Und Beiträge an die Reizleitung Fund an der Kinderklinik Boston; Diese Arbeit wird durch Forschungsmittel von den National Institutes of Health (HL088206 HL068915) unterstützt.

Teil 1: Bereiten Sie Lösungen und der isoliert perfundierten Herzen System <ol><li> Am Morgen des Experiments beträgt 4,0 L von Krebs-Henseleit-Lösung hergestellt wie zuvor beschrieben [5, 6] beschrieben. </li><li> 11 mmol / L 2,3-Butandion Monoxim (BDM) ist in 1,0 L von Krebs-Henseleit-Lösung aus dem Perfusat in Schritt 1.1 hergestellten dekantiert aufgelöst. </li><li> Eine zusätzliche 150 ml Krebs-Henseleit ist aus dem Perfusat in Schritt 1.1 hergestellten entfernt und mit 5 mol / l di-8-ANEPPS (verdünnt aus einer 10 mmol / L Lager in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst). </li><li> 5% CO 2-Gas; Diese 3 Lösungen sind auf Wasser-ummantelten Glas Reservoire (Radnoti), wo sie sind auf 41,0 ° C vorgewärmt und mit Sauerstoff mit einem getauchten Bubbler (Radnoti) mit 0,2 um-gefiltert 95% O 2 übertragen. Lösungen aus den 3 stock Stauseen an der Wand montiert Langendorff-System mit Masterflex ™ L / S Schlauchpumpen und Low-Absorption Silikonschlauch (Cole-Parmer) gepumpt. </li><li> Vor der Montage ist die Langendorff System Glaswaren (Radnoti) sorgfältig mit E-TOXA-CLEAN-Reagenz (Sigma-Aldrich) gewaschen und gründlich mit 0,1 M / L HCl, 100% Ethanol und destilliertem Wasser gespült. </li><li> Die Nicht-Rückführung Langendorff-Apparatur wurde konstruiert, um 70 mm Hg bei konstantem Druck von 3 separate Sauerstoff Stauseen, die aus dem Herzen mit Wassermantel Heizschlangen und Blasenfallen getrennt zu liefern (Radnoti) [7]. Die 3 unabhängigen Perfusion Linien oberhalb des Herzens in zwei 3-Wege-Hähne konvergieren, so dass wir genau kontrollieren Lieferung der Lösungen in Schritten von 1,1 bis 1,3 zubereitet. Wasser-ummantelte Glas wird in Reihe mit Masterflex PharMed BPT-Schläuche (Cole-Parmer) angeschlossen und erwärmt auf 39 ° C mit destilliertem Wasser mit zwei E100-Umwälzpumpen (Lauda). Der Wärmeverlust durch die platin-veredelten Silikonschlauch (Cole-Parmer), dass der Druck-Kopf-Reservoirs verbindet sich mit dem Heizschlangen und Blasenfallen resultierte in einer 37 ° C Perfusat bis ins Herz reichen. </li></ol> Teil 2: Harvest der Ratte Herz und Set-up Langendorff Perfusion <ol><li> Um tiefe allgemeine Betäubung in 200-250 g Lewis Ratten zu induzieren, ist 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin in die Bauchhöhle injiziert. Zu dieser Mischung, fügen wir 500 U / kg Heparin auf die Blutgerinnung und Myokardischämie während der Explantation Verfahren zu verhindern. </li><li> Für einen einfachen Zugriff auf das Herz und die großen Gefäße, ist die vordere Brustwand entfernt. Danach wird das umliegende Gewebe sorgfältig seziert und die pericardial Sack öffnete. </li><li> Nach der Identifizierung der unteren Hohlvene, ist dieses Schiff mit 5-0 Seide (Ethicon) und das gesamte Herz-Lungen-Block ist explantierten ligiert. Das Gewebe wird sofort in eiskaltem Krebs-Henseleit-Lösung in einem 50 mL Becherglas auf Eis enthielt. </li><li> Die aufsteigende Aorta ist schnell identifiziert und seziert aus dem umgebenden Gewebe. Eine ausreichend große Kanüle (Harvard Apparatus) ist in die Aorta eingeführt, wobei darauf zu achten unterbrechen obligatorischen Perfusion der Koronararterien durch Einsetzen der Kanüle zu weit in die Aortenwurzel. Die Kanüle ist an der aufsteigenden Aorta mit 5-0 Seide (Ethicon) gesichert. </li><li> Die Ratte Herz wird dann auf der Langendorff-Apparatur, ohne dabei Luftblasen in die Kanüle gelegt. Retrograde koronaren vaskulären Perfusion ist nun mit dem warmen, sauerstoffreichen Krebs-Henseleit-Lösung aus der Druck-Kopf in Schritt 1.6 beschrieben aufgebaut. </li><li> Extra-Gewebe, einschließlich der Lunge, ist nun entfernt und das Herz für 20 Minuten perfundiert, um Wiederherstellung der Funktion zu ermöglichen und stabilisieren den Rhythmus. Während dieser Zeit ist eine sehr dünne Thermoelement Temperaturfühler (Cole-Parmer) in die linke Herzkammer Kavität eingebracht und vernäht mit 5-0 Prolene Naht (Ethicon). Die Sonde ist mit einer thermo-Regler (Digi-Sense) angeschlossen, um die Temperatur des Herzens zu gewährleisten ist bei 37 ° C durch eine Anpassung der Einstellungen des Wassers Kreislauf pumpen. Motion von Perfusat tropft von der Herzspitze ist, indem ein Stück Gaze in das Abwasser Behälter minimiert. </li></ol> Teil 3: Load Herz mit potentiometrischer Farbstoff und erwerben elektrografischen und optische Signale <ol><li> Di-8-ANEPPS (Invitrogen) ist in das Herz durch die Umstellung auf die Perfusion Zeile mit dem Krebs-Henseleit gemischt mit dem Fluoreszenzfarbstoff mit einem Hahn geladen. Darüber hinaus ist eine 18G Kanüle in der linken und / oder rechten Vorhof und zusätzlich 50 ml Farbstofflösung gelegt wird langsam in jeder dieser Kammern verabreicht, weil sie nicht ausreichend mit Farbstoff durch die Koronararterien eingeführt perfundiert. </li><li> Während des Ladevorgangs werden 3 EKG-Ableitungen (Harvard Apparatus) sanft auf der Oberfläche des Herzens, die nicht in die Richtung der Optik für die Projektion verwendet gelegt. Electrode N o 1 ist auf der hinteren apikalen Teil des linken Ventrikels, N o 2 auf dem linken Vorhof und N positioniert <su<html> p&gt; o 3 als Referenz-Elektrode auf der Aortenwurzel (Abbildung 1). Die atriale und ventrikuläre elektrografischen Signale werden anschließend verstärkt, digitalisiert und angezeigt neben optischen Signalen mit Hilfe der Software (Redshirt Imaging) (Abbildung 2). Ein Oszilloskop (Tektronix TDS Modell 1002) wird auch verwendet, um die Oberflächen-EKG s in Echtzeit zu visualisieren und zu angemessenen Tempo zu gewährleisten. </li><li> EKG-Verstärker (Hugo Sachs Elektronik) Einstellungen: High Pass Filter: 0,1 Hz Low Pass Filter: 150 Hz </li><li> Die CMOS-Kamera (Redshirt Imaging) und Makroskop positioniert ist mit der XYZ Anpassungen, so dass die Oberfläche des Herzens im Fokus ist und zentriert in der Akquisition Rahmen. Die Kamera und Optik sind auf einer Schwingungsisolierung Tabelle (Minus K Technology), um Resonanzfrequenzen zu minimieren montiert. Zur gleichen Zeit, einen koaxialen Stimulationselektrode (Harvard Apparatus) mit einem isolierten, S48 Elektro-Stimulation Einheit (Grass) kontrolliert wird, ist auf dem rechten Vorhof platziert und das Herz ist Tempo bei 300 Schlägen pro Minute (Abbildung 1). </li><li> Elektrische Stimulation (Grass) Einstellungen: Rate: 5 Impulse pro Sekunde Delay: 0,2 ms Dauer: 2 ms Volt: 6-12 V Modus: Wiederholen Pulse: Single </li><li> Für optische Aufnahmen, die Bewegungsartefakte Mangel von Kontraktion, muss das Herz elektromechanisch abgekoppelt werden. Wir tun dies, indem wieder Einschalten Perfusion Zeilen Krebs-Henseleit-Lösung, die 11 mmol / L BDM enthält. Zwischen Akquisitionen, ist das Herz mit unverfälschten Krebs-Henseleit perfundierten zur Erhaltung Lebensfähigkeit der Zubereitung. </li><li> Die Aufnahme-Parameter werden mit Hilfe der Software (Redshirt Imaging) mit folgenden Einstellungen Akquisition: Konfiguration: 2.000 Hz; 128x128 Pixel-Array Frame Interval: 0,5 ms Kamera Amplifier Gain: 5x On-Chip Gain: 8x-12Me-well Shutter: 500 ms Verzögerung Anzahl der Frames: 4000 Dauer: 2000 ms </li><li> Alle Zimmer und Ausstattung Lichter ausgeschaltet oder abgeschirmt, um Hintergrundgeräusche während der Aufnahme zu vermeiden. Die LED-Beleuchtung des Herzens nur bei der optischen Aufnahme auf Foto-Bleich-und Farbstoff Toxizität zu verringern. Die Lichtquelle Verschluss ist mit einem 5-V-Impuls über das Control Panel durch ein D-to-A Board in den Rechner (Redshirt Imaging) geliefert gesteuert. </li></ol> Teil 4: Analysieren Akquisition Informationen über Redshirt Imaging Software <ol><li> Nach dem Erwerb werden die Daten verarbeitet mit verschiedenen Filter-Einstellungen. Wir verwenden in der Regel die Standardeinstellungen außer bei der Einstellung der Band Stop / Pass-Filter, der mit der linken Grenze bei 44,0 und den rechten Rand auf 98,0 eingestellt ist. Danach werden die aufgenommenen Informationen verarbeitet und ein Film erzeugt wird (Redshirt Imaging). </li><li> Daten aus einer Akquisition entspricht der lokalen elektrischen Aktivierung bei 16.384 Seiten im Herzen Oberfläche über einen Zeitraum von 2 Sekunden. Die Software ermöglicht es, diese lokalen Signale direkt miteinander und mit der atrialen und ventrikulären elektrografischen Aufnahmen verglichen werden. Die Daten werden dann visualisiert Mapping lokalen elektrischen Aktivierung, um Farbe und Darstellung dieser Informationen als Animation zeigt die raumzeitliche elektrischen Aktivierung der kardialen Oberfläche. Zum Erstellen einer solchen Animation, verwenden wir die Software an: <ul><li> zeitlich und / oder räumlich die Daten filtern </li><li> wählen Sie eine Start-und Endzeit für die Animation </li><li> Karte optische Signale in Farbe auf ruhenden Lichtintensität der einzelnen Pixel auf </li><li> Overlay die resultierende Farbe von Daten mit einem Bild des Herzens </li><li> erzeugen die Animation </li></ul></li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse Wenn der perfundierten Herzen Vorbereitung war unbeweglich während der Aufnahme, zeigen die optischen Signale eine gesonderte Spitze für jedes Pixel in einer Veränderung der Emissionsintensität von di-8-ANEPPS beteiligt. Die entsprechenden Filme (Abbildungen 3 und 4) zeigen eine Anregung Wellenfront ausbreitet über die epikardialen Oberfläche des Herzens sowie die gleichzeitig erworbene elektrografischen Aufnahmen (Abbildung 2). <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Ein Foto von einer Langendorff-perfundierten Herzen Vorbereitung der Darstellung der Positionen der Stimulationselektrode auf den rechten Vorhof und die EKG-Ableitungen, wie in Schritt 3.2 beschrieben. <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="Abbildung 2" border="0" /> Abbildung 2. Representative optische Signale und elektrografischen Aufnahmen von einer perfundierten Lewis Ratte Herzen. Panel A zeigt ein Bild der epikardialen Oberfläche für die optische Bildgebung verwendet. Die Position der Pixel ausgewählt, um die Veränderungen in der Fluoreszenz-Emission im Laufe der Zeit in Panel B zeigen, sind durch farbige Pfeile angedeutet. Elektrographische Signale werden in Panel C mit der roten Linie, die atriale Aktivierung und die hellblaue Linie entspricht der ventrikulären Signal angezeigt. Bitteve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg &quot;&gt; Klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild zu sehen.

<ol>
	<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li><li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction.">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li><li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution.">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li><li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+electrical+activity+in+cardiac+cells+using+an+all-solid-state+system.">Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).</li><li>Stamm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+endotoxin-induced+alterations+in+myocardial+calcium+handling:+obligatory+role+of+cardiac+TNF-alpha.">Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha.</a> Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).</li><li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+through+engineered+tissue.">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li><li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium.">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li><li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts.">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li></ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschusses im Kinderkrankenhaus Boston gesetzt durchgeführt.

Die Entfernung des Herzens von narkotisierten Ratten müssen schnell durchgeführt werden, um Myokardischämie zu vermeiden. Wenn Ischämie oder unzureichender Koronarperfusion auftritt, wird das Herz wahrscheinlich entwickeln Arrhythmien und kann sich Infarkt. Darüber hinaus wird diese Herzen zeigen unzureichende Fluoreszenzemission für informative Aufnahmen und anschließende Analysen. Vor dem Einlegen der Farbstoff, müssen Herzmuskelzellen in angemessener Weise mit Krebs-Henseleit-Lösung perfundiert werden zur Sc...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CardioCMOS-SM128f</td>
<td>Equipment</td>
<td>RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CardioPlex Software</td>
<td>Equipment</td>
<td>RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LUXEON LED Light Source 460-490 nm </td>
<td>Equipment</td>
<td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td>
<td>LXHL-PB02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>730149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic Mirror 505 nm</td>
<td>Equipment</td>
<td>Semrock, Rochester, NY 14624 USA</td>
<td>FF505-SDi01-25x36</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Emission Filter 605 nm Long Pass</td>
<td>Equipment</td>
<td>SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>THT Sideways</td>
<td>Equipment</td>
<td>SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA</td>
<td>25 BM-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Ball Joint Holder</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Small Stimulation Electrode Set</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform</td>
<td>Equipment</td>
<td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td>
<td>25 BM-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monopolar ECG Electrode</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Roller Pump SCI 400</td>
<td>Equipment</td>
<td>Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA</td>
<td>401U/D1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Roller Pump MasterFlex Easy Load II</td>
<td>Equipment</td>
<td>Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA</td>
<td>Model 77201-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing Marprene #14</td>
<td>Equipment</td>
<td>Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA</td>
<td>902.0016.016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MasterFlex Tubing</td>
<td>Equipment</td>
<td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td>
<td>06485-25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>S48 Square Pulse Stimulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA</td>
<td>Model S48</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT</td>
<td>Equipment</td>
<td>Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA</td>
<td>Model SIU5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA </td>
<td>120142-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml Heating Coil</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>158822</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Compliance Bubble Trap</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>130149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luer Disconnect Cannula</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>72-1444</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 72-2630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermocouple Thermometer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA</td>
<td>WU-91100-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe </td>
<td>Equipment</td>
<td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td>
<td>IT-24P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oscilloscope Tektronix TDS 1002</td>
<td>Equipment</td>
<td>Tektronix Inc., Beaverton, OR 97005 USA</td>
<td>TDS 1002B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2,3-Butanedione monoxime </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma, St. Louis, MO 63132 USA</td>
<td>B0753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine HCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Hospira Inc., Lake Forest, IL 60045 USA</td>
<td>RL-0065</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Lloyd Inc., Iowa 51601 USA</td>
<td>LB15705A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E-TOXA-CLEAN&reg;</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma, St. Louis, MO 63132 USA </td>
<td>E9029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Di-8-ANEPPS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen, Carlsbad, CA 92008 USA</td>
<td>D-3167</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

optical mapping of langendorff-perfused rat hearts

Optische Abbildung der Herz-Oberfläche mit Spannungs-Fluoreszenzfarbstoffe ist zu einem wichtigen Werkzeug, um elektrische Erregung in experimentellen Modellen zu untersuchen, die Reichweite in der Skala von Zellkulturen ganzen Organe<sup&gt; [1, 2]</sup&gt;. Mit State-of-the-art optische bildgebende Systeme, Entstehung und Ausbreitung der Aktionspotentiale während des normalen Herzrhythmus oder über Einleitung und Aufrechterhaltung von Herzrhythmusstörungen können visualisiert werden fast augenblicklich<sup&gt; [1]</sup&gt;. Die neuesten im Handel erhältlichen Systeme können Informationen auf außerordentlich hohe räumlich-zeitliche Auflösungen bieten und waren auf custom-built Geräte zunächst entwickelt wurde, um die Hindernisse um mehr konventionellen elektrophysiologischen Methoden verhängt überwinden<sup&gt; [1]</sup&gt;. Fortschritte in hoher Auflösung und High-Speed-komplementäre Metall-Oxid-Halbleiter (CMOS)-Kameras und intensiv helle, Licht emittierende Dioden (LEDs) sowie spannungsabhängigen Farbstoffen, Optik und Filter haben damit begonnen, elektrisches Signal Akquisition machen praktisch für Herz-Kreislauf-Zell-Biologen, die mehr daran gewöhnt, die Arbeit mit Mikroskopen sind. Obwohl die neueste Generation von CMOS-Kameras 10.000 Frames pro Sekunde auf einem 16.384 Pixel-Array, abhängig von der Art der Probenvorbereitung erwerben können, seit langem etablierten Fluoreszenz Erwerb Technologien wie Fotodioden-Arrays, Laser-Scanning-Systeme und gekühlten Charged-Coupled Device (CCD Kameras) noch einige deutliche Vorteile in Bezug auf Dynamik, Signal-Rausch-Verhältnis und Quanteneffizienz<sup&gt; [1, 3]</sup&gt;. In der vorliegenden Studie wurden Lewis Rattenherzen perfundierten<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mit einer kristalloiden Perfusat (Krebs-Henseleit-Lösung) bei 37 ° C auf einer modifizierten Langendorff-Apparatur. Nach einer 20 minütigen Stabilisierungsphase wurden die Herzen zeitweise mit 11 mmol / L 2,3-Butandion Monoxim perfundierten zur Kontraktion-assoziierte Bewegung während der Bildaufnahme zu beseitigen. Für die optische Abbildung, luden wir Herzen mit dem schnell ansprechenden potentiometrische Sonde di-8-ANEPPS<sup&gt; [4]</sup&gt; (5 mmol / L) und kurz beleuchtet die Vorbereitung mit 475 ± 15 nm Anregungslicht. Während eines typischen 2 Sekunden Dauer der Beleuchtung, war&gt; 605 nm Licht von der kardialen Vorbereitung emittiert mit einem High-Speed ​​CMOS-Kamera angeschlossen, um eine horizontale Makroskop abgebildet. Für diese Demonstration wurden Herzen schritt bei 300 Schlägen pro Minute mit einem koaxialen Elektrode verbunden, um eine isolierte elektrische Stimulation Einheit. Gleichzeitige bipolaren elektrografischen Aufnahmen wurden erworben und zusammen mit der Spannungssignale mit leicht verfügbaren Software analysiert. Auf diese Weise können Aktionspotentiale auf der Oberfläche von Langendorff-perfundierten Rattenherzen werden visualisiert und registriert mit elektrografischen Signale.

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Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Dieser Artikel beschreibt ein hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung Technik optisch Bild Aktionspotential Bewegung auf der Oberfläche von Langendorff-perfundierten Rattenherzen mit einem potentiometrischen Farbstoff (di-8-ANEPPS).

Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

optical-mapping-of-langendorff-perfused-rat-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K Aufrufe.  Children's Hospital Boston and Harvard Medical School. Dieser Artikel beschreibt ein hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung Technik optisch Bild Aktionspotential Bewegung auf der Oberfläche von Langendorff-perfundierten Rattenherzen mit einem potentiometrischen Farbstoff (di-8-ANEPPS).

Serie: Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Richtige Pflege und Reinigung des Mikroskops

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Forschung

Biologie

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Wesentliche Komponenten des Lichtmikroskops

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phasenkontrast und Differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Semi-automatische optische Heartbeat-Analyse von kleinen Herzen

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Single Cell Fate Mapping im Zebrafisch

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Zellmarkierung und Einspritzung in Entwicklungs embryonalen Maus-Herzen

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Spannung und Calcium Dual Channel Optical Mapping von Cultured HL-1 Vorhofmuskelzellen Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Und Transmembranpotential in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herz

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.