Die Isolierung in der phänotypischen Analyse von Immunzellen aus dem Darm mit diesem Protokoll haben sich als anwendbar auf das Verständnis von GI und systemischen entzündlichen Störungen erwiesen. Diese Methode isoliert eine signifikante Anzahl lebensfähiger mononukleischer Zellen, indem sie kontaminierende Trümmer minimiert, die eine nachfolgende Immun-Phänotypisierung durch Fleurs Atomistry oder andere Methoden ermöglichen. Da der Darm ein wichtiger Zielort für Entzündungen bei vielen Krankheiten ist, kann dieses Protokoll für die Untersuchung von Darmimmunpopulationen in Mausmodellen von Krebs, Allergie, Transplantation und Autoimmunität nützlich sein.
Um die Ausbeute und Effizienz dieses Protokolls zu optimieren, wird empfohlen, dass wichtige Lösungen und Materialien wie bereits erwähnt im Voraus vorbereitet werden. Nach dem Einschläfern der Maus und einem vertikalen Mittellinienschnitt verwenden Sie eine feine Sezierschere, um das Peritoneum zu öffnen. Bewegen Sie den kleinen Darm mit Zangen zur Seite und legen Sie den absteigenden Dickdarm aus.
Ziehen Sie leicht nach oben auf dem absteigenden Doppelpunkt, um den rektalen Teil des Dickdarms maximal freizulegen. Schneiden Sie dann das distale Rektum tief im Becken und sezieren Sie den gesamten Dickdarm als eine Einheit vom distalen Rektum bis zur Cecal-Kappe. Legen Sie zunächst den Dickdarm auf ein befeuchtetes Papiertuch und verwenden Sie das stumpfe Ende einer Schere oder Zange, um leichten Druck auf die Darmwand auszuüben und den festen Stuhl zu extrahieren.
Als nächstes legen Sie den Dickdarm in eine Petrischale und verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 18-Spur stumpf gefüllten Nadel, um den Darm mit 10 Millilitergekühlten Dickdarmpuffer zu spülen. Legen Sie den Doppelpunkt in eine Petrischale gefüllt mit 5-10 Milliliter gekühlten Dickdarmpuffer und agitieren manuell, um den restlichen Koloninhalt zu waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche 2-3 Mal, mit einer neuen Petrischale mit frischem Puffer für jede Wäsche.
Danach den Dickdarm in eine neue Petrischale mit frisch gekühltem Dickdarmpuffer übertragen. Schneiden Sie den Dickdarm längs von seinem muskulöseren rektalen Ende zum proximalen Dickdarm, um ein einzelnes rechteckiges offenes Doppelpunktstück zu erzeugen. Entsorgen Sie den Median in der Schale und ersetzen Sie ihn durch einen sauberen gekühlten Dickdarmpuffer.
Legen Sie das rechteckige Doppelgewebe auf ein Papiertuch, das mit Einem Dickdarmpuffer befeuchtet ist, und schneiden Sie es, indem Sie es horizontal und dann in kleine Fragmente schneiden. Verwenden Sie feine Zangen, um die Doppelpunktfragmente in einem 50 Milliliter Polypropylen konischen Rohr mit 20 Milliliter gekühlten Dickdarmpuffer zu sammeln. Dann waschen Sie die Fragmente, indem Sie das Rohr 30 Sekunden lang kräftig wirbeln.
Nach dem Waschen, lassen Sie die Gewebefragmente auf den Boden des Rohres vor der Dekantierung oder Vakuum Aspirating des Überstandes, Achten Sie darauf, den Verlust von Gewebefragmenten zu vermeiden, wiederholen Sie diesen gesamten Waschvorgang 3 Mal mit frischem Dickdarmpuffer für jede Wäsche. Zunächst fügen Sie 20 Milliliter Kollagenase-Verdauungspuffer in die Röhre mit den gewaschenen Doppelpunktfragmenten ein. Versiegeln Sie das Rohr und legen Sie es in einem Orbital-Shaker bei 37 Grad Celsius mit einer Rotationsrate von 2 mal G für 60 Minuten.
Stellen Sie sicher, dass die Gewebefragmente während der Agitation in ständiger Bewegung sind. Gießen Sie zunächst 5 Milliliter 66%Silica-basierte Dichtetrennmedien in jedes von 3 separaten 15 Milliliter Polypropylen-Röhren. Als nächstes verwenden Sie eine 25 Milliliter serologische Pipette, um nur den Überstand aus Collagenase Digestion 1 zu sammeln.
Filtern Sie den Überstand durch ein 40 Mikroliter armes Filtrationsgewebezellensieb, das in ein sauberes 50 Milliliter Polypropylen-Konusrohr gelegt wird. Füllen Sie das Rohr vollständig mit gekühlten Dickdarmpuffer, um den Kollagenase-Verdauungspuffer zu löschen. Dann drehen Sie die Zellen, aspirieren Sie den Überstand, und halten Sie das Pellet auf Eis.
Führen Sie die Collagenase Digestion 2 wie im Textprotokoll beschrieben weiter. Nachdem Collagenase Digestion 2 abgeschlossen ist, spülen Sie die Gewebefragmente kräftig zwischen dem Rohr und einer 10 Milliliter Spritze durch eine 18-Spur stumpfe Endnadel. Wiederholen Sie diese Spülung für mindestens 7-8 Passagen, so lange, bis keine groben Gewebefragmente oder Debri sichtbar sind.
Als nächstes passieren Sie die Gewebedisaggregationsuspension durch ein 40 Mikrometer armes Filtrationsgewebe Zellsieb, das in ein sauberes 50-Milliliter-Polypropylenrohr gelegt wird. Füllen Sie das Rohr bis zum Rand mit gekühlten Dickdarmpuffer, um die Verdauung und Zentrifuge bei 800 mal G in bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten zu löschen. Entsorgen Sie den Überstand über Vakuumaspiration und ziehen Sie das aufgehängte Pellet von Collagenase Digestion 1 in das entsprechende Rohr.
Danach setzen Sie jedes Pellet in 24 Milliliter n.G. 44% Auf Kieselsäure basierende Dichtetrennungsmedien pro Dickdarm wieder aus. Verwenden Sie eine 10 Milliliter serologische Pipette, um langsam 8 Milliliter dieses Mediums auf jedes der 3 Röhren zu schichten, die 66% Silica-basierte Dichtetrennmedien enthalten. Balancieren Sie die Rohre in Zentrifugenschaufeln sorgfältig mit einer Waage oder einem Gleichgewicht.
Zentrifuge bei 859 mal G in bei 20 Grad Celsius für 20 Minuten ohne Pause. Lassen Sie die Roder s, um ruhe zu kommen, bevor Sie Rohre entfernen, wobei darauf zu achten ist, dass die Zellen an der Gradientenschnittstelle nicht gestört werden. Visualisieren Sie zunächst die Gradientenschnittstelle in der Nähe der 5-Milliliter-Marke, wo in der Regel ein 1-2 Milliliter dickes weißes Band vorhanden ist.
Vakuum-Aspirat und entsorgen Sie die oberen 7 Milliliter des Farbverlaufs, um einen einfacheren Pipettenzugriff auf die Schnittstelle zu ermöglichen. Mit kontinuierlicher manueller Absaugung und stetig rotierender Handgelenkbewegung, sammeln Sie die Schnittstellenschicht der Zellen. Sammeln, bis die Schnittstelle zwischen den beiden Gradienten klar und reraktil ist und übertragen Sie die Schnittstelle auf ein neues 50 Milliliter Polypropylen konisches Rohr.
Als Nächstes fügen Sie FACS Buffer zu dieser Wanne hinzu, bis die Gesamtsuspension 50 Milliliter erreicht. Zentrifuge bei 800 mal G in bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten. Dann aspirieren Sie den Überstand über Vakuumaspiration und setzen Sie das Pellet in 1 Milliliter FACS Buffer wieder auf.
Das in diesem Video beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um mononukleäre Zellen aus dem Dickdarm oder, mit Modifikationen, aus dem Dünndarm zu isolieren. Darüber hinaus wird Zytometrie und Datenanalyse durchgeführt, um die Fraktionen von apoptotischen und nekrotischen/toten Lymphozyten zu vergleichen, wenn entweder Collagenase E oder D für die Isolierung verwendet wird, mit unserer Behandlung ohne DNAse 1. Nach Annexin 5 und fixierbarer lebender blauer Farbstofffärbung auf einzelzelligen Suspensionen nach jeder Isolierung zeigte Collagenase E ohne DNAse einen signifikant höheren Anteil an lebenden Zellen nach Isolation im Vergleich zu Collagenase D ohne DNAse.
Auch im Vergleich zu einer Kollagenase mit DNAse. Darüber hinaus identifizierten wir nekrotische Zellen mit einem medianen Prozentsatz von 41,0% in der Gruppe Collagenase E gegenüber 90,0% in der Gruppe Collagenase D. 75,9% in der Gruppe Collagenase E DNAse und 80,3% in der Gruppe Collagenase D DNAse.
Die multiperimetrische Durchflusszytometrie wird dann am 7. Tag nach Erhalt von BMT- oder allogenen oder syngenischen BMT-Modellen auf MNC angewendet, die von CD45.2-Ventil-C-Empfängermäusen isoliert wurden. Die durchschnittliche absolute Anzahl der Spender-CD4-positiven und CD8-positiven T-Zellen, die aus dem Doppelpunkt des BMT-Empfängers extrahiert wurden, werden berechnet und verglichen. So kann es wichtig sein, seltene Immunzellpopulationen in solchen Mausmodellen zu identifizieren und/oder zu quantitieren.
Seltene Teilmengen, einschließlich von Spendern abgeleiteter FOX-P3-positiver T-Regulierungszellen, werden sowohl in syngenem als auch in allogenen BMT-Modellen bewertet. Mit dieser Methode können selbst seltene Teilmengen, wie z. B. spenderabgeleitete Darm-T-Regulierungs-Infiltrierende Empfängermaus-Doppelpunkte nach BMT, analysiert werden. Es sollte beachtet werden, dass Collagenase E bei 37 Grad Celsius aktiv ist.
Daher sollten alle Kollagenase-Lösungen für eine angemessene Kollagenase-Aktivität vorgewärmt und gründlich abgeschreckt werden, um die Aktivität zu beenden. Dieses Protokoll ermöglicht eine große Anzahl von mononukleären Zellen, die für die nachfolgende Charakterisierung durch eine Fleur-Zytometrie, molekularbiologische Techniken, Mikroskopie, Kultur und Ort von unter anderem verwendet werden können. Dieses Protokoll lieferte eine zuverlässige Beurteilung der Entzündung im Dickdarm von experimentellen versus kontrollierten Mäusen in einem Knochenmarktransplantationsmodell.
So erleichtert die Entdeckung neuer regulatorischer Immunmechanismen der Transplantationstoleranz. Kollagenase von Clostridium Istoliticum ist ein Reagenz, das mit Laborsicherheitstechniken behandelt werden sollte. Es stellt eine Gesundheitsgefährdung beim Einatmen dar und kann Haut- und Augenreizungen verursachen.
