Hier demonstrieren wir unser Protokoll der primären Sinuszellenisolierung der Leber der Maus oder der LSECs-Isolierung. Das Protokoll besteht aus Leberkollagenase-Perfusion und Low-Speed-Ultrazentrifugation für die nicht-parenchymale Zellreinigung und CD146-Magnetperlenauswahl. Unsere LSEC-Isolationsmethode ist hocheffizient und auf gesunde und kranke Mausleber anwendbar.
Die isolierten LSECs weisen eine hohe Reinheit auf und bewahren die Struktur und Funktion. Mit diesem Protokoll isolierte LSECs sind optimal für funktionelle und molekulare Studien und die Generierung von Multi-Omics-Daten. Dieses Protokoll wird hilfreich sein, um die interzelluläre Kommunikation in der Leber zu untersuchen.
Beginnen Sie mit der Beschichtung von 10 Zentimeter Kulturschalen mit drei Millilitern Kollagenlösung. Dann inkubieren Sie das Geschirr bei Raumtemperatur für eine Stunde. Entfernen Sie nach einer Stunde die überschüssige Flüssigkeit von der beschichteten Oberfläche.
Waschen Sie das Geschirr dreimal mit PBS und lassen Sie es an der Luft trocknen. Richten Sie die beheizte und befeuchtete zirkulierende Perfusionsvorrichtung ein. Spülen Sie das Perfusionssystem fünf Minuten lang mit 10% Bleichmittel.
Spülen Sie das System dann erneut mit sterilem Wasser für weitere 10 Minuten ab. Lassen Sie die Spülflüssigkeit so weit wie möglich abtropfen, bevor Sie sie mit Kollagenaselösung durchbluten. Infundieren Sie die Kollagenaselösung durch das Perfusionssystem, um sie auf 37 Grad Celsius vorzuwärmen.
Stellen Sie die Pumpenrate auf Geschwindigkeit eins auf dem Drehzahlregler ein. Halten Sie die Geschwindigkeit während des gesamten Vorgangs gleich. Wiegen Sie die Maus für den Eingriff.
Befestigen Sie es dann an der Operationsoberfläche. Besprühen Sie den Mausbauch mit 70% Ethanol. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt von etwa fünf Zentimetern, beginnend mit dem unteren Teil des Abdomens bis zum Xiphoid-Prozess.
Danach machen Sie zwei seitliche Schnitte mit einer kleinen Irisschere auf jeder Seite des Abdomens, um die Bauchorgane vollständig freizulegen. Legen Sie die Scheide des IV-Katheters unter den Rücken des Tieres, um den Bauch anzuheben und zu nivellieren. Ziehen Sie mit einer normalen gebogenen Verbandszange den Darm und den Magen vorsichtig links vom Tier ab.
Legen Sie dann eine chirurgische 5-0-Naht unter die untere Hohlvene oder IVC, direkt unter der freiliegenden linken Niere. Binden Sie eine lose Kupplung in die Naht. Als nächstes legen Sie eine weitere 5-0-chirurgische Naht um die Leberpfortader.
Platzieren Sie die Naht direkt über dem Verzweigungspunkt der Milzvene der Leberpfortadere. Binden Sie wieder eine lose Kupplung in die Naht. Führen Sie den 20-Gauge-IV-Katheter mit der Pfortader als Spannung in die Leberpfortader ein, einen Zentimeter darunter, wo er sich zur rechten und linken Leberpfortader verzweigt.
Schieben Sie dann den Katheter die Vene hinauf, aber halten Sie ihn unter dem verzweigten Bereich. Lassen Sie das Blut den Katheter hinunterwandern, bis es heraustropft. Sichern Sie den IV-Katheter mit der Pfortadernähte.
Verwenden Sie eine IV-Leitung, um eine IV-Flasche mit Puffer A am Katheter zu befestigen. Dann spülen Sie die Leber mit dieser Lösung, während Sie den Lufteintritt in das System vermeiden. Binden Sie die Naht um den IVC unterhalb der Niere ab.
Danach schneiden Sie die IVC unter die Naht, damit das Tier ausbluten kann. Nach dem Durchsickern schneiden Sie Magen, Darm, Milz und andere an der Leber befestigte Eingeweide weg. Schneiden Sie dann das Zwerchfell und die Hauptgefäße aus der Brusthöhle ab.
Entfernen Sie die Leber vom Tier und legen Sie sie auf die Perfusionsschale. Entfernen Sie vorsichtig die IV-Leitung und schließen Sie die Kollagenaselösung in der Umwälzkammer an. Lassen Sie die Leber durchbluten, bis die Kapsel modelliert wird und matschig erscheint.
Dies sollte in der Regel 10 bis 15 Minuten dauern. Nach der Verdauung die Leber aus der Kammer nehmen und auf eine 10 Zentimeter große Petrischale mit etwa 20 Millilitern serumfreiem DMEM legen. Nehmen Sie die Leber vorsichtig mit ein paar Pipettenspitzen auseinander und entsorgen Sie den Gallenbaum.
Danach filtern Sie die Lebersuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in einen 50-Milliliter-Konusschlauch. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 50 mal G für zwei Minuten bei Raumtemperatur. Dann sammeln Sie den Überstand, der nicht-parenchymale Leberzellen enthält.
Zentrifugieren Sie den Überstand bei 300 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Danach sammeln Sie das Zellpellet und suspendieren es in einem Milliliter Isolationspuffer. Ermitteln Sie die Zellennummer anhand eines automatischen Zellzählers gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellsuspension. Saugen Sie den Überstand vollständig ab und suspendieren Sie das Pellet mit 90 Mikrolitern Isolationspuffer pro 10 Millionen Zellen. Fügen Sie 10 Mikroliter CD146 MicroBeads pro 10 Millionen Gesamtzellen hinzu.
Gut mischen und 15 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Um die Zellen zu waschen, fügen Sie ein bis zwei Milliliter Isolationspuffer pro 10 Millionen Zellen hinzu. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 300 mal G für 10 Minuten.
Danach den Überstand vollständig absaugen und bis zu einer Milliarde Zellen in 500 Mikrolitern Isolationspuffer resuspendieren. Als nächstes bereiten Sie die Trennsäule vor, indem Sie sie mit drei Millilitern Isolationspuffer spülen. Tragen Sie die Zellsuspension auf die Säule auf, die mit 70-Mikrometer-Vorabscheidefiltern gestapelt ist.
Waschen Sie die Säule dreimal mit drei Millilitern Isolationspuffer. Danach entfernen Sie die Säule aus dem Separator und legen Sie sie auf ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Pipette fünf Milliliter Isolationspuffer auf die Säule.
Um die magnetischen, mit Perlen markierten Zellen wiederherzustellen, drücken Sie den Kolben fest in die Säule, um die Zellen auszuspülen. Zum Schluss zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Isolierte LSEC-Reinheits- und Oberflächenmarker wurden mit Durchflusszytometrie bewertet.
Datenanalyse und Gating-Strategie für Gated LSECs und Singulette basieren auf Vorwärtsstreu- und Seitenstreudaten. Isolierte LSECs wurden mit einem Viability-Farbstoff und einer Kombination aus CD45-, CD146- und Stabilin-2-Antikörpern angefärbt. Lebensfähige LSECs wurden auf CD45-negative Population ausgerichtet und auf CD146- und Stabilin-2-Expression analysiert.
Aus diesen Daten wurde bestätigt, dass die isolierten GVECs eine Lebensfähigkeit von mehr als 94 % und eine Reinheit von mehr als 90 % aufwiesen. Der LSEC-spezifische Phänotyp der isolierten Zellen wurde mittels Lichtmikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie weiter bestätigt. Isolierte LSECs wurden sechs Stunden lang im gesamten Wachstumsmedium kultiviert und lichtmikroskopisch untersucht.
Die weißen Pfeile im REM-Bild weisen auf LSEC-Fenestrae hin, was ein charakteristisches morphologisches Merkmal von LSECs ist. Die kritischen Schritte, um eine vollständige Durchblutung eines Lebergewebes sicherzustellen, sind die richtige Positionierung des Katheterbandes, die Vermeidung der Einführung von Luft in den Katheter und der optimale Zeitpunkt der Kollagenase-Verdauung. Qualitativ hochwertige LSEC, die mit unserem Protokoll erworben wurden, erleichtern die Identifizierung des molekularen Mechanismus der LSEC-Funktion und verbessern unser Verständnis ihrer Rolle bei der interzellulären Kommunikation in der Leber, in der Gesundheit und bei Krankheiten.
