Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH Zuschüsse R01 DK060581, R01 DK083583 (beide RGM) unterstützt.

A. Benötigte Materialien: Siehe Tabelle 1 (Reagenzien) vor der Zubereitung <ol><li> HBSS (P / S): 100 ml 10X HBSS + 900 ml H 2 0 + 1% Penicillin / Streptomycin (im Kühlschrank gelagert oder auf Eis gelagert). </li><li> 20% BSA Lager wird in Wasser hergestellt und aliquotiert und bei -20 ° C. </li><li> HBSS (BSA): 200 ml 1X HBSS (P / S) + 3 ml 20% BSA (BSA endgültige Konzentrationen von 0,3%) </li><li> Islet-Medium: RPMI + 10% FBS + 1% Glutamin + 1% Penicillin / Streptomycin </li><li> Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque 1077 + 200 ml Histopaque </li><li> 4-0 Suture (McKesson): in 2 ¾ Zoll-Stücke geschnitten und in einer 10 cm Petrischale </li><li> Instrumente: Beugen Sie die Zange von Fine Science Tools, um 90 °, und feilen Sie den gezackten Zähnen aller drei Paare der Zange. Das Ziel ist es langweilig die Zähne, nicht um sie zu entfernen. </li><li> Kanüle zur Verabreichung von Kollagenase / Protease Mischung: 27G ½ in. Nadel, 30 ½ in.Nadel, PE50 Schlauch in 12 in. Stücke schneiden. Datei beider Nadeln auf eine glatte abgerundete Ende die keine scharfen Kanten aufweist. Legen des 27G Nadel in ein Ende eines 12 Zoll Stück PE50-Schlauch. Entfernen Sie die 30G Nadel aus dem Gehäuse durch die Zerschlagung der Gehäuse mit einer Zange, Drehen des Gehäuses ¼ Drehung jeder Zeit. Entfernen Sie die Nadel mit der Zange aus dem Gehäuse und legen Sie sie in das andere Ende des PE50 Rohre unter einem Dissektionsmikroskop. Achten Sie darauf, nicht knicken Sie den Schlauch, wie Sie die Nadel legen in den PE50 Rohre. Die 27G Nadel ist das Ende, dass Sie die Spritze von Kollagenase befestigen. </li><li> Collagenase (CI zyme MA) und Neutral Protease (CI zyme BP). Lösen Sie das TDE den Anweisungen des Herstellers. Finden Sie auf der chargenspezifischen Zertifikat für Analyse, um die Enzymaktivität Konzentration zu berechnen. Übertragen insgesamt 350.000 Kollagen abbauenden Aktivität (CDA) Einheiten der rekonstituierten Kollagenase und 100.000 neutrale Protease Einheiten der reconstitausgeschüttet BP Protease in eine konische Röhre und verdünnter bis 15 ml Gesamtvolumen in HBSS (P / S) </li></ol> B. Step-by-Step-Protokoll Ein. Inflation der Bauchspeicheldrüse mit Collagenase / Protease Mischung <ol><li> Euthanize Maus durch zervikale Dislokation, sättigen die Maus Torso mit 70% EtOH, offene Bauchhöhle vollständig vom Anus bis Membran mit irgendwelchen Dissektion Schere und Pinzette. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf der Plattform eines Dissektionsmikroskop. </li><li> Ziehen Sie das Caecum und Colon ascendens aus und setzen Sie sie außerhalb der Körperhöhle zu Ihrer Linken. Siehe Abbildung 1 für eine Zusammenfassung der folgenden Schritte aus. </li><li> Positionieren der Lappen der Leber gegen das Diaphragma, sie sollten dort verbleiben, wenn die Körperhöhle offen ist weit genug. Finden Sie die Leberarterie, Pfortader und Gallengänge Bündel führt in der Leber durch Ergreifen des Duodenums mit gebogenen Pinzette. Mit einem anderen Paar von gekrümmten Pinzette unter der Arterie, Vene zu erreichen, und Kanal bundle und ziehen ein 2 ¾ in. Stück 4-0 Naht unter der Arterie, Vene, Gallengang und binden Sie es einmal und ziehen Sie es fest, wie die Leber wie möglich zu schließen. </li><li> Mit zwei Paaren gekrümmter Pinzette vorsichtig greifen den Zwölffingerdarm und finden den Gallengang an den Zwölffingerdarm an der Papille. Verwenden Sie eine Zange der Zange durch die Bauchspeicheldrüse und Bindegewebe direkt unter dem Gallengang in der Nähe der Papille stecken. Stecken Sie Ihre Pinzette schnell durch das Organ, um ein Loch zu machen und dann legte beide Zangen Zangen durch und greifen noch 2 ¾-Zoll-Stück von 4-0 Faden durch und binden Sie es einmal und ziehen Sie es auf einen kleinen Kreis, aber NICHT festziehen. </li><li> Wechseln Sie in den 90 °-Zange und den Superfine Vannas Schere. Mit den 90 ° Pinzette vorsichtig kneifen und ziehen Sie den Dünndarm bis zum Gallengang ist straff. Machen einer horizontalen Schnitt über die Papille mit der Schere von stechenden die offenen Schere in den Darm und dann das Schneiden mit einer Bewegung. Versuchen Sie, nur one geschnitten über die Papille ohne Lösen des Gallengang aus der Papille. </li><li> Halten Sie den Darm mit den 90 °-Zange, die Kanüle in den Gallengang bis zur Hälfte der Länge der Gallengang, und dann ziehen Sie den Faden fest um die Kanüle. </li><li> Füllen Sie ein 3-ml-Spritze mit 2,0 ml Collagenase / Proteasegemisch und injizieren in die Kanüle in einem langsamen, konstanten Tempo. </li><li> Nach dem Aufblasen der Bauchspeicheldrüse abgeschlossen ist, entfernen Kanüle aus Gallengang und verwenden Sie die gebogenen Pinzette und gekrümmte Feder Schere, um die aufgeblasenen Bauchspeicheldrüse ab dem absteigenden Dickdarm und Schnippeln des Bindegewebes, wie Sie den Darm ziehen zu entfernen. Weiterhin die Bauchspeicheldrüse aus dem Darm zu entfernen, bis Sie den Gallengang zu erreichen, entfernen Sie dann die Bauchspeicheldrüse aus der Milz, dann den Magen und dann aus dem Eingeweide der Bauchhöhle. Fertig Entfernen von Schnippeln entfernt die Nähte. Fügen Sie die Bauchspeicheldrüse zu einer 50-ml-Tube mit 5 ml HBSS(P / S). Dieses Rohr sollte auf Eis sein. </li><li> Wiederholen Sie den oben beschriebenen Vorgang für jedes Tier bis zu vier Tiere. Für optimale Ergebnisse distanzieren nur vier Pankreata auf einmal. Typischerweise, während die ersten vier in der 37 ° C warmen Wasserbad sind, blasen wir vier weitere Pankreata. </li></ol> 2. Pancreas Dissoziation <ol><li> Platzieren Sie die 50 ml Röhrchen mit dem Pankreas in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. </li><li> Schütteln Sie den Schlauch und überprüfen Gewebedissoziation, lesen Gewebe kommt leicht auseinander, dann wirbeln die Rohre 12 Mal, während Sie halten den Schlauch durch den Deckel. </li><li> Fügen Sie nicht mehr als 30 ml HBSS (BSA) (dies kann eine geringere Menge, je nachdem, wie viel benötigt wird, um die Rohre für den Zentrifugationsschritt auszugleichen) und Zentrifuge bei 290 xg für eine min. </li><li> Anzusaugen Überstand vorsichtig und lassen eine kleine Menge des Überstandes (2-3 ml) am Boden, um so nicht stören die Zellpellet. </li><li> Mit einem 30-ml-Spritze attached bis 14G Nadel, fügen Sie nicht mehr als 10 ml HBSS (BSA) und saugen die Aussetzung nach oben und unten 2 mal. </li><li> Filtern das Zellgemisch durch ein Kunststoffrohr Teesieb in ein 50 ml Röhrchen und spülen mit weiteren 10 ml HBSS (BSA). </li><li> Zentrifuge bei 330 xg für 2 min. </li><li> Dekantieren und invertieren Rohre auf einem saugfähigen Papiertuch für 1 min abtropfen lassen. </li><li> Resuspendieren jedes Rohr in 10 ml kaltem 1100 HISTOPAQUE. </li><li> Überlagern die HISTOPAQUE mit 10 ml HBSS (BSA) und zentrifugieren bei 900 xg für 18 min. </li><li> Entfernen Sie die gesamten 20 ml Überstand mit einer großen Bohrung 25 ml Pipette und die überstehende durch eine invertierte 70 um-Filter. </li><li> Spülen Sie die Inseln in eine 10 cm Petrischale durch Pipettieren 10 ml Insel media durch den Filter, während es rechts oben über der Schüssel. </li><li> Kultur der Inseln in einem 37 ° C, 5% CO 2 Gewebekultur-Inkubator bis bereit für Experimente. Typischerweise werden Inselchen handverlesen und zählte vor experimentation. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Islet Erträge, Morphologie und Qualität sind die allgemeinen Parameter verwendet werden, um den Erfolg der Inselisolierung beurteilen. In unseren Händen sind islet Erträge aus dem durchschnittlichen C57BL / 6 Maus im Bereich von 150-250 Inselchen dieses Protokoll verwenden (siehe Tabelle 2), und sind vergleichbar mit erhaltenen Daten mit optimierten Sigma XI Kollagenase. Allerdings können Ausbeuten variieren in Abhängigkeit von dem Mausstamm verwendet und dem Alter der Maus. Die meisten der Tiere, die wir verwenden, sind in der 8-16 Wochen Altersgruppe Dieses Protokoll auf mehreren Mausstämmen wurde getestet, darunter C57BL / 6 (180-250 Inseln / Maus), CD1 (200-300 Inseln / Maus), 129 / B6 (200-300 Inseln / Maus), BLKS-db/db (120-200 Inseln / Maus), NOD (10 Wochen alt, 100-150 Inseln / Maus) und NOD-SCID (100-150 Inseln / Maus ). Typische islet Morphologie ist in Abbildung 2 dargestellt, bei der Inselchen eine runde Gestalt mit relativ einheitlicher Größe länglich haben (obgleich Größe unif.ormity kann von Stamm zu variieren) belasten. Abbildung 3 zeigt unsere typische Analyse von Glukose-stimulierte Insulinsekretion aus C57BL / 6 Maus Inseln isoliert unter Verwendung von gereinigten TDES vs Sigma XI Kollagenase. Typischerweise wird ein hoher Qualität islet Zubereitung führt zu einer Insulinstimulation bei 25 mM Glukose, 6-20 mal größer als die mit 2,5 mM Glucose beobachtet wird. Andere Anwendungen können auch verwendet werden, um die Qualität von isolierten Inseln zu testen, und diese schließen Verwendung perifusion Techniken, Ca 2 +-Imaging (mit Fura2) und Reverse-Transkriptase-PCR, unter anderem 11. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Eine Zusammenfassung der Kanülierung der Gallengang. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Typische Erscheinungsbild von C57BL / 6 Inselchen bei 24 Stunden nach der Isolierung. Bilder wurden auf einem in erworbenenumgewandelt Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Glukose-stimulierte Insulinsekretion von C57BL / 6 Inselchen. Nach 24 h nach der Isolierung wurden 100 Inselchen in einer 12-Well-Platte für 1 h bei 37 ° C in Krebs-Ringer-HEPES-gepufferten Lösung, enthaltend 2,5 mM Glucose inkubiert. Inseln wurden dann mit Krebs-Ringer-HEPES bei 2,5 mM Glucose für eine zusätzliche Stunde, wonach der Überstand für Insulin-Messung gesammelt übertragen wurde unter Verwendung eines Two-Site immunspezifische enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA) (Kristall Chem). Dieselben Inseln wurden anschließend Krebs-Ringer-HEPES-gepufferten Lösung, die 25 mM Glucose überführt und Insulinfreisetzung in das Medium wurde durch ELISA nach 1 Stunde Inkubation gemessen.

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NDS, SAT, und RGM haben nichts zu offenbaren. Autor AGB wird durch VitaCyte beschäftigt. Autor RCM hat eine Beteiligung an VitaCyte.

Bei diesem Protokoll, haben wir unserem Verfahren zur Kanülierung, Collagenase Perfusion und Dissoziation des murinen Pankreas beschrieben, mit dem Ziel der Isolierung der Langerhans-Inseln. Technisch unserer Methode einmal gemeistert, sollte für Pankreas Isolierung innerhalb von 4 min euthanizing das Tier ermöglichen, und durch 1 Stunde sollte bei der Isolierung von Inselzellen aus einem einzigen Tier führen. Die Schnelligkeit der Technik erlaubt es uns, kleine Inseln aus bis zu 12 Mäusen in einem typischen Dehnung zu isolieren, wodurch die Isolation bis zu 3.000 Inselchen. Im Gegensatz zu anderen Protokollen, die rohen Zubereitungen von Kollagenase zu verwenden, bietet unser Protokoll die Verwendung von gereinigten Proteasen, CI Enzym Collagenase MA und CI Enzym Protease BP. Variationen in der Konsistenz von TDE Zubereitungen, die im Handel erhältlich sind, erfordert, dass jede Partie einzeln getestet und optimiert werden vor den allgemeinen Gebrauch. Diese Ware-zu-viel Variabilität führte uns zu nutzen puri betrachtenFied TDES von VitaCyte. Diese hochreinen TDES werden durch mehrere Verfahren, einschließlich der Verwendung von Fluoreszenz-markierten Substrat empfindlichen Assays charakterisiert. Die Fluoreszenz CDA Assay ist empfindlicher auf verschiedenen molekularen Formen von Kollagenase, die unterschiedliche Kinetik haben abbauenden nativen Kollagen. Historische Peptidsubstrat Assays bieten eine unvollständige Beurteilung der Kollagenase. Charakterisierung Kollagenase durch mehrere Methoden sorgt für mehr Enzymaktivität zwischen Lose. Basierend auf unseren in-house-Tests mit einer Vielzahl von Kollagenase Präparate im Handel erhältlich, fanden wir, dass die gereinigten Enzymkombinationen reproduzierbare lot-to-lot Ergebnisse erzielt. Die wichtigsten Vorteile der Verwendung von hoch gereinigten und konsequent gekennzeichnet TDES in dieser Anwendung einmal die optimale Enzymzusammensetzung definiert ist, wird das Los zu Los Leistung Konsistenz gewährleistet. Diese Konsistenz entfällt die arbeitsintensive Prozess der Partie Qualifikation normalerweise erforderlichfür Rohöl oder angereicherter Kollagenase Produkte. Gereinigtes TDES ermöglichen auch zusätzliche Modifikationen der Zusammensetzung auf den Ertrag und die Qualität der Inseln aus verschiedenen Mausstämmen wieder zu verbessern. Berichterstattung optimale Enzymzusammensetzungen zur Isolierung von Inselzellen aus verschiedenen Stämmen von Mäusen kann besser kommuniziert werden. Dies wiederum führt zu einer besseren Nutzung der Ressourcen und eine verbesserte Flexibilität in der experimentellen Design. Es gibt viele wichtige Schritte, die das Ergebnis von Insel Isolierungen mit unserem Protokoll beeinflussen können. Die erste ist die Notwendigkeit, einen wirksamen Aufblasens des Pankreas während der Perfusion der Enzymzubereitung erreicht. Es ist wichtig, um die Inflation mit sanfter Gewalt auf die Spritze zu starten, und erhöhen Sie die Kraft der Bauchspeicheldrüse aufbläst. Es ist hilfreich, um den Darm zu bewegen und heben die Bauchspeicheldrüse während der Inflation, so dass die Kollagenase durchblutet das gesamte Organ. Ein weiterer kritischer Schritt ist die Kraft, mit der ein schüttelt die Rohre after Inkubation bei 37 ° C (Schritt 2.2). Wir haben festgestellt, dass Schütteln der Bauchspeicheldrüse hart gegen die Kappe der Röhre zu einer Aufsplitterung des Inselchen, aber ohne jegliche Form von mechanischen Dissoziation bei diesem Schritt Insel Erträge drastisch sinken. Es ist auch wichtig, dass während der Dissoziationsschritt mit der Spritze (Schritt 2.5), einer mittleren Ebene Kraft während des Auf-und Abbewegung mit dem Kolben angelegt wird, das eine ausreichende Gewebedissoziation vor dem Filterschritt (2,6), bei denen sehr kleine Gewebe sollte auf dem Teesieb Filter zurückgehalten werden. Schließlich ist der letzte Schritt, um genau zu befolgen das Streben der gesamten 20 ml der HISTOPAQUE fraktionierten Inselchen. Obwohl Inselzellen sind typischerweise an der Grenzfläche des HISTOPAQUE und HBSS haben wir gefunden, dass wir, wenn wir Inselchen verlieren, nur die Schnittstelle zu entfernen versucht, sondern wir jetzt entfernen gesamten 20 ml unter Verwendung einer großen Bohrung 25 ml Pipette. Wir fügten die Filtration durch das invertierte Filter 70 um (Schritt 2.11), die Notwendigkeit zu beseitigen, centrifuge die Inseln wieder abzuwaschen dem HISTOPAQUE.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td></td><td> Katalog # </td></tr><tr><td> 10X HBSS </td><td> Life Technologies </td><td> 14065 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> jeder </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 10771 </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1119 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 11191 </td><td></td></tr><tr><td> 4-0 Naht 100 m Rolle </td><td> McKesson </td><td> 451521 </td><td></td></tr><tr><td> 14 g stumpfen Ende Nadel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-8216M </td><td></td></tr><tr><td>Vannas Superfine Sche </td><td> Fisher Scientific </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Curved Federschere </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14127 </td><td></td></tr><tr><td> Gebogene Zange (2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15914G </td><td></td></tr><tr><td> Gebogene Pinzette (bei 90 °) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11052-10 </td><td></td></tr><tr><td> 27G 1/2 Zoll Nadel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305109 </td><td></td></tr><tr><td> 30G 1/2 Zoll-Nadel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305106 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Schlauch </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427411 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase MA </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 001-2030 </td><td></td></tr><tr><td> BP Protease </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 003-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml Spritze </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml Spritze </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 70 um-Filter </td><td> Fisher Scientific </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 10 cm 2 Petrischale </td><td> Fisher Scientific </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> Plastic Teesieb </td><td> Jede Küche Versorgung </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Reagenzien und Geräte </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="510"><tbody><tr><td> Sigma XI (L010M8618) </td><td> MA (100.615) BP (110.329) </td><td> MA (081.104) BP (100.823) </td><td> MA (091.211) BP (101.109) </td></tr><tr><td> 216 (± 74) </td><td> 260 (± 45) </td><td> 157 (± 37) </td><td> 200 (± 4) </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 2. Durchschnitt islet Ausbeuten (± Standardabweichung) unter Verwendung unterschiedlicher TDE Lose * * Daten stellen Durchschnittswerte Insel Ausbeuten von mindestens 10 Mäusen. Lot Zahlen in Klammern </td></tr></tbody></table>

mouse islet of langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease

Die Vernehmung der Beta-Zellen die Genexpression und Funktion in vitro hat direkt über die Jahre aus der Studie von Nagetier tumorigenen Zelllinien zur Untersuchung von isolierten Nager Inseln verschoben. Primäre Inseln bieten den entscheidenden Vorteil, dass sie mehr getreues Bild der Biologie der intrazellulären Signalwege und sekretorischen Antworten. Während das Verfahren Inselisolierung mit gewebespezifischen dissoziierenden Enzyms (TDE) Zubereitungen ist gut in vielen Laboratorien etablierten 1-4, begrenzen Variationen in der Konsistenz von Inselzellen Ausbeute und Qualität von jedem beliebigen Stamm Nagetier das Ausmaß und die Machbarkeit der primären islet Studien. Diese Schwankungen treten häufig als Folge der teilweise gereinigten rohen TDES im Inselisolierung Verfahren verwendet; TDES zeigen häufig viel zu Charge Schwankungen in der Aktivität und erfordern oft Anpassungen der Dosis des eingesetzten Enzyms. Eine kleine Anzahl von Berichten verwendet gereinigten TDES für Nagerzelle Isolierungen 5, 6 </sup&gt;, aber die Praxis ist nicht trotz der routinemäßigen Einsatz und Vorteile von gereinigtem TDES für den menschlichen Inselzellen Isolierungen verbreitet. In Zusammenarbeit mit VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), entwickelten wir eine veränderte Maus Inselisolierung Protokoll auf, dass durch Gotoh 7, 8, in dem die TDES direkt in den Pankreasgang von Mäusen perfundiert, durch rohe Gewebe Fraktionierung durchgezogen beschriebenen Basis einen Histopaque Gradienten 9 und Isolierung des gereinigten Inselchen. Ein signifikanter Unterschied in unserem Protokoll ist die Verwendung von gereinigten Collagenase (CI Enzym MA) und neutrale Protease (CI Enzym BP) Kombination. Die Collagenase wurde durch die Verwendung eines 6-Fluoreszenz Kollagen abbauenden Aktivität (CDA)-Assay, Fluoreszenz-markierten löslichen Kalbshaut Fibrillen als Substrat 6 Verwendete ist. Dieses Substrat ist prädiktiven der Kinetik der Kollagen-Abbau in der Gewebe-Matrix, da es auf natives Kollagen setzt als Substrat. Die Protease war characterized mit einem Fluoreszenzfarbstoff kinetischen Assay 10. Mit Hilfe dieser verbesserten Assays zusammen mit mehr traditionellen biochemischen Analyse ermöglichen die TDE konsequenter hergestellt werden, was zu einer verbesserten Leistung Konsistenz zwischen Lose. Die hier beschriebene Protokoll wurde für maximale Ausbeute und Inselzellen optimale islet Morphologie mit C57BL / 6 Mäuse optimiert. Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurden mehrere Kombinationen von Kollagenase und neutrale Proteasen bei verschiedenen Konzentrationen untersucht, und die endgültige Verhältnis von Collagenase: neutralen Protease von 35:10 darstellt Enzymleistung vergleichbar Sigma Typ XI. Da signifikante Variabilität im Durchschnitt Insel Erträge aus verschiedenen Stämmen von Mäusen und Ratten berichtet worden, sollten zusätzliche Modifikationen der TDE Zusammensetzung hergestellt, um den Ertrag und die Qualität von Inseln aus verschiedenen Arten und Stämme wieder zu verbessern.

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Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Eine detaillierte Beschreibung der Maus Inselisolierung wird beschrieben unter Verwendung der Technik der in situ-pankreatischen duktalen Kanülierung und Perfusion einer Kombination von gereinigten Collagenase und neutralen Protease.

Maus Islet der Langerhans Isolation durch eine Kombination von gereinigtem Collagenase und Neutral Protease

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

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Research

JoVE Journal

Biology

43.2K Aufrufe.  Indiana University School of Medicine. Eine detaillierte Beschreibung der Maus Inselisolierung wird beschrieben unter Verwendung der Technik der in situ-pankreatischen duktalen Kanülierung und Perfusion einer Kombination von gereinigten Collagenase und neutralen Protease.

Serie: Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Murine Pancreatic Islet Isolation

Murine Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation

Forschung

Biologie

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part II: Reinigung und Kultur der Menschenrechte Islets

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

Isolation of Primary Maus Trophoblastzellen und Trophoblastinvasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolierung von Primär Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

Isolierung von humanen Hepatozyten durch eine Zwei-Schritt-Verfahren Collagenase Perfusion

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Bestimmen Membrane Protein Topologie Mit Fluorescence Protease Schutz (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...