Ziel dieser Forschung ist es, unser Verständnis der Rolle der Pankreasgefäße sowohl in der normalen Pankreasbiologie als auch in der Krankheitsentwicklung zu vertiefen. Durch die erfolgreiche Anreicherung der Endothelfraktion versuchen wir, spezifische Signalwege innerhalb des Gefäßsystems zu identifizieren, die die Pankreasfunktionen steuern, die möglicherweise zur Wiederherstellung und Verbesserung der Pankreasfunktionen in Krankheitsumgebungen eingesetzt werden können. In jüngster Zeit rückt die Rolle der Endothelzelldysfunktion bei Pankreaserkrankungen zunehmend in den Vordergrund.
Die Identifizierung der Heterogenität der Endothelzellpopulationen in der Bauchspeicheldrüse hat es ermöglicht zu verstehen, wie endotheliale Pankreasinteraktionen Krankheiten anstreben oder vor ihnen schützen. Omics-Ansätze wie Einzelzell- oder Einzelkern-RNA-Sequenzierung, Proteomik und Genomik werden eingesetzt, um die Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Um Erkenntnisse auf Gewebe- oder räumlicher Ebene zu gewinnen, werden neue Plattformen mit unvoreingenommenen und sondenbasierten Ansätzen wie Visium und Xenium implementiert.
In diesem Protokoll beschreiben wir eine sanfte Dissoziationstechnik, die endogene Pankreasenzyme daran hindert, die Lebensfähigkeit der Zellen zu verringern, und ein magnetisches Zellsortierverfahren, um Endothelzellen selektiv anzureichern. Die Dissoziations- und Anreicherungsstrategie unseres Protokolls wird ein weiteres Verständnis sowohl der Zelloberflächenmarker als auch des Transkriptoms von Endothelzellen der Bauchspeicheldrüse ermöglichen, das bisher aufgrund technischer Einschränkungen nur unzureichend erforscht war. Positionieren Sie zunächst die euthanasierte Maus auf dem Operationstisch.
Strecken Sie die Gliedmaßen der Maus und sichern Sie sie mit Stecknadeln. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen kleinen Schnitt durch die Haut und das Bauchfell vom unteren Bauchbereich aus und erstrecken Sie sich in Richtung Brustregion. Schneiden Sie durch das Zwerchfell und heben Sie den Brustkorb an, um das Herz freizulegen.
Führen Sie eine Nadel von 25 bis 30 Gauge, die mit einer Spritze verbunden ist, die eiskaltes, steriles PBS enthält, in den linken Ventrikel des Herzens ein. Perfusionieren Sie das Herz mit einer Geschwindigkeit von fünf bis 10 Millilitern pro Minute und hören Sie nach der Injektion von 10 Millilitern auf. Ziehen Sie dann mit einer Präparierschere und einer Pinzette vorsichtig die Bauchspeicheldrüse heraus.
Übertragen Sie die Bauchspeicheldrüse in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern eiskaltem PBS zusammen mit dem Trypsin-Inhibitor und legen Sie das Röhrchen auf Eis. Zu Beginn wird die murine Bauchspeicheldrüse in einer Petrischale mit eiskaltem PBS gewonnen. Entfernen Sie mit einer chirurgischen Schere und einer Pinzette vorsichtig überschüssiges Gewebe.
Übertragen Sie die getrimmte Bauchspeicheldrüse in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter Dissoziationslösung. Zerkleinern Sie das Bauchspeicheldrüsengewebe mit einer Präparierschere in feine Stücke und halten Sie die Röhre auf Eis. Übertragen Sie das Lysat in ein 50-Milliliter-Röhrchen, das auf Eis gestellt wird.
Geben Sie zwei Milliliter Kollagenaselösung in das Fünf-Milliliter-Röhrchen, um restliches Bauchspeicheldrüsengewebe zu entfernen, und übertragen Sie es in das 50-Milliliter-Röhrchen. Inkubieren Sie das Röhrchen 20 Minuten lang in einem bei 37 Grad Celsius temperierten Wasserbad. Legen Sie das Röhrchen mit dem Gewebehomogenat auf Eis und lassen Sie es durch die Schwerkraft absetzen.
Dann wird der Überstand durch einen 70-Mikrometer-Filter geleitet und fünf Milliliter Dissoziationsstopplösung hinzugefügt. Zerreiben Sie das restliche Pellet mit einer 27-Gauge-Nadel mit einem zusätzlichen Milliliter Dissoziationslösung und passieren Sie es wie zuvor durch den Filter. Schleudern Sie die Zellsuspension bei 300 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Waschpuffer.
Inkubieren Sie eins mal 10 hoch sieben Zellen mit einem Mikroliter Anti-CD31-Biotin-Antikörper auf einem Rotator. Fügen Sie 20 Mikroliter Anti-Biotin-MicroBeads hinzu und inkubieren Sie weitere 40 Minuten. Stellen Sie dann einen Magnetständer mit dem Säulentrennerhalter auf und setzen Sie die Säule auf.
Nachdem Sie die Säule äquilibriert haben, geben Sie die Probe hinzu und waschen Sie mit insgesamt neun Millilitern Waschpuffer. Nehmen Sie die Säule aus der Halterung und legen Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie fünf Milliliter Waschpuffer in die Säule.
Drücken Sie mit einem Kolben die Zellen in der Säule nach unten, um das Elution mit den Endothelzellen zu sammeln. Zum Schluss schleudern Sie die Durchfluss- und Elutionsfraktionen herunter. Zählen Sie nach dem Resuspendieren die Zellen und messen Sie die Lebensfähigkeit.
Quantitative PCR-Analysen zur Validierung der Anreicherung von Endothelzellen zeigten, dass die angereicherten Fraktionen im Vergleich zu den Durchflussproben signifikant höhere Spiegel an Markergenen, Pecam1 und Kdr, aufwiesen. In den angereicherten Fraktionen wurde ein niedrigerer Gehalt an NK6-Homöobox 1, einem Transkriptionsfaktor in den endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse, beobachtet. Western Blot zeigte starke Signale von CD31 in der erwarteten Größe, was die Anreicherung der Endothelzellen in den Fraktionen weiter bestätigt.
