobarbital (150 mg / kg). </li><li> Markieren Sie die Stelle der Haut Exzision mit einem Permanent-Marker, die die Gerüste und so viel von der Maus wieder Haut wie möglich (3A) umfassen sollte. </li><li> Inzision der Haut entlang der markierten Linien mit einer Schere oder einem Skalpell. Trennen Sie die gesamte Haut, einschließlich der Gerüste und der titanisierten Masche, von der darunterliegenden Gewebe durch stumpfe Präparation (Figurieren 3B). </li><li> Platzieren des explantierten Gewebes auf einer Petrischale gestreckt (3C und D) </li></ol> 8. Visualisierung und Quantifizierung der Gefäßnetz <ol><li> Durchleuchtung: <ol><li> Richten Sie eine Durchleuchtungseinrichtung, durch Montage einer Petrischale über einer starken Weißlichtquelle (100 Watt Standard-Glühlampe). </li><li> Fix eine Digitalkamera über dem Transilluminator, um digitale Bilder zu erhalten. </li><li> Legen Sie die Proben nach oben auf die Petrischale über die Durchleuchtungseinrichtung. </li><li> Machen Sie Fotos von der kompletten Gerüsten im Makro-Modus sowie der gleich große Bereiche der normalen Haut. Speichern Sie die Bilder in einer TIFF-Format zur weiteren digitalen Analyse. </li><li> Speichern Sie das Gewebe für die weitere biochemische oder histologische Analyse. </li></ol></li><li> Digitale Segmentierung und Quantifizierung: <ol><li> Download und Installation des VesSeg-Tool-Software, die fr erhalten werden kann,ee Ausgabe bei: <a href="http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&amp;L=2%255">http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&amp;L=2%255</a> . </li><li> Öffnen Sie das Bild mit dem VesSeg-Tool. </li><li> Wählen Sie den Bereich der durch das Gerüst für die digitale Analyse (Bild → Select) abgedeckt Bild. </li><li> Um den Kontrast der Schiffe zu erhöhen verwenden Sie die Option &quot;Hysterese Schwellen&quot; (Bild → Fahrzeug Verstärkungsfilter → Hysterese Schwellen → Top-Hat-Transformation → Berechnen Schiff Enhancement). </li><li> Fahren Sie mit der Segmentierung des Schiffes Karte (Bild → Fahrzeug Verstärkungsfilter → Hysterese Schwellen → Schwellwert Grenzen). Wählen Sie die erste Schwelle (&quot;Vessel coverage&quot;), so dass jedes Pixel, was auch nur entfernt gefäßartigen, wird als Schiff bezeichnet werden. Wählen Sie die zweite Schwelle (&quot;Hintergrunddeckung&quot;), so dass nur die Pixel, die besonders gefäßartigen wird als Gefäße beschriftet werden sollen. </li><li> Überprüfen Sie die automatische Segmentierung Vorschlag manuell auf nicht-eingefangen Gefäße hinzuzufügen und falsch-positive gemeinsame Strukturen, die in der Regel lange und dünne, gefäßartige Strukturen wie Haare oder Fäden zu beseitigen. </li><li> Berechnen Sie die Länge der Schiffe und des Gesamtbereichs von Schiffen bedeckt (Bild → Bilddaten → Binary Bildstatistik). HINWEIS: Für die Berechnung der Behälterlängen sind Schiffe im resultierenden Behälter Karte, um Linien mit einer Breite von einem Pixel 20 ausgedünnt. </li></ol></li><li> Analysieren Sie den nativen Hautbereich unter den gleichen Parametern wie die Gerüste, die Zuweisung einen Wert von 100% auf die native Gewebe und betreffen das Gerüst auf diesen Wert. Zum Beispiel, wenn der Prozentsatz der weißen Pixel beträgt 60% im Normalgewebe und 30% in dem Gerüst, wäre eine 50% Vaskularisierung des Gerüsts darstellen. Anmerkung: Der weiße Gefäße Abdeckung ist auf den Bereich ein Quadrat um das Gerüst zugeordnet. Stellen Sie die Anzahl der weißen Pixel Abdeckung Considering, dass die Fläche des Kreises ist deutlich kleiner (π x R 2) als das Quadrat (4 x R 2). </li></ol>

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Interessenkonflikt: Alle Autoren: Keine Finanz Angaben: Keiner der Autoren hat ein finanzielles Interesse an einem der Produkte, Geräte oder in diesem Manuskript erwähnt Drogen.

Es besteht die Notwendigkeit, erfolgreiche Ansätze bei der Verbesserung der Durchblutung im Gewebe Konstrukte, die die Entwicklung von neuen zuverlässigen Methoden verlangt, um die Gefäßprozesse in den Biomaterialien zu untersuchen etablieren. Übliche Verfahren zur Herstellung von Gerüst Vaskularisierung ex vivo sichtbar umfassen die Verwendung von Mikroskopie, die eine hochauflösende Werkzeug bietet. In den meisten Fällen jedoch ist dieses Verfahren beschränkt auf die Analyse von kleinen Gewebebereich...

In den letzten Jahrzehnten hat sich das Tissue Engineering eine neue therapeutische Option, um Gewebedefekten mit körpereigenen Zellen ersetzen 1 eröffnet. Um die physiologischen Prozess der Geweberegeneration zu unterstützen, werden als biologisch abbaubare Gerüst-Struktur, die ein Szenario, in dem Zellen aus dem Wundbett wachsen und Wiederherstellen der Defekt 2,3 kann bietet gestalten. Unzureichende Vaskularisierung gilt als das Haupthindernis, das die klinischen Durchbruch der bioartifizielle Gerüste 4 zurückhält sein. Mit dem Einwachsen von Zellen, wird die Nachfrage nach Nährstoffen und Sauerstoff zu und Gefäß des Materials wesentlich. Unzureichende oder verzögert Gefäß kann daher zu zentralen Nekrose der Tissue-Engineering-Produkte 5 führen. Darüber hinaus bieten die Blutgefäße immunkompetenten Zellen und Entfernen der Stoffwechselreste in dem Regenerationsbereich. Hohe Infektionsraten und geringe Regenerations sind nureinige der Folgen unzureichender Durchblutung im Tissue Engineering beobachtet, die ausgerichtet sind, um durch die Erhöhung der Vaskularisierung der Gerüste 6,7 abgewendet werden. Mehrere Strategien, die auf die Verbesserung der Vaskularisierung Fokus auf die Schlüsselrolle von dem Biomaterial selbst und der Mikrostruktur des Gerüst zielen. Es gibt intensive Forschungsbemühungen, um neue Ansätze bei der Verlagerung des Heilungsprozesses von der Reparatur, um die Regeneration und damit (wieder), die ein Gewebe mit den engsten physiologischen Objekte, die dem zu entwickeln, die wiederhergestellt werden 8,9. Biomaterialien, die ihre Regenerationspotential untersucht und bewertet wurden hinsichtlich enthalten Kollagen, Fibrin, Chitosan und Alginat 10,11. Diese Biomaterialien verwendet und kombiniert als Backbone für den Bau neuer Gerüste mit unterschiedlichen Strategien, wie Gewebe Dezellularisierung, Selbstorganisation, Rapid Prototyping und das Elektro 12 werden. Um ENHrung der körpereigenen Regenerationsfähigkeit, kann Gerüste bioaktiviert werden. Der Einbau von rekombinanten angiogene Wachstumsfaktoren 13 oder Gen-Vektoren kodieren für solche Faktoren 14 hat gezeigt, dass die Vaskularisierung des Gerüsts zu verbessern. Die Verwendung von Stammzellen wurde weithin gezeigt worden, um eine vielversprechende Strategie, um Gefäß, bei denen mesenchymale Stromazellen und endothelialen Vorläuferzellen haben die meiste Aufmerksamkeit 15,16 gewonnen zu verbessern. Andere Ansätze versuchen, Konstrukte, die vorgefertigte Gefäßnetze vor der Transplantation 17 enthalten zu bauen. Trotz intensiver Bemühungen in Gerüst-Design und ihre Bio-Aktivierung hat keine Strategie Vaskularisierung an einer klinisch signifikanten Niveau verbessert und, mit Ausnahme von Hautersatz in massiven Brandverletzungen, ist die Übersetzung von biotechnisch hergestellten Materialien in der klinischen Routine nur zögerlich statt 18 . Einer der Gründe, warum die Vaskularisierungder künstlichen Gewebekonstrukten ist immer noch ein ungelöstes Problem ist die Schwierigkeit, den Erfolg der neuen Technologien in der in-vivo-Ansätze zu bewerten. Obwohl in vitro-Experimenten können wichtige Erkenntnisse der Gefäß Potenzial von Gerüsten bieten, werden geeignete Tiermodelle erforderlich, um wichtige Parameter untersuchen, wie die Biokompatibilität des Materials, die Sicherheit und Wirksamkeit der Behandlung und, besonders wichtig, die Vaskularisierung des Gewebes zu konstruieren. Daher zuverlässige Werkzeuge zur Visualisierung und Quantifizierung von Blutgefäßnetze in vivo sind unerlässlich. In dieser Studie zeigen wir ein einfaches und zuverlässiges Verfahren, das die Visualisierung und Quantifizierung des Gefäßnetzes in explantierten Gerüsten ermöglicht. Diese Methode basiert auf Gewebe und digitale Durchleuchtung Segmentierung. Da dieses Verfahren nicht-invasiv ist, kann er weitere molekulare und histologische Analysen des Targetmaterials.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1091">
	<tbody>
		<tr height="21">
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			<td height="40" style="height:40px;width:319px;">Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0</td>
			<td style="width:223px;">Ethicon, Norderstedt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">698G</td>
			<td>Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:319px;">Biopsy punches (10 mm)</td>
			<td style="width:223px;">Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA</td>
			<td style="width:119px;">P1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:319px;">Biopsy punches (12 mm)</td>
			<td style="width:223px;">Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA</td>
			<td style="width:119px;">P1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Digital camera&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Ricoh, Hannover, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Cx1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gazin Mullkompresse&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany</td>
			<td style="width:119px;">13622</td>
			<td>Sterile gauze (10 cm x 10 cm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Double-layer collagen-based scaffold (8 &#39;x 10&#39;)</td>
			<td style="width:223px;">Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA</td>
			<td style="width:119px;">88101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Baxter, Unterschleissheim, Germany</td>
			<td style="width:119px;">100196040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pentobarbital, 16 g / 100 ml</td>
			<td style="width:223px;">Fa. Merial, Hallbergmoos</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:319px;">Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu</td>
			<td style="width:223px;">Charles River, Sulzfeld, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Strain code 088</td>
			<td>Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:319px;">Buprenorphine (0.3 mg/ml)</td>
			<td style="width:223px;">Essex Pharma GmbH, Munich, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight</td>
			<td style="width:223px;">PFM Medical AG, K&#246;ln, Germany</td>
			<td style="width:119px;">6000029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:319px;">Tissucol Duo S Immuno 2 ml</td>
			<td style="width:223px;">Baxter Germany GmbH, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td style="width:119px;">B1332020110614</td>
			<td>Fibrin-thrombin solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Transparent adhesove drape (30.5 cm x 26 cm)</td>
			<td style="width:223px;">KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK</td>
			<td style="width:119px;">M6275009/10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a full skin defect model to evaluate vascularization of biomaterials in vivo

Unzureichende Vaskularisierung wird als einer der wichtigsten Faktoren, die den klinischen Erfolg der Tissue-Engineering-Konstrukten sein. Um neue Strategien, die auf die Verbesserung der Gefäß Ziel zu bewerten, werden zuverlässige Methoden erforderlich, um die in-Wachstum von neuen Blutgefäßen in Bio-künstliche Gerüste sichtbar zu machen und zu quantifizieren, die Ergebnisse. In den letzten paar Jahren hat unsere Gruppe eine vollständige Hautdefekt Modell, das die direkte Darstellung von Blutgefäßen ermöglicht durch Durchleuchtung und bietet die Möglichkeit der Quantifizierung durch digitale Segmentierung eingeführt. In diesem Modell chirurgisch schafft eine volle Hautdefekte in den Rücken von Mäusen und ersetzt sie mit dem geprüften Werkstoff. Moleküle oder Zellen von Interesse können in solche Materialien einverleibt werden, um die möglichen Auswirkungen zu untersuchen. Nach einer Beobachtungszeit von der eigenen Wahl werden die Materialien für die Bewertung explantiert. Bilaterale Wunden bieten die Möglichkeit, interne Vergleiche thbei minimieren Artefakte zwischen den Individuen als auch der Verringerung der Anzahl der Tiere, für die Studie benötigt. Im Vergleich zu anderen Ansätzen, bietet unsere Methode eine einfache, zuverlässige und kostengünstige Analyse. Wir haben dieses Modell als Routinewerkzeug in hoher Auflösung Screening beim Testen von verschiedenen Gefäß Biomaterialien und Bio-Aktivierung durchführen Ansätze implementiert.

Eine zuverlässige bilateralen Vollhautdefekt in der Maus (Abbildung 1), wo die Haut durch ein Biomaterial untersucht (Abbildung 2) ersetzt werden erstellt. Hier werden keine größeren Komplikationen während oder nach dem operativen Eingriff, weder makroskopische Anzeichen einer Infektion oder Fremdkörperreaktion beobachtet. In seltenen Fällen wird ein Gerüst verloren, wenn eine Maus entfernt es. Wundkontraktion wurde nicht beobachtet (Abbildung 3). Gewebedurch erl...

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A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vaskularisierung ist der Schlüssel zur erfolgreichen Ansätze in der Gewebezüchtung. Daher werden sichere Technologien erforderlich, um die Entwicklung von Gefäßnetze im Gewebekonstrukte bewerten. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und kostengünstige Methode zur Visualisierung und Quantifizierung Vaskularisierung in vivo.

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

12.1K Aufrufe.  Technische Universität München.  Vaskularisierung ist der Schlüssel zur erfolgreichen Ansätze in der Gewebezüchtung. Daher werden sichere Technologien erforderlich, um die Entwicklung von Gefäßnetze im Gewebekonstrukte bewerten. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und kostengünstige Methode zur Visualisierung und Quantifizierung Vaskularisierung in vivo. 

Serie: A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

Die dreidimensionalen humanen Haut Rekonstruieren Modell: ein Tool für normale Haut und Melanom Progression Study

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Forschung

Biotechnik

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Sandwichartigen Mikroumgebungen zu nutzen Handy / Material-Interaktionen

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Tissue Engineering von Intrinsic Vaskularisation in ein<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

A Method for Evaluating Timeliness and Accuracy of Volitional Motor Responses to Vibrotactile Stimuli

Artificial sensory feedback (ASF) systems can be used to compensate for lost proprioception in individuals with lower-limb impairments. Effective design of these ASF systems requires an in-depth understanding of how the parameters of specific feedback mechanism affect user perception and reaction to stimuli. This article presents a method for applying vibrotactile stimuli to human participants and measuring their response. Rotating mass vibratory motors are placed at pre-defined locations on the participant's thigh, and controlled through custom hardware and software. The speed and accuracy of participants' volitional responses to vibrotactile stimuli are measured for researcher-specified combinations of motor placement and vibration frequency. While the protocol described here uses push-buttons to collect a simple binary response to the vibrotactile stimuli, the technique can be extended to other response mechanisms using inertial measurement units or pressure sensors to measure joint angle and weight bearing ratios, respectively. Similarly, the application of vibrotactile stimuli can be explored for body segments other than the thigh.

This article describes a technique for applying vibrotactile stimuli to the thigh of a human participant, and measuring the accuracy and reaction time of the participant&#39;s volitional response for various combinations of stimulation location and frequency.

Ein Verfahren zur Bewertung der Rechtzeitigkeit und Genauigkeit der Volitionale Motor Responses to vibrotaktilen Stimuli

Artificial sensory feedback (ASF) systems can be used to compensate for lost proprioception in individuals with lower-limb impairments.  Effective design ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major pathogens in BAI. Current experimental BAI mammalian animal models such as mouse models are costly and time-consuming, and therefore not suitable for high throughput analysis. Thus, novel animal models as complementary systems for investigating BAI in vivo are desired. In the present study, we aimed to develop a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of bacterial infection in the presence of biomaterials based on fluorescence microscopy. In addition, the provoked macrophage response was studied. To this end, we used fluorescent protein-expressing S. aureus and transgenic zebrafish embryos expressing fluorescent proteins in their macrophages and developed a procedure to inject bacteria alone or together with microspheres into the muscle tissue of embryos. To monitor bacterial infection progression in live embryos over time, we devised a simple but reliable method of microscopic scoring of fluorescent bacteria. The results from microscopic scoring showed that all embryos with more than 20 colony-forming units (CFU) of bacteria yielded a positive fluorescent signal of bacteria. To study the potential effects of biomaterials on infection, we determined the CFU numbers of S. aureus with and without 10 &#181;m polystyrene microspheres (PS10) as model biomaterials in the embryos. Moreover, we used the ObjectJ project file &#34;Zebrafish-Immunotest&#34; operating in ImageJ to quantify the fluorescence intensity of S. aureus infection with and without PS10 over time. Results from both methods showed higher numbers of S. aureus in infected embryos with microspheres than in embryos without microspheres, indicating an increased infection susceptibility in the presence of the biomaterial. Thus, the present study shows the potential of the zebrafish embryo model to study BAI with the methods developed here.

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

The present study describes a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated infection over time based on fluorescence microscopy. This model is a promising system complementing mammalian animal models such as mouse models for studying biomaterial-associated infections in vivo.

Zebrafish Embryos Modell für bei Vivo Visualisierung und intravitalen Analyse von Biomaterial-assoziierte Staphylococcus Aureus Infektion

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

A Reliable and Reproducible Critical-Sized Segmental Femoral Defect Model in Rats Stabilized with a Custom External Fixator

Orthopedic research relies heavily on animal models to study mechanisms of bone healing in vivo as well as investigate the new treatment techniques. Critical-sized segmental defects are challenging to treat clinically, and research efforts could benefit from a reliable, ambulatory small animal model of a segmental femoral defect. In this study, we present an optimized surgical protocol for the consistent and reproducible creation of a 5 mm critical diaphyseal defect in a rat femur stabilized with an external fixator. The diaphyseal ostectomy was performed using a custom jig to place 4 Kirschner wires bicortically, which were stabilized with an adapted external fixator device. An oscillating bone saw was used to create the defect. Either a collagen sponge alone or a collagen sponge soaked in rhBMP-2 was implanted into the defect, and the bone healing was monitored over 12 weeks using radiographs. After 12 weeks, rats were sacrificed, and histological analysis was performed on the excised control and treated femurs. Bone defects containing only collagen sponge resulted in non-union, while rhBMP-2 treatment yielded the formation of a periosteal callous and new bone remodeling. Animals recovered well after implantation, and external fixation proved successful in stabilizing the femoral defects over 12 weeks. This streamlined surgical model could be readily applied to study bone healing and test new orthopedic biomaterials and regenerative therapies in vivo.

In vivo mammalian models of critical-sized bone defects are essential for researchers studying healing mechanisms and orthopedic therapies. Here, we introduce a protocol for the creation of reproducible, segmental, femoral defects in rats stabilized using external fixation.

Eine zuverlässige und reproduzierbare kritische Größe segmentale femoralen defekt-Modell bei Ratten mit einer benutzerdefinierten Fixateur externe stabilisiert

Orthopedic research relies heavily on animal models to study mechanisms of bone healing in vivo as well as investigate the new treatment techniques. ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

In Vivo Zwei-Farben 2-Photon Enzgebung von genetisch markierten Reporterzellen in der Haut

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows assessment of bone substitution materials for oral and craniofacial bone regeneration in terms of bone growth and neovascularization support. Once animals are anesthetized and ventilated (endotracheal intubation), four cylinders made of polyether ether ketone (PEEK) are screwed onto the skull, on both sides of the median and coronal sutures. Five intramedullary holes are drilled within the bone area delimited by each cylinder, allowing influx of bone marrow cells. The material samples are placed into the cylinders which are then closed. Finally, the surgical site is sutured, and animals are awaken. Bone growth may be assessed on live animals by using microtomography. Once animals are euthanized, bone growth and neovascularization may be evaluated by using microtomography, immune-histology and immunofluorescence. As the evaluation of a material requires maximum standardization and calibration, the calvarial model appears ideal. Access is very easy, calibration and standardization are facilitated by the use of defined cylinders and four samples may be assessed simultaneously. Furthermore, live tomography may be used and ultimately a large decrease in animals to be euthanized may be anticipated.

Here we present a surgical protocol in rabbits with the aim to assess bone substitution materials in terms of bone regeneration capacities. By using PEEK cylinders fixed onto rabbit skulls, osteoconduction, osteoinduction, osteogenesis and vasculogenesis induced by the materials may be evaluated either on live or euthanized animals.

Calvarial-Modell der Knochenvergrößerung bei Kaninchen zur Beurteilung des Knochenwachstums und der Neovaskularisation in Knochensubstitutionsmaterialien

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...