Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der NIH (R01-HL095828 zu Kay MW) unterstützt.

1. Einrichten für das Studium <ol><li> Bereiten Sie vier Liter modifizierte Krebs-Henseleit-Lösung 16 (in mM: 118 NaCl, KCl 3,30, 2,00 CaCl 2, 1,20 MgSO 4, 24,0 NaHCO 3, 1,20 KH 2 PO 4, 10,0 Glukose, 2,00 NaPyruvate, und 20,0 mg / L Albumin ). Die Lösung sollte so kurz vor dem Beginn des Experiments wie möglich hergestellt werden. Der pH-Wert sollte auf 7,4 nach sterilen Filterung (: 22 pm, Corning Porengröße) eingestellt werden. Osmolalität der Lösung sollte zwischen 275 und 295 mosm / kg betragen. </li><li> Spülen Sie alle Rohre und Kammern des Herzens arbeiten System mit gereinigtem Wasser. Führen Pumpen, bis alles Wasser aus dem System entfernt wurden. </li><li> Fügen Zellulose Membranfilter (Porengröße: 5 um, Advantec) im Einklang mit jeder der Perfusion Pumpen (Langendorff-Perfusion Pumpe, linke Herz Perfusionspumpe und rechten Herzens Perfusionspumpe). </li><li> Führen Sie eine Zweipunkt-Kalibrierung (0 und 60 mmHg) für jeden Drucksensor. </li><li>Schalten Sie die Wasserbäder. Eine erhitzte zirkulierenden Wasserbad (Cole Palmer) wird verwendet, um die Wassermantel und Wärmeaustauscher erwärmt. Perfusat in einem separaten Wasserbad (Oakton Instruments) vorgewärmt. Beide Bäder sind so eingestellt, eine Lösung von 37 ° C zu halten </li><li> Schalten der Pumpe an das Perfusat in einer geschlossenen Schleife zu zirkulieren. Perfusat durchläuft Mikrofaser Oxygenatoren (Hämofilter) mit 95% O 2 und 5% CO 2 bei 80 kPa vergast. Sauerstoffhaltige Perfusat strömt dann durch die Wärmetauscher, um es bei einer Temperatur von 37 ° C zu halten, bevor sie das Herz Kanülen. </li></ol> 2. Herz Exzision <ol><li> Beginnen Sie, indem Sie die Arbeit Herzen System in konstantem Druck Langendorff-Modus betrieben werden. Den Druck der Aorta Block innerhalb des Bereichs von 50 bis 60 mmHg. </li><li> Anesthetize das Kaninchen mit einer intramuskulären Injektion von Ketamin (44 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Nachdem die Kaninchen ist sediert, Pentobarbital (50 mg / Kg) und Heparin (2000 U) intravenös in die marginale Ohrvene oder der lateralen Saphenusvene auf der Innenseite der hinteren Extremität injiziert. </li><li> Wenn das Kaninchen vollständig nicht reagiert, wie durch das Fehlen der Schmerzreflexes bestimmt, die Brusthöhle schnell geöffnet wird, das Perikard geschnitten wird, wird die Aorta abgeklemmt und das Herz und die Lungen ausgeschnitten. An diesem Punkt sollte die Lungen an das Herz links angebracht werden, um mit Isolierung der Pulmonalvenen zu helfen. </li><li> Isolieren und Kanülierung der Aorta mit einem Durchmesser von 5 mm Kanüle, die eine Spritze mit 60 ml Perfusat und 200 Einheiten Heparin gefüllt befestigt ist. Sichern Sie die Aorta an der Kanüle mit Größe Null Seidennaht und langsam drücken Sie die Spritze, um das Herz Blut zu spülen. </li></ol> 3. Biventrikulären Kanülierung <ol><li> Schließen Sie das Herz der Aorten-Block von der Arbeitsgruppe Herz-System. Verhindern Sie das Eindringen von Luft in die Aorta, die Koronar-Embolien verursachen können. Am besten ist es, die Kanüle auf die Aorten-BL legenock durch Annäherung an den Aorten-Anschluss in einem schiefen Winkel und ermöglicht Perfusat vorsichtig aus dem Verbinder tropft in die Kanüle während es befestigt ist. </li><li> Während das Herz in konstantem Druck Langendorff-Modus perfundiert wird, entfernen Sie den Fett-und Bindegewebe und suchen Sie die folgende Schiffe: inferior und Vena cava superior, Vena azygos, Lungenarterien, Lungenvenen. </li><li> Ligieren des oberen Hohlvene. Schneiden der Pulmonalarterie unterhalb wo es sich auf den rechten und linken Lungenarterien. </li><li> Gruppe alle übrigen Schiffe (die Lungenvenen) zwischen Herz und Lunge und ligieren sie alle mit einer Naht. Entfernen Sie in die Lunge. </li><li> Schneiden Sie ein kleines Loch in der Ecke des linken Herzohr. Stellen Sie sicher, dass die LA mit Perfusat gefüllt ist. Kanülierung des LA gleichzeitig sicherzustellen, dass die Kanüle vollständig mit Perfusat gefüllt, während sie eingeführt wird. Nähen Sie die Kanüle mit dem LA Anhängsel. </li><li> Biegen Sie auf der linken Seite (Pumpe # 2) zum Fließen zu bieten ter linken Vorhof. Stellen Sie Vorspanndruck zwischen 2 bis 6 mmHg und passen ± 2 mmHg, wie von Vorhof-Dilatation bestimmt. </li><li> Schalten Sie das Herz der Arbeiterklasse Herz-Modus durch Ausschalten des Langendorff (Pumpe # 1). </li><li> Momentan verringert den Aortendruck bis 10 mmHg und dann langsam zu erhöhen, um innerhalb des Bereichs von 80 bis 100 mmHg. Auf diese Weise können die Aortenklappe zu öffnen und zu funktionieren, wie es während der normalen physiologischen Bedingungen. Die endgültige Nachlast Druck hängt von der Kontraktilität des LV ab. Es sollte auf einen Wert, der etwa 20 mmHg weniger als Höhepunkt LV Druck gesetzt werden. </li><li> LV Herzleistung durch Messen der Strömungsgeschwindigkeit des Perfusat Verlassen des Aorten-Block (ml / min) bestimmt werden. Normalem Herzausgabevolumen zwischen 14.77 und 16,43 ml / min pro 100 g Körpergewicht 17 und Durchschnittswerte 340 ml / min für ein 2,2 kg Kaninchen. Aortendruck sollte das Drucksignal in 1 gezeigt aussehen. </li><li> Kanülieren die RA durch die inferior Hohlvene. Stellen Sie sicher, dass sowohl die RA und die Kanüle vollständig mit Perfusat gefüllt und legen Sie die Kanüle unter Vermeidung der Bildung von Luftblasen. Nähen Sie die Kanüle in die Vene. </li><li> Drehen auf der rechten Seite (die Pumpe Nr. 3) um die Strömung zu dem rechten Atrium. Stellen Sie den Druck auf ca. 3 mmHg. </li><li> Sicherstellen, dass die RV mit Perfusat gefüllt ist und kanülieren die Lungenarterie. Stellen Sie sicher, dass die Kanüle vollständig mit Perfusat gefüllt, während es eingesetzt wird, um Luftblasen zu verhindern. Nähen Sie die Kanüle in die Lungenarterie. </li></ol> 4. Signalerfassung: Drücke, monophasische Aktionspotentiale und fNADH <ol><li> Sobald biventrikulären Kanülierung abgeschlossen ist, setzen Sie die Druckaufnehmer Katheter (Millar) in die Aorta über die Aorta Kanüle. Vorsichtig zu navigieren es über die Aortenklappe und in den LV. Überwachen des LV-Druck-Signal um die richtige Positionierung der Katheterspitze zu gewährleisten. Ein Beispiel für LV-Druck gezeigtin 1. </li><li> Drücken Sie den monophasischen Aktionspotentials Elektrode gegen ventrikuläre Epikard. Überwachen Sie das Signal, geeignete Maßnahmen zu möglichen Messungen zu ermöglichen. Leichte Bewegungsartefakte im Signal ist normal. </li><li> Legen Sie eine bipolare Reiz-Elektrode auf dem rechten Vorhof, um das Herz zu stimulieren. In unserem Protokoll, waren am Herzen Zykluslänge zwischen 300 und 150 ms, entsprechend 200 und 400 Schlägen pro Minute, jeweils Tempo. </li><li> Messen der Temperatur des LV epikardialen Oberfläche. Wenn die Studie voraus, dass die Temperatur bei 37 ° C gehalten werden dann positionieren Sie das Herz in einem Wassermantel Herzkammer oder Tauchen Sie das Herz in einem gewärmten Superfusat Bad, eine konstante Temperatur während des gesamten Herzens zu erhalten. </li><li> Positionieren Sie den CCD-Kamera (Andor Ixon DV860, 128x128 Pixel) und die Fokussierung des Objektivs, so dass eine entsprechende Sehfeld beobachtet wird. Die Kamera ist mit einer Arbeitsstation verbunden und Bilder werden mit 2 Bildern pro Sekunde aufgenommen mit Andor SOLIS softwawieder. </li><li> Schalten der Quecksilberlampe Licht vor dem Beginn der Bildgebung. Licht wird durch ein Anregungsfilter (350 ± 25 nm, Chroma Technology) und in einen Lichtleiter (Horiba Jobin Yvon Modell 1950-1M) gerichtet, um die Oberfläche des Herzens zu beleuchten. Die Dämpfung von UV-Licht durch den Lichtleiter klein ist. UV-Beleuchtung könnte auch durch Verwendung einer Hochleistungs-LED-System, bestehend aus LED-Strahlern (Mightex PLS-0365-030-S) und eine Steuereinheit (Mightex SLC-SA04-US) werden. </li><li> Schalten Sie das Licht und Raum so gering wie möglich Ambientebeleuchtung. Richten Sie die Beschläge der Lichtleiter (oder LED-Strahler) in den Mittelpunkt, um eine gleichmäßige Ausleuchtung zu erzielen epikardialen. Emissions-NADH-Fluoreszenz (fNADH) durch einen Emissionsfilter (460 ± 20 nm Chroma Technology) und wird von der CCD-Kamera abgebildet wird. </li><li> Überwachen fNADH Veränderungen über die Zeit durch die eine Region von Interesse unter Verwendung des bildgebenden Software. Wählen Sie Live-Update-Modus, um den mittleren Pixel-Intensität innerhalb der Region o überwachenf Interesse. </li><li> Das Herz sollte in biventrikulären Arbeitsmodus zu funktionieren, geeignete Drücke erzeugen. fNADH Ebenen sollte niedrig und stabil über der epikardialen Oberfläche, um eine angemessene Koronarperfusion bestätigen. An diesem Punkt in der Studie eine bestimmte experimentelle Protokoll zu treffen, um eine Hypothese zu testen. </li><li> Wenn die Studie abgeschlossen ist, entfernen Sie das Herz aus dem System ablassen und alle Perfusat. Spülen Sie das System Schläuche und Kammern mit gereinigtem Wasser. Für die normale Pflege, sollte das System periodisch mit Mucasol Lösung oder einer verdünnten Wasserstoffperoxid-Lösung, je nach Bedarf zu spülen. </li></ol> 5. Offline-Verarbeitung von fNADH Images <ol><li> Eine Möglichkeit, NADH Datensätze zu vergleichen (fNADH (i, j, t)) zwischen den Experimenten ist, jedes Bild unter Verwendung eines Fluoreszenz-Referenzbild zu normalisieren (fNADH (i, j, t 0)) aus dem Datensatz 9, wie in der Gleichung unten gezeigt . Eine andere Möglichkeit, NADH Fluoreszenz normalisieren ist es, place ein kleines Stück Uranyl Glas in dem Sichtfeld vor dem Experiment 9, 18, ​​19. Uranyl Glas vor Fluoreszenz (450 - 550 nm) mit UV-Licht, um ein Signal, das als stabile Referenz verwendet werden kann beleuchtet. </li></ol><img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/4115/4115eq1.jpg" /> 6. Repräsentative Ergebnisse Front-und basalen Ansichten eines biventrikulären arbeiten Kaninchen Herzen Herstellung sind in Abbildung 1 dargestellt. Die linksventrikuläre Druck wurde durch Navigieren eines Druckwandler Katheter (Millar SPR-407) an der Aortenklappe und in die linke Herzkammer. Aorten, Pulmonalarterie und linksventrikulären Druck (LVP) sind in 1C gezeigt. Diastolischen LVP ist in der Regel zwischen 0 und 10 mmHg. Die minimale diastolische Aortendruck beträgt etwa 60 mmHg. Systolische LVP ist abhängig von Fülldruck (die Vorspannung oder LA-Druck) und Kontraktilitätund optimalerweise zwischen 80 und 100 mmHg beträgt. Die maximale Aortendruck und maximale LVP sollte eng übereinstimmen, wie in 1C gezeigt. Einphasige Aktionspotentialen (MAPs) mit einer schnellen Depolarisation und Repolarisation Phase, die typisch für Kaninchenherzen sind, werden in 1D gezeigt. MAPs können relativ leicht von einem öffentlichen Herzen aufgezeichnet, aber haben in der Regel kleine Bewegungsartefakte während der Diastole, wie in 1D gezeigt. MAPs sind nützlich für die Bestätigung erfolgreich Mitnahme des Herzens (capture) während der Stimulation und kann auch verwendet, um lokale elektrophysiologischen Veränderungen durch Ischämie oder anderen akuten Störungen zu messen. Ein EKG kann auch durch Eintauchen des Herzens in ein Bad von warmen Superfusat und Anordnen einer Elektrode in dem Bad auf der linken und rechten Seite des Herzens gemessen werden. Eine dritte indifferente Elektrode wird entweder in das Bad eingesetzt, vom Herzen oder an der Aorta.Ein EKG liefert Informationen über die globale Anregungs-und Repolarisation Prozess, der nützlich für die Bewertung des gesamten elektrischen Funktion und aufschlussreich für das Vorhandensein von Ischämie ist. fNADH Bildgebung zeigt Veränderungen in der mitochondrialen Redox Zustand des Herzens, die verwendet werden, um die Raumzeit-Progression von ischämischen oder hypoxischen Regionen gemessen werden kann. Für diese Studie wurde epikardialen fNADH gemessen, um Veränderungen der Redox-Status während drei Stimulationsfrequenzen bei Zykluslängen (CLs) von 300, 200 und 150 ms zu überwachen. Durchschnittliche fNADH Werte aus einer Region of Interest (roter Kasten, Abbildung 2) zeigen, dass die Grundlinie fNADH Ebenen als die Zykluslänge verkürzt wird steigen. Wenn Stimulationsfrequenz liegt in der Nähe des Sinusrhythmus (CL = 300 ms) Baseline fNADH Niveau relativ konstant ist. Als Zykluslänge wird unterhalb von 300 ms, Baseline fNADH Ebenen Anstieg, wobei der größte Anstieg bei der kürzesten CL (150 ms) verkürzt. Hochauflösende fNADH Bildgebung des gesamten vorderen Flächebei 200 und 400 Schlägen pro Minute wird in Abbildung 3 dargestellt. fNADH Ebenen bei 200 bpm waren konstant und räumlich homogen. Bei 400 bpm, erhöht fNADH Ebenen im Wesentlichen durch das Epikard. Deutliche räumliche Heterogenität wurde mit den höchsten Zuwächsen, die innerhalb der septalen Regionen des RV und LV beobachtet. Die fNADH Signal oszilliert mit Kontraktion (Bewegungsartefakte) und die Frequenz der Schwingung entspricht Herzfrequenz (Abbildung 2). In biventrikulären Kanülierung, wird die Basis des Herzens durch 4 Kanülen, die um das Herz an einem Schwingen während der Kontraktion zu verhindern hilft, gehalten. Daher ist Schwingungsamplitude immer weniger als jeder längeren Zeitskala (5-10 sec) Trends in fNADH, die durch Ischämie oder Hypoxie verursacht werden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig1.jpg" /> Abbildung 1. Typische Drücke und monophasischen Aktionspotentialen von einer isolierten biventrikulären arbeiten raBBIT Herzen. A. Basal Ansicht des Herzens, in die vier Kanülen: 1, Aorten, 2, Lungenarterie, 3, linke atriale und 4, das rechte atriale B. Vorderansicht des Herzens, in den linken Ventrikel (LV) und den rechten Ventrikel. (RV). C Repräsentative Druck. Top: linksventrikuläre Druck (durchgezogene Linie) und der Aortendruck (gepunktete Linie). Unten:. Pulmonalen Druck D. Repräsentative monophasischen Aktionspotentialen. Das Signal wird mit dem Druck in Panel C gezeigt ausgerichtet <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4115/4115fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig2.jpg" /> Abbildung 2. fNADH Abbildung eines isolierten biventrikulären arbeiten Kaninchen Herzen. Oben: Eine Karikatur des Sichtfeldes (links) und drei fNADH Bilder angezeigt werden. Die entsprechende Pacing-Zyklus Länge (CL) für jedes Bild angezeigt.Die Region von Interesse für die fNADH Signal im unteren Bereich wird durch die rote Box gekennzeichnet. Die Spitze des monophasischen Aktionspotentials Elektrode auf der rechten Seite der Region von Interesse zu sehen. Das Epikard wurde beleuchtet mit dem Quecksilber-Lampe und Lichtleiter, wie in Abbildung 5 dargestellt. Nur der epikardialen Oberfläche rund um die Region von Interesse wurde beleuchtet. Unten: Durchschnittliche fNADH für die Region von Interesse angezeigt durch die rote Box in der oberen Abdeckung. Durchschnittliche fNADH steigt mit reduzierter Zykluslänge. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig3.jpg" /> Abbildung 3. fNADH Bilder des vollen vorderen Oberfläche eines isolierten biventrikulären arbeiten Kaninchen Herzen. Das Herz war Tempo aus der RA bei 200 bpm und 400 bpm. fNADH abgebildet wurde (2 fps, 128x128 Pixel bei einer Auflösung von 0,4 mm), während die Beleuchtung des gesamten vorderen Epikard mit zwei Hochleistungs-LEDs (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm, 4% intensity, 50 mW max).

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+glyburide+(glibenclamide)+on+myocardial+function+in+langendorff+perfused+rabbit+heart+and+on+myocardial+contractility+and+slow+calcium+current+in+guinea-pig+single+myocytes.">Effects of glyburide (glibenclamide) on myocardial function in langendorff perfused rabbit heart and on myocardial contractility and slow calcium current in guinea-pig single myocytes.</a> Mol. Cell Biochem. 242, 81-87 (2003).</li><li>Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+albumin+on+the+electrophysiologic+stability+of+isolated+perfused+rabbit+hearts.">Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 13, 168-172 (1989).</li><li>Combs, C. A., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+of+dehydrogenase+activity+within+living+cells+using+enzyme-dependent+fluorescence+recovery+after+photobleaching+(ED-FRAP).">Direct imaging of dehydrogenase activity within living cells using enzyme-dependent fluorescence recovery after photobleaching (ED-FRAP).</a> Biophys. J. 80, 2018-2028 (2001).</li><li>Coremans, J. M., Ince, C., Bruining, H. A., Puppels, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Semi-)quantitative+analysis+of+reduced+nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+images+of+blood-perfused+rat+heart.">(Semi-)quantitative analysis of reduced nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence images of blood-perfused rat heart.</a> Biophys J. 72, 1849-1860 (1997).</li><li>Scholz, T. D., Laughlin, M. R., Balaban, R. S., Kupriyanov, V. V., Heineman, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+substrate+on+mitochondrial+NADH,+cytosolic+redox+state,+and+phosphorylated+compounds+in+isolated+hearts.">Effect of substrate on mitochondrial NADH, cytosolic redox state, and phosphorylated compounds in isolated hearts.</a> Am. J. Physiol. 268, 82-91 (1995).</li><li>Holcomb, M. R., Woods, M. C., Uzelac, I., Wikswo, J. P., Gilligan, J. M., Sidorov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+dual+camera+systems+for+multimodal+imaging+of+cardiac+electrophysiology+and+metabolism.">The potential of dual camera systems for multimodal imaging of cardiac electrophysiology and metabolism.</a> Exp. Biol. Med. (Maywood). 234, 1355-1373 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die isolierte Langendorff perfundierte Herz bleibt ein prominentes Werkzeug zur Untersuchung der kardialen Physiologie 2. Es ist besonders nützlich in Studien von Herzrhythmusstörungen, insbesondere solchen, die Fluoreszenz-Bildgebung der Transmembranpotential 20 zu verwenden. Ein Vorteil ist, dass die gesamte Epikard des isolierten Herzen 21, 22 beobachtet werden kann. Ein weiterer Vorteil ist, dass, im Gegensatz zu Blut, Perfusion mit einer klaren kristalloiden Pufferlösung nicht mit Fluoreszenz-Signale stören. Eine Einschränkung ist, dass die Langendorff-Technik nicht für die Untersuchung der kardialen Metabolismus, die oft das Herz, die Arbeit im Rahmen der physiologischen und Nachlast Druck durchzuführen gut geeignet. Um die Relevanz von isolierten Herzen Vorbereitungen für metabolische Studien, Neely eingeführt Modifikationen an der Langendorff-Technik, um entsprechende linksventrikulären (LV) Vor-und Nachlast Druck 3 etablieren zu erheben.Das Modell ist als die isolierte LV Arbeits-Herz-Modell bekannt und wurde ausgiebig auf Leistung und Stoffwechsel LV 6.4 Studie verwendet. Der LV Arbeits Herz-Modell ist besser als die Langendorff Modell für funktionelle Auswertungen, aber es bietet keine ordnungsgemäß geladen rechten Herzkammer (RV). Demmy et al. ersten berichteten von einer biventrikulären Modell (LV &amp; RV) als Modifikation des LV Arbeiten Herzmodell 7, 8. Sie fanden, dass das Schlagvolumen, Herzzeitvolumen, und der Druck in der Entwicklung von Herz-Modus zu arbeiten LV biventrikulären Arbeitsmodus 8 konvertiert verbessert. Ein ordnungsgemäß geladen RV verbessert auch die septalen Funktion durch Verminderung abnormalen Druckgradienten über der Scheidewand. Biventrikulären arbeiten Herzen hat sich gezeigt, Aorten-Ausgang, Lungen fließen, bedeuten Aortendruck, bedeuten pulmonalen Blutdruck, Herzfrequenz und myokardialen ATP und Kreatinphosphat Ebenen für bis zu 3 Stunden 8 zu halten. Biventrikulären arbeiten Herzen Studien verwenden in der Regel Herzen from kleine Tiere wie Ratten und Kaninchen, weil die Herzleistung und das erforderliche Volumen des Perfusat viel geringer als für Herzen von größeren Tieren sind. Allerdings haben biventrikulären arbeiten Herzen Studien durchgeführt, mit Herzen von Schweinen, Hunden und sogar Menschen 23, 24. Die metabolischen Bedarf von isolierten Herzen in biventrikulären Arbeitsmodus ist wesentlich höher als die der Langendorff-Perfusion. Es ist wichtig, dass das Perfusat Lösung genug Sauerstoff und metabolischen Substrat biventrikulären Herzfunktion zu unterstützen. Standard-kristalloiden Pufferlösungen, wie Krebs-Henseleit-16, 17, 25 oder Tyrodes 26, 27 haben Sauerstofflöslichkeiten so hoch wie 5,6 mg / L. Wenn diese Lösungen mit Carbogen (ein Gas Mischung aus 95% O 2 und 5% CO 2) werden vergast und enthalten geeignete metabolischen Substrat (Glucose, Dextrose, und / oder Natriumpyruvat), sind sie geeignet für biventrikulären arbeiten Herzen schlagen in Normal Sinus Preise (ca. 180 bpm für ein Kaninchen). Metabolische steigender Nachfrage für schnelle Rhythmen und die Menge an Sauerstoff in Standard Perfusaten gelöst möglicherweise nicht genug, um vollständige Unterstützung für eine biventrikuläre arbeiten Herz, das bei hohen schrumpft. Kristalloiden Pufferlösungen mit Erythrozyten oder gemischt mit Vollblut haben in der Arbeit Herzen Präparate verwendet worden, um ausreichend Sauerstoff Verfügbarkeit zu gewährleisten. Frühere Studien haben gezeigt, dass das Hinzufügen Erythrozyten zu einer Krebs-Henseleit-Lösung der Verbesserung der Arbeitsbedingungen Herzfunktion während strenge Stimulation Protokolle und auch die Häufigkeit von Kammerflimmern 16. Eine Einschränkung der Verwendung von Erythrozyten oder Mischungen aus Vollblut ist, dass Hämoglobin wird Lichtwellenlängen, die für die Fluoreszenz-Bildgebung 13 verwendet werden. Andere Substrate, wie Albumin, kann auch gegeben, um Lösungen zu Herzen Perfusat Lebensfähigkeit zu verlängern und die Ödeme 28 steht. Während der Fluoreszenz-Bildgebung die Intensität des Anregungslichts hoch sein sollte und die Lichtverteilung sollten einheitlich sein. Eine gleichmäßige Beleuchtung ist nicht immer einfach aufgrund der Krümmung der epikardialen Oberfläche. In unseren Studien haben wir Bild fNADH durch Filterung Licht (350 ± 25 nm) von einer Quecksilberlampe. Verzweigter Lichtleiter wird verwendet, um die UV-Licht auf der epikardialen Oberfläche zu leiten. Einheitliche Beleuchtung kann durch entsprechende Positionierung der beiden Ausgangs Aderendhülsen erreicht werden. UV-LED-Lichtquellen ebenfalls verwendet werden, wie wir in 3 gezeigt haben. LED-Quellen sind relativ billig, so dass mehrere Quellen könnten in ein bildgebendes System aufzunehmen. LEDs können auch geradelt werden ein-und ausschalten mit hohen Raten an Anregungslicht mit der Bildaufnahme synchronisiert werden. Photobleichen von NADH sollte 29 durch Reduzierung der Zeit von Gewebe Beleuchtung minimiert werden. Dies kann durch Radfahren die Beleuchtung ein-und ausschalten mit einem Elektronenmikroskop durchgeführt werdenIC-Shutter und eine Lampe oder mit einer LED-Beleuchtungssystem und einem Controller. Falls die Beleuchtung mit dem Herzzyklus synchronisiert ist, dann fNADH Bildaufnahme kann der Diastole beschränkt werden, was Bewegungsartefakt in der Fluoreszenz-Signale zu reduzieren. Ausschaltpunkt Beleuchtung und die Bildaufnahme unter Verwendung eines Drucksignals, wie LV-Druck, wäre eine Möglichkeit, dies zu tun. In unseren Studien haben wir festgestellt, dass Veränderungen in fNADH pro Zeiteinheit mehr sein kann als 5X höher bei 400 bpm als bei 200 bpm. Dies deutet darauf hin, dass schnelle Rhythmen der Redox-Zustand des Herzens zu erhöhen. Ob dies durch Hypoxie oder die Unfähigkeit von Myozyten, NADH zu NAD zu oxidieren verursacht + schnell genug, um die Akkumulation von NADH zu vermeiden, ist noch nicht geklärt. Die Leistung eines biventrikulären Herz arbeitet Vorbereitung ist abhängig von mehreren Faktoren ab. Eine der wichtigsten besteht darin, geeignete Vor-und Nachlast Druck gesetzt, um die physiologische nachahmenBedingungen, die der Untersuchung sind. Insbesondere müssen die LV-Nachlast (Aortendruck) eingestellt werden, um systemische Druck vertreten werden. Wenn sie zu hoch ist, wird die LV nicht in der Lage, den Druck zu überwinden, was zu Aufstoßen. Der Druck, der zu niedrig ist, wirken sich nachteilig auf Koronarperfusion. Der LV Vorspanndruck (linken atrialen Druck) ebenfalls eingestellt, um eine enddiastolischen Volumen, die für das experimentelle Protokoll bereitzustellen. fNADH Abbildung von lebenden Gewebes ist eine etablierte Art der Fluoreszenz-Imaging-13. Seine Anwendung auf Herzgewebe wurde von Barlow und Chance dargestellt, wenn sie von markanten Erhebungen fNADH innerhalb regional ischämischen Gewebe nach Ligatur eines Herzkranzgefäßes 14 berichtet. Ihre Bilder wurden auf fNADH Film mit einem Oszilloskop Fairchild Kamera-und UV-Blitzfotografie aufgezeichnet. Coremans et al. erweitert auf diesem Konzept mit der NADH Fluoreszenz / UV-Reflexion Verhältnis zu Messe der metabolischen Zustand des Epikard von Langendorff Blut-perfundierten Rattenherzen 30. Ein videofluorimeter wurde für die Bildgebung verwendet und Daten wurde mit einem Videorecorder. Später, Scholz et al. verwendet einen Spektrographen und der Photodiode Array durchschnittliche fNADH aus einem großen Bereich des LV zu messen. Dieser Ansatz reduziert die Auswirkungen der epikardialen Fluoreszenz Heterogenitäten und lokale Varianten im Umlauf, während enthüllen makroskopischen arbeitsbedingte Variationen fNADH 31. Dieser Ansatz ist ähnlich Computing durchschnittliche fNADH Ebenen für eine Region von Interesse in allen Frames eines fNADH Bilddatenstatz, wie in 2 dargestellt. Wie wir in diesem Artikel vorgestellt haben, bietet die heutige Technologie High-Speed-CCD-Kameras und digital gesteuerte Hochleistungs-UV-Strahlern. Diese Technologien ermöglichen die räumlich-zeitliche Dynamik der fNADH und Herz-Stoffwechsel in den Genuss vieler neuer Perspektiven untersucht werden. Die relativ geringe Kosten bei der die Optik und die Lichtquelle ist fNADH Bildgebung ein nützliches Zubehör für die konventionelle Herz-optische Mapping-Systeme. 9, 32

<table border="1"><tbody><tr><td> Chemikalie </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> S-3014 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> P3911-500G </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> C77-500 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> M-7506 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S-233 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> 423-316 </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 158968-500G </td></tr><tr><td> NaPyruvate </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> P2256-25G </td></tr><tr><td> Albumin </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> A9418-100G </td></tr></tbody></table>

nadh fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts

Seit der Gründung von Langendorff 1, bleibt die isoliert perfundierten Herzen ein prominentes Werkzeug zur Untersuchung der kardialen Physiologie 2. Es wird jedoch nicht für die Untersuchung der kardialen Metabolismus, die das Herz auf der Arbeit im Kontext der physiologischen Vor-und Nachlast Druck durchzuführen erfordern gut geeignet. Neely eingeführt Modifikationen an der Langendorff-Technik, um entsprechende linksventrikulären (LV) Vor-und Nachlast Druck 3 zu etablieren. Das Modell ist als die isolierte LV Arbeits-Herz-Modell bekannt und wurde ausgiebig auf Leistung und Stoffwechsel LV 6.4 Studie verwendet. Dieses Modell, jedoch nicht, eine richtig geladen rechte Ventrikel (RV). Demmy et al. ersten berichteten von einer biventrikulären Modell als eine Modifikation des LV Arbeiten Herzmodell 7, 8. Sie fanden, dass das Schlagvolumen, Herzzeitvolumen, und der Druck in der Entwicklung von Herz-Modus zu arbeiten LV biventrikulären Arbeitsmodus 8 konvertiert verbessert </sup&gt;. Ein ordnungsgemäß geladen RV verringert sich ebenfalls abnorme Druckgradienten über dem Septum zu Septum-Funktion zu verbessern. Biventrikulären arbeiten Herzen hat sich gezeigt, Aorten-Ausgang, Lungen fließen, bedeuten Aortendruck, Herzfrequenz und myokardialen ATP-Spiegel für bis zu 3 Stunden 8 zu halten. Bei der Untersuchung der metabolischen Wirkungen von myokardialer Verletzung, wie Ischämie, ist es oft notwendig, um die Position des betroffenen Gewebes zu ermitteln. Dies kann durch Abbilden erfolgen die Fluoreszenz von NADH (die reduzierte Form von Nikotinamidadenindinukleotid) 9-11, vor ein Coenzym in großen Mengen in den Mitochondrien. NADH-Fluoreszenz (fNADH) einen in der Nähe linear inverse Beziehung zu den lokalen Sauerstoffkonzentration 12 und liefert ein Maß für mitochondriale Redoxzustand 13. fNADH Bildgebung während hypoxischen ischämischen Zuständen und als Farbstoff-freies Verfahren verwendet worden, um hypoxischen Regionen 14, 15 zu identifizieren und um das Fortschreiten der Überwachunghypoxischen Bedingungen im Laufe der Zeit 10. Das Ziel der Methode ist die mitochondriale Redoxzustand biventrikulären arbeiten Herzen während der Protokolle, die die Rate der Myozyten-Stoffwechsel verändern oder zu veranlassen Hypoxie oder erstellen Sie eine Kombination aus beiden zu überwachen. Herz aus weißen Neuseeland-Kaninchen wurden zu einem biventrikulären arbeiten Herzen System (Hugo Sachs Elektronik) angeschlossen und perfundiert mit modifiziertem Krebs-Henseleit-Lösung 16 bei 37 ° C Aorten-, LV, Lungenarterie, und links und rechts atriale Drücke aufgezeichnet wurden. Die elektrische Aktivität wurde unter Verwendung eines monophasischen Aktionspotentials Elektrode. Um das Bild zu fNADH wurde Licht von einer Quecksilberlampe gefiltert (350 ± 25 nm) und verwendet, um das Epikard zu beleuchten. Emittierte Licht wurde filtriert (460 ± 20 nm) und abgebildet werden mit Hilfe einer CCD-Kamera. Änderungen in der epikardialen fNADH der biventrikulären arbeiten Herzen bei verschiedenen Herzfrequenzen werden vorgestellt. Die Kombination des Herzens Modell und fNADH Bildgebungbietet ein neues und wertvolles experimentelles Werkzeug zur Untersuchung von akuten kardialen Pathologien im Zusammenhang mit realistischen physiologischen Bedingungen.

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NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

Ziel ist es, die mitochondriale Redoxzustand isolierten Herzen im Rahmen der physiologischen und Nachlast Drücke überwachen. Ein biventrikulären arbeiten Kaninchen Herzen Modell vorgestellt. Örtlichen und zeitlichen Auflösung Fluoreszenz-Bildgebung von NADH wird verwendet, um die mitochondriale Redoxzustand Epikardgewebe überwachen.

NADH Fluoreszenz-Imaging von isolierten biventrikulären Arbeiten Kaninchenherzen

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

nadh-fluorescence-imaging-isolated-biventricular-working-rabbit

Research

JoVE Journal

Medicine

17.9K Aufrufe.  The George Washington University. Ziel ist es, die mitochondriale Redoxzustand isolierten Herzen im Rahmen der physiologischen und Nachlast Drücke überwachen. Ein biventrikulären arbeiten Kaninchen Herzen Modell vorgestellt. Örtlichen und zeitlichen Auflösung Fluoreszenz-Bildgebung von NADH wird verwendet, um die mitochondriale Redoxzustand Epikardgewebe überwachen.

Serie: NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of cardiovascular disease. Although molecular biology is necessary in identifying key changes in the signaling pathway, it is not a surrogate for functional significance. While physiology can provide answers to the question of function, combining physiology with biochemical assessment of metabolites in the intact, beating heart allows for a complete picture of cardiac function and energetics. For years, our laboratory has utilized isolated heart perfusions combined with nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to accomplish this task. Left ventricular function is assessed by Langendorff-mode isolated heart perfusions while cardiac energetics is measured by performing 31P magnetic resonance spectroscopy of the perfused hearts. With these techniques, indices of cardiac function in combination with levels of phosphocreatine and ATP can be measured simultaneously in beating hearts. Furthermore, these parameters can be monitored while physiologic or pathologic stressors are instituted. For example, ischemia/reperfusion or high workload challenge protocols can be adopted. The use of aortic banding or other models of cardiac pathology are apt as well. Regardless of the variants within the protocol, the functional and energetic significance of molecular modifications of transgenic mouse models can be adequately described, leading to new insights into the associated enzymatic and metabolic pathways. Therefore, 31P NMR spectroscopy in the isolated perfused heart is a valuable research technique in animal models of cardiovascular disease.

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Langendorff-mode isolated heart perfusion, in conjunction with 31P NMR spectroscopy, combines the fields of biochemistry and physiology into one experiment. The protocol allows for the dynamic measurement of high energy phosphate content and turnover in the heart while concurrently monitoring physiologic function. When performed correctly, this is a valuable technique in the assessment of cardiac energetics.

Beurteilung der Herzfunktion und Energetik in isolierten Maus-Herzen mit 31 P-NMR-Spektroskopie

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

Forschung

Medizin

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

In-vivo-Imaging der Tumorangiogenese mit Fluoreszenz-Videomikroskopie Konfokale

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart model, have been invaluable tools for studying cardiovascular function and disease1-15. Although the Langendorff heart preparation can be used for any mammalian heart, most studies involving this apparatus use small animal models (e.g., mouse, rat, and rabbit) due to the increased complexity of systems for larger mammals1,3,11. One major difficulty is ensuring a constant coronary perfusion pressure over a range of different heart sizes &#8211; a key component of any experiment utilizing this device1,11. By replacing the classic hydrostatic afterload column with a centrifugal pump, the Langendorff working heart apparatus described below allows for easy adjustment and tight regulation of perfusion pressures, meaning the same set-up can be used for various species or heart sizes. Furthermore, this configuration can also seamlessly switch between constant pressure or constant flow during reperfusion, depending on the user&#8217;s preferences. The open nature of this setup, despite making temperature regulation more difficult than other designs, allows for easy collection of effluent and ventricular pressure-volume data.

Most studies involving the Langendorff apparatus use small animal models due to the increased complexity of systems for larger mammals. We describe a Langendorff system for large animal models that allows for use across a range of species, including humans, and relatively easy data acquisition.

Eine isolierte Arbeits Herz-System für Großtiermodelle

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Arbeiten mit menschlichen Geweben für Translationale Krebsforschung

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

Fluoreszenz-vermittelten Tomographie für die Erkennung und Quantifizierung von murinen Makrophagen bedingte Darmentzündung

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Semi-Minimal Invasive Method to Induce Myocardial Infarction in Rats and the Assessment of Cardiac Function by an Isolated Working Heart System

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily and highly reproducible MI induction procedure is required to obtain further insight and better understanding of the underlying pathological changes. This procedure can also be used to evaluate the effects or potency of new and promising treatments (as drugs or interventions) in acute MI, subsequent remodeling and heart failure (HF). After intubation and pre-operative preparation of the animal, an anesthetic protocol with isoflurane was performed, and the surgical procedure was conducted&#160;quickly. Using a minimally invasive approach, the left anterior descending artery (LAD) was located and occluded by a ligature. The occlusion can be performed acutely for subsequent reperfusion (ischemia/reperfusion injury). Alternatively, the vessel can be ligated permanently to investigate the development of chronic MI, remodeling or HF. Despite common pitfalls, the drop-out rates are minimal. Various treatments such as remote ischemic conditioning can be examined for their cardioprotective potential pre-, peri- and post-operatively. The post-operative recovery was quick as the anesthesia was precisely controlled and the duration of the operation was short. Post-operative analgesia was administered for three days. The minimally invasive procedure reduces the risk of infection and inflammation. Furthermore, it facilitates rapid recovery. The &#8220;working heart&#8221; measurements were performed ex vivo and enabled precise control of preload, afterload and flow. This procedure requires specific equipment and training for adequate performance. This manuscript provides a detailed step-by-step introduction for conducting these measurements.

This article presents an efficient method to perform myocardial ischemia and subsequent chronic reperfusion in rats using a minimally invasive approach. In addition, left ventricular hemodynamic function of rats is assessed by echocardiography and isolated working heart methods.&#160;

Semi-Minimal Invasive Methode zur Induzieren von Myokardinfarkt bei Ratten und der Beurteilung der Herzfunktion durch ein isoliertes funktionierendes Herzsystem

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily ...

Biventricular Assessment of Cardiac Function and Pressure-Volume Loops by Closed-Chest Catheterization in Mice

Assessment of cardiac function is essential to conduct cardiovascular and pulmonary-vascular preclinical research. Pressure-volume loops (PV loops) generated by recording both pressure and volume during cardiac catheterization are vital when assessing both systolic and diastolic cardiac function. Left and right heart function are closely related, reflected in ventricular interdependence. Thus, recording biventricular function in the same animal is important to get a complete assessment of cardiac function. In this protocol, a closed chest approach to cardiac catheterization consistent with the way catheterization is performed in patients is adopted in mice. While challenging, the closed chest strategy is a more physiological approach, because opening the chest results in major changes in preload and afterload that create artifacts, most notably a fall in systemic blood pressure. While high-resolution echocardiography is used to assess rodents, cardiac catheterization is invaluable, particularly when assessing diastolic pressures in both ventricles.
Described here is a procedure to perform invasive, closed chest, sequential left and right ventricular pressure-volume (PV) loops in the same animal. PV loops are acquired using&#160;admittance technology with a mouse pressure-volume catheter and pressure-volume system acquisition. The procedure is described, beginning with the neck dissection, which is required to access the right jugular vein and the right carotid artery, to the insertion and positioning of the catheter, and finally the data acquisition. Then, the criteria required to ensure the acquisition of high-quality PV loops are discussed. Finally, the analysis of the left and right ventricular PV loops and the different hemodynamic parameters available to quantify systolic and diastolic ventricular function are briefly described.

Presented here is a protocol to assess biventricular heart function in mice by generating pressure-volume (PV) loops from the right and left ventricle in the same animal using closed chest catheterization. The focus is on the technical aspect of surgery and data acquisition.

Biventrikuläre Beurteilung der Herzfunktion und der Druck-Volumen-Schleifen durch Closed-Thorax-Katheterisierung bei Mäusen

Assessment of cardiac function is essential to conduct cardiovascular and pulmonary-vascular preclinical research. Pressure-volume loops (PV loops) ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ventricular stiffness with altered cardiac function. This increase in cardiac ventricular fibrosis is due to activation of resident fibroblasts, although how these cells operate within the 3-dimensional (3-D) heart, at baseline or after activation, is not well understood. To examine how fibroblasts contribute to heart disease and their dynamics in the 3-D heart, a refined CLARITY-based tissue clearing and imaging method was developed that shows fluorescently labeled cardiac fibroblasts within the entire mouse heart. Tissue resident fibroblasts were genetically labeled using Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mice crossed with the cardiac fibroblast expressing Tcf21-MerCreMer knock-in line. This technique was used to observe fibroblast localization dynamics throughout the entire adult left ventricle in healthy mice and in fibrotic mouse models of heart disease. Interestingly, in one injury model, unique patterns of cardiac fibroblasts were observed in the injured mouse heart that followed bands of wrapped fibers in the contractile direction. In ischemic injury models, fibroblast death occurred, followed by repopulation from the infarct border zone. Collectively, this refined cardiac tissue clarifying technique and digitized imaging system allows for 3-D visualization of cardiac fibroblasts in the heart without the limitations of antibody penetration failure or previous issues surrounding lost fluorescence due to tissue processing.

A refined method of tissue clearing was developed and applied to the adult mouse heart. This method was designed to clear dense, autofluorescent cardiac tissue, while maintaining labeled fibroblast fluorescence attributed to a genetic reporter strategy.

Verfeinerte CLARITY-basierte Gewebereinigung für die dreidimensionale Fibroblastenorganisation in gesunden und verletzten Mäuseherzen

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Isolated Lung Perfusion System in the Rabbit Model

The isolated lung perfusion system has been widely used in pulmonary research, contributing to elucidate the lungs&#39; inner workings, both micro and macroscopically. This technique is useful in the characterization of pulmonary physiology and pathology by measuring metabolic activities and respiratory functions, including interactions between circulatory substances and the effects of inhaled or perfused substances, as in drug testing. While in vitro methods involve the slicing and culturing of tissues, the isolated ex vivo lung perfusion system allows to work with a complete functional organ making possible the study of a continuous physiological function while recreating ventilation and perfusion. However, it should be noted that the effects of the absence of central innervation and lymphatic drainage still have to be fully assessed. This protocol aims to describe the assembly of the isolated lung apparatus, followed by the surgical extraction and cannulation of lungs and heart from experimental lab animals, as well as to display the perfusion technique and signal processing of data. The average viability of the isolated lung ranges between 5-8 h; during this period, the pulmonary capillary permeability increases, causing edema and lung injury. The functionality of preserved pulmonary tissue is measured by the capillary filtration coefficient (Kfc), used to determine the extent of pulmonary edema through time.

The isolated rabbit lung preparation is a gold standard tool in pulmonary research. This publication aims to describe the technique as developed for the study of physiological and pathological mechanisms involved in airway reactivity, lung preservation, and preclinical research in lung transplantation and pulmonary edema.

Isoliertes Lungenperfusionssystem im Kaninchenmodell

The isolated lung perfusion system has been widely used in pulmonary research, contributing to elucidate the lungs&#39; inner workings, both micro and ...

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

Primary graft dysfunction (PGD) remains the leading cause of early death following heart transplantation. Prolonged ischemic time during cold preservation is an important risk factor for PGD, and reliable evaluation of cardiac function is essential to study the functional responses of the donor heart after cold preservation. The accompanying video describes a technique to assess murine right and left ventricular function using ex vivo perfusion based in a Langendorff model after cold preservation for different durations. In brief, the heart is isolated and stored in a cold histidine-tryptophan-ketoglutarate (HTK) solution. Then, the heart is perfused with a Kreb buffer in a Langendorff model for 60 min. A silicone balloon is inserted into the left and right ventricle, and cardiac functional parameters are recorded (dP/dt, pressure-volume relationships). This protocol allows the reliable evaluation of cardiac function after different heart preservation protocols. Importantly, this technique allows the study of cardiac preservation responses specifically in native cardiac cells. The use of very small murine hearts allows access to an enormous array of transgenic mice to investigate the mechanisms of PGD.

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

Presented here is a protocol to reliably quantify the right and left ventricular function of donor hearts after cold preservation using an ex vivo perfusion system.

Bewertung der biventrikulären Funktion von murinen Mäusen in einem Langendorff-Modell

Primary graft dysfunction (PGD) remains the leading cause of early death following heart transplantation. Prolonged ischemic time during cold preservation ...