Hier stellen wir ein operationschirurgisches Protokoll für Kaninchen vor, mit dem Ziel, Knochensubstitutionsmaterialien in Bezug auf die Knochenregenerationskapazitäten zu bewerten. Das Grundprinzip dieses Kaninchen-Kalvarialmodells ist es, neues Knochengewebe vertikal auf dem kortikalen Teil des Schädels zu züchten. Dieses Modell ermöglicht die Beurteilung von Knochensubstitutionsmaterialien für die mund- und craniofacial Knochenregeneration in Bezug auf Knochenwachstumsunterstützung und Neovaskularisationsunterstützung.
Das Modell ist sehr wichtig, um die Knochenregeneration zu bewerten, da es das ektopische Wachstum von neuem Knochengewebe über reifen Knochen misst. Im Vergleich zu herkömmlichen Modellen, bei denen sich neuer Knochen regeneriert, um Defekte zu füllen, die künstlich geschaffen wurden, um endlich wieder auf das ursprüngliche Niveau zurückzukehren. Durch die Verwendung von großen Zylindern, die auf Kaninchenschädeln befestigt sind, können Osteokonduziertwerden, Osteoinduktion, Osteogenese und Vaskuläre, die durch die Materialien induziert werden, entweder an lebenden oder geopferten Tieren bewertet werden.
Demonstriert wird das Verfahren von Laurin Marger, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter unseres Labors, und mir. Nach der Sedierung der Tiere, legen Sie eine intravenöse Kanüle in die Randvene aus dem Ohr und halten Sie es geschlossen, bis die Intubation abgeschlossen ist. Legen Sie das Kaninchen in die anfällige Position und halten Sie seinen Kopf in vertikaler Verlängerung.
Anästhetisieren Sie die Luftröhre lokal durch Sprühen von 10%lidocain. Schieben Sie ein Endotrachealrohr mit kleinem Durchmesser in die Trachea des Kaninchens, bis der Luftstrom im Rohr zu hören ist. Dadurch wird der Kehlkopf geöffnet und das Einführen des endgültigen Rohres erleichtert.
Als nächstes legen Sie eine Führung in das Rohr, um die Position des Rohres in die Luftröhre zu fixieren. Entfernen Sie das Rohr mit kleinem Durchmesser und schieben Sie das definitive Endotrachealrohr auf die Führung. Entfernen Sie die Führung und blasen Sie den Ballon am Ende des Endotrachealrohrs auf, um das Gerät zu versiegeln und in die Luftröhre zu blockieren.
Kontinuierlich reichlich Fentanyl Analgesie induzieren. Zwei bis vier Milligramm pro Kilogramm Propofol zur Induzieren von Anästhesie und vier Milliliter pro Kilogramm pro Stunde Ringeracetat, um isovolumerische Bedingungen aufrechtzuerhalten. Belüften Sie das Tier sofort mit 3%Sevofluran in reinem Sauerstoff.
Legen Sie das Kaninchen zunächst auf ein beheiztes Pad, das auf 39 Grad Celsius eingestellt ist, auf den Operationstisch und legen Sie den rektalen Temperaturfühler. Rasieren Sie die Kopfhaut. Die Haut mit 10% Providon-Jod schrubben, um die Stelle zu desinfizieren.
Dann drapieren Sie das Kaninchen mit einem sterilen chirurgischen Drap und schneiden Sie einen Zugangsbereich des Schädels aus. Desinfizieren Sie die chirurgische Stelle mit 10%providon Jod ein zweites Mal. Zunächst wird lokal mit einer subkutanen Injektion von Lidocain auf den Schädel anästheisiert.
Verwenden Sie das Skalpell, um durch die Haut entlang der kalvarialen sagittalen Linie von den Umlaufbahnen bis zur äußeren okzipitalen Protuberanz zu schneiden, um sicherzustellen, dass das Periost eingeschnitten ist. Verwenden Sie einen Periosteal-Aufzug, um das Periost auf beiden Seiten des Einschnitts sanft zu erhöhen. Spülen Sie die Stelle mit steriler Saline.
Zuerst lokalisieren Sie die Medien und koronalen Nähte auf dem Schädel. Beachten Sie, dass diese anatomischen Linien ein Kreuz bilden. Die Zylinder werden in jedem der durch das Kreuz definierten Quadranten platziert, um sicherzustellen, dass sich die Kante des Zylinders nicht über der Naht befindet.
Platzieren Sie den ersten Zylinder auf dem linken oberen Quadranten, der das Gerät so flach wie möglich legt. Fixieren Sie die Position des Zylinders mit starkem Handdruck und schrauben Sie eine Mikroschraube ein, bis widerstandiert ist. Stellen Sie sicher, dass der Schraubenkopf mit der Zylinderlasche bündig ist.
Befestigen Sie die andere Lasche des Zylinders auf die gleiche Weise, um den Zylinder fest am Schädel zu befestigen. Stellen Sie sicher, dass der Zylinder hermetisch am Knochen befestigt ist. Wiederholen Sie dann diesen gesamten Vorgang, um einen Zylinder auf jedem der anderen drei Quadranten zu sichern.
Zu Beginn bohren Sie ein intermedulläres Loch unter der saline Bewässerung mit einem runden Grat auf dem Knochen auf der Mitte der Fläche, die durch den Zylinder begrenzt ist. Stellen Sie sicher, dass Blutungen auftreten. Als nächstes bohren Sie zwei weitere intermedulläre Löcher entlang der Achse, die durch die beiden Laschenschrauben an den innen Kanten des Zylinders verläuft.
Bohren Sie entlang der senkrechten Axt zwei weitere intermedulläre Löcher an den Innenkanten des Zylinders. Wiederholen Sie diesen Bohrvorgang für die drei anderen Zylinder. Dann füllen Sie den ersten Zylinder bis zum Rand mit der Materialprobe.
Schließen Sie den Zylinder, indem Sie die Kappe anbringen. Wiederholen Sie diesen Füllvorgang für die anderen drei Zylinder. Schließen Sie die Haut über den Zylindern mit einer intermittierenden, nicht resorbierbaren Naht und tragen Sie einen spritzbaren Verband auf die Wunde auf.
Danach stoppen Sie die Analgesie und Anästhesie Versorgung und überprüfen Sie auf die Wiederherstellung der autonomen Atmung. Sobald das Tier die autonome Atmung wiedererlangt hat, stoppen Sie die Beatmung. Bewahren Sie das Tier unter reinem Sauerstoff, bevor Sie vollständig erwachen.
Buprenophinhydrochlorid subkutan injizieren. Wiederholen Sie die Injektion alle sechs Stunden für drei Tage als postoperative Analgesie. Lassen Sie das Tier vollständig aufwachen, bevor Es in sein übliches Gehäuse mit Wasser und vollständiger Fütterung überführt wird.
Das in diesem Video beschriebene Modell ist der Beurteilung von Osteokontintion, Osteoinduktion, Osteogenese und Neovaskularisation in Knochenersatzstoffen gewidmet. Sobald die Operation abgeschlossen ist, kann das Knochenwachstum zu verschiedenen Zeitpunkten überwacht werden, indem knochentomographie an lebenden Tieren verwendet wird. Zusätzliche Analysen erfordern, dass die Tiere geopfert werden.
Nach der Euthanasie werden Proben geschnitten und die Zylinder sorgfältig entfernt. Biopsien werden dann mit einer Lösung von 4%Formaldehyd in PBS fixiert. Danach kann die Mikrotomographie verwendet werden, um das Knochenwachstum zu bewerten.
Proben können auch für histologische Färbung verarbeitet werden. Histomorphometrische Analysen und spezifische Färbungen sind dann möglich, um die Analyse genauer abzuschließen. Da es sich bei diesem Protokoll um eine chirurgische Methode handelt, sind alle Schritte kritisch und müssen ordnungsgemäß befolgt werden.
Es ist wichtig, für Tierversuche ausgebildet zu werden, insbesondere im Umgang mit Kaninchen und anästhesie. Abgesehen von den beschriebenen Methoden können Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie genauer analysiert werden. Materialentwicklung, Knochengewebereifung und Mechanik können beispielsweise auch mit Nano-Einbuchtung bewertet werden.
Mit Hilfe dieses Modells wurden viele Bewertungen durchgeführt. Wie z.B. bei Titan- oder Keramikkäfigen, GBM-Membranen, osteogenen Faktoren, Neugeborenen-Substituenten oder dem Mechanismus der Neovaskularisation während des Knochenregenerationsprozesses.
