Diese Forschung wurde teilweise durch die Intramural Research Program des NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) und dem Fanconi Anemia Research Fund unterstützt.

1. Herstellung von Dig-TMP <ol><li> Mische 50 mg (0,18 mmol) 4&#39;-Chlormethyl-4,5&#39; , 8-Trimethylpsoralen und 590 mg (2,7 mmol) 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanedi-amin in einem trockenen 25 ml Rund -bottom Kolben unter Stickstoff. Zugabe von 10 ml Toluol und Rückfluss für 12 h. Entfernung des Lösungsmittels in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck. <ol><li> Reinige den Rückstand durch Flash-Säulenchromatographie über Kieselgel. Eluieren der Säule mit Chloroform, Methanol und 28% iger Ammoniaklösung (9: 1: 0,5). Dampfe das Lösungsmittel in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck und erholen das reine 4 &#39;- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5&#39;, 8-trimethylpsoralen als ein hellgelbes viskoses Flüssigkeit. </li><li> Mischen 5,5 mg (0,012 mmol) 4 &#39;- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5&#39;, 8-trimethylpsoralen mit 5 mg (0,008 mmol) Digoxigenin-NHS-Ester in ein trockener Rundkolben unter Stickstoff gegeben. 0,5 mL wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) eind 3,4 &amp; mgr; L Trimethylamin zugegeben und bei 50 ° C für 18 Stunden. </li><li> Entfernung des Lösungsmittels in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck. </li><li> Löse den Rückstand in einer minimalen Menge Dichlormethan. Geben Sie die Lösung in 2 ul spots horizontal über den Boden einer präparativen Dünnschichtplatte mit Kieselgel als stationäre Phase. Führen des präparativen TLC in Chloroform: Methanol: 28% Ammoniumhydroxid (8: 1: 0,1). </li><li> Maskiert die Platte mit Ausnahme der vertikalen Kanten und identifizieren, die Band des Produkts mit kurzwelligem UV-Lampe 254 nm. Schabt das Produkt von der Platte mit einem Spatel und isolieren, um das reine Produkt mit Chloroform: Methanol: 28% Ammoniumhydroxid (8: 1: 0,1) -Mischung. </li><li> Entfernen Lösungsmittel in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck. Man löst die verbleibenden Pellets in 1 ml 50% EtOH: H 2 O, verzichtet werden in 50 ul - Aliquots in 1,5 - ml - Röhrchen (~ 20 Aliquots) und trocken in einem Zentrifugalverdampfer , bis das gesamte Lösungsmittel verdampft (~ 3 h). </li><li>Wieder aufzulösen jedes Aliquots in 200 ul 50% EtOH: H 2 O und wieder trocken in einem Zentrifugalverdampfer. Man löst jedes Aliquot wieder in 200 ul 50% EtOH: H 2 O, trocken in einem Zentrifugalverdampfer und speichert Pellets bei -20 ° C zur Langzeitlagerung. </li></ol></li><li> Zur Verwendung lösen sich die Pellets in 50 ul 50% EtOH: H 2 O ein 1 Bereiten: 100 - Verdünnung des gelösten Dig-TMP in H 2 O und OD bei 250 nm messen. Der Extinktionskoeffizient von Dig-TMP ist 25.000. Die Lösung ist für etwa einen Monat stabil , wenn bei -20 ° C gelagert. Überprüfen der Konzentration von OD bei 250 nm vor jeder Verwendung zu messen. <ol><li> Berechnen Stammkonzentration: Abs x 100 x 10 6 / 25.000 = Konzentration (in um). Typischerweise wird die Stammlösung etwa 3 mm. Es ist wichtig, in diesem Bereich zu sein, um das Volumen des EtOH zu dem Medium gegeben zu minimieren. </li></ol></li></ol> 2. Laser Lokalisierte Dig-TMP ICLs <ol><li> Perform Laser Lokalisierung mit einem konfokalen Mikroskop mit einem SRS Stickstofflaser (337 nm) gepumpt wird durch eine Farbstoffzelle eine Linie von 365 nm und Brennen 3 ns-Impulse bei 10 Hz, mit einer Leistung von 0,7 nW emittieren. </li><li> Macht eine vertikale Markierung auf der Seite eines 35 mm Glasboden-Zellkulturschale mit einem Markierungsstift. Zerkratzen ein Kreuzes in der Mitte des Glases auf der Kulturfläche mit einem Diamantstift, so daß die schwarzen Streifen auf der Seite der Schale ist an der Spitze eines Arms des Kreuzes. Das Kreuz wird auf der Wachstumsoberfläche des Glases markiert, so dass sie und die Zellen in der gleichen Brennebene sein werden. </li><li> Sterilisieren die Platte mit einer Spülung von 70% EtOH nach der Markierung. Trockene, bevor die Zellen Plattierung. </li><li> Plattenzellen (Standard-Laborstämme wie HeLa oder U2OS) im Kreuz markierten Kulturschalen einen oder zwei Tage vor. Zelle sollte aktiv werden zu teilen und 50-70% konfluent am Tag des Experiments. Inkubiere 24 h mit 1 &amp; mgr; M 5-Chlor-2-desoxyuridin (CldU) gleichmäßig Etikett DNA. </li><li> HinzufügenDig-TMP in 50% EtOH: H 2 O zu Zellkulturmedium bis zu einer Endkonzentration von 20 uM. Bringen des Mediums auf 37 ° C. Ändert das Medium über die Zellen und im Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 30 min dem Dig-TMP äquilibrieren zu ermöglichen. </li><li> Während die Zellen werden inkubiert, schaffen, die x / y-Koordinaten des Sichtfeldes, in dem der Laser aktiv ist. Folgen Sie den Kalibriervorgang des Herstellers, in dem der Laser durch die Software gerichtet ist eine verspiegelte Glasobjektträger entlang einer horizontalen und diagonalen Linie zu ätzen. Die beiden Linien definieren die Grenzen des Feldes, in dem der Laser ein Ziel treffen kann. </li><li> Die Platte wird in der Klimakammer bei 37 ° C mit einem kontrollierten CO 2 und Feuchtigkeit, auf dem Mikroskoptisch und Fokus mit dem 60X Öl Ziel auf dem Schnittpunkt des Kreuzes. </li><li> Direkte den 365 nm-Laserstrahl zu einem ROI, der durch den Untersucher mit dem Form-Werkzeug in der Software, um einen Streifen von 3 &amp; zu bilden# 181; mx 0,6 um. Der Umriss des ROI wird durch die Cursor in den Kernen von Zellen in der unmittelbaren Nähe der Kreuzung des Quer gelegen angeordnet. Stellen Sie die z Brennebene des Lasers auf halbem Wege durch den Zellkern zu zielen. Verwenden eines Lasers im Bereich von 350-370 nm. 405 nm - Laser kann nicht - Vernetzungen 19 induziert. HINWEIS: Wir finden die ROI in nukleoplasmatischen Bereiche außerhalb der Nukleoli, die aus Nukleoplasma in differentieller Interferenzkontrast (DIC) -Bildgebung unterschieden werden können. </li><li> Stellen Sie sicher , den Fokus und die Aktivität des Lasers durch die Leistungseinstellung auf ein Niveau zu erhöhen ausreicht , um eine Zelle zu tilgen (die Zelle wird verdunkeln und dann verschwinden). Dies ist ein wichtige diagnostische für einen ungehinderten Lichtpfad für den Laser durch das Mikroskop und dann durch das Deckglas und in die Zellen. <ol><li> Senken Sie die Leistungseinstellung auf gerade genug, um die Psoralen und die ICL induzierte DDR zu aktivieren (dies empirisch für jeden Laser / Mikrofon bestimmt werden muss,ROSCOPE Kombination). Verwenden Sie eine Laserintensität einstellen (1,7% hier), die nicht die DDR in Abwesenheit von Psoralen nicht aktiviert (überwacht durch die Bildung von γ-H2AX). ANMERKUNG: Dies ist eine wichtige Feststellung, und die Einstellungen können eine Einstellung erfordern, wenn die Laserquelle oder eine Komponente in dem Lichtpfad geändert wird. Folgen Sie die Anhäufung von GFP-Reparaturproteine ​​getaggt wie XPC oder FAN1, welche beide rasch rekrutiert werden (in Sekunden) an den Laser Psoralen Streifen, aber nicht allein den Laser ausgesetzt, um den ROI. Einige Proteine ​​der DDR erscheinen innerhalb von Sekunden, während mehrere Minuten können für andere erforderlich sein. Es ist notwendig, Zeitverlauf Bestimmungen für jedes Protein von Interesse durchzuführen. Wir bemerken auch, dass in Zellen, die nicht mit dem Laser ausgesetzt waren, gibt es keine Streifen reagieren Proteine. </li></ol></li><li> Nachdem alle Zellen in einem Feld haben die Platte Umzug in ein neues Feld gezielt worden, an der Kreuzung des Kreuzes Aufenthalt in der Nähe. </li><li> In Experimenten bestimine die Verteilung der inter Läsion Abstände Zellen an den Laser in 20-25 Feldern (4-5 Zellen / Feld) um den Schnittpunkt belichten. Um Replikationsmuster in der Nähe der lokalisierten ICLs inkubieren Zellen mit 10 &amp; mgr; M 5-iod-2-desoxyuridin (IDU) nach der Laserbrenn zu analysieren. HINWEIS: Die Zeit der Inkubation mit IdU ist etwas willkürlich. Wir haben so kurz wie 20 Minuten und solange 60 min (siehe unten) verwendet. Längere Impulse (einige Stunden) führen oft in mehreren Replikationsweg Koaleszieren und damit die Möglichkeit, das Bild zu verlieren, den Fortschritt der einzelnen Gabeln. In einigen Experimenten ces werden 24 h mit CldU markiert vor der Belichtung mit Dig-TMP gleichmäßig zu Markierungs-DNA, gefolgt von Pulsmarkierung Replikationsweg. </li></ol> 3. Ernte von Zellen und Dehnen von DNA-Fasern <ol><li> Entfernen der Platte von der Bühne, das Medium entfernen, und wasche mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Entfernen Sie die PBS-Lösung. Legen Sie eine 10 &amp; mgr; l Tropfen eines handelsüblichen Trypsin/ EDTA-Lösung auf dem Schnittpunkt des Kreuzes in der Mitte der Glasoberfläche. </li><li> Inkubieren für 3-4 min bei Raumtemperatur (RT) und dann mit den abgelösten Zellen in die Pipettenspitze die Trypsinlösung zeichnen. Es besteht keine Notwendigkeit, das Trypsin zu neutralisieren. </li><li> Platzieren Sie den Tropfen Trypsin / EDTA mit den Zellen an einem Ende eines silanisierten Glasobjektträger. Lyse der Zellen und lassen Sie die DNA durch Zugabe von 10 ul 0,5% SDS-Lösung und für 3-4 min bei RT inkubieren vorsichtig mit der Pipettenspitze Mischen, so dass die Peripherie des Pools zu trocknen. </li><li> Kippen Sie die Schlitten 20 ° und die Flüssigkeit bis zum Ende laufen. Die DNA-Fasern werden ausgefahren / ausgestreckt durch die hydrodynamischen Kräfte der fließenden Flüssigkeit. Lassen Sie die Folien der Luft trocknen (~ 10 min) und fixieren in 3: 1 Methanol / Essigsäure 10 min. Entfernen Sie die Folien aus der Fixier-Lösung und Luft wieder trocken. An diesem Punkt kann sie auf unbestimmte Zeit in 70% EtOH bei -20 ° C gelagert werden. Bei der Entfernung aus dem EtOH 70% an der Luft trocknen, bevor die ne ermöglichenxt Schritt. </li><li> Wasche Objektträger in PBS und dann in 2,5 M HCl denaturiert für 1 h bei RT. Diese Behandlung depurinates DNA die inkorporierten halogenierten Nukleobasen für Antikörper zugänglich zu machen. </li><li> Neutralisieren Objektträger in 0,4 M Tris-HCl, pH 7,4. Wasche zweimal in PBS / 0,5% Tween-20 (PBST) für jeweils 5 Minuten. </li><li> Block gleitet und mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) und 10% Ziegenserum in PBS. Deckt die Folien vorsichtig mit einem Parafilm die Blockierungslösung gleichmäßig über die Folie verteilt und für 1 h bei RT inkubiert. </li><li> Jeweils 100 &amp; mgr; l 1: 200-Verdünnung in Blockierlösung von Ratten-Anti-Bromdesoxyuridin (erkennt spezifisch CldU) primäre Antikörper zu jeder Folie. Deckt die Folien vorsichtig mit einem Parafilm die Verdünnung gleichmäßig über den Objektträger zu verteilen und für 1 h bei RT in einer feuchten Kammer inkubiert. Entfernen Sie den Parafilm und waschen Sie die Folien dreimal in PBST für jeweils 5 Minuten. </li><li> Jeweils 100 &amp; mgr; l von verdünnten (1: 100), Ziege-anti-Ratte-Alexa Fluor 647 in jede Folie Blockierungslösung. Bedecke, Verdecke dasgleitet sanft mit einem Parafilm und für 45 min bei RT inkubiert. Waschen Sie die Objektträger dreimal in PBST für jeweils 5 Minuten. </li><li> Jeweils 100 ul verdünnten (01.40) Maus-Anti-Bromdesoxyuridin (LDU erkennen und CldU Diese duale Spezifität die Blockierung von CldU durch den Ratten-anti BrdU im Stand der Inkubation erforderlich macht.) Primären Antikörper und Kaninchen-anti-DIG-Antikörper (1: 200 ) -Lösung zu jeder Folie in blockieren. Decken Sie die Folien vorsichtig mit einem Parafilm und Inkubation in einer befeuchteten Kammer für 1 h bei RT. Waschen Sie die Objektträger dreimal in PBST für jeweils 5 Minuten. </li><li> Jeweils 100 &amp; mgr; l von verdünnten (1: 100) , Ziege - anti-Maus - Alexa Fluor 488 und c (1: 5000) , Ziegen - anti-Kaninchen - Sonde (zB Qdot 655) in jede Folie Blockierungslösung. Decken Sie die Folien vorsichtig mit Parafilm und Inkubation für 45 min bei RT. Waschen Sie die Objektträger dreimal in PBST für jeweils 5 Minuten. </li><li> Überschüssiges PBST auf einem Papiertuch. Je 50 &amp; mgr; L Antifade Befestigungsmedium auf jeden Objektträger geben und mit einem Deckglas. Bild oder Speicher fürnicht mehr als 48 h bei -20 ° C. </li></ol> 4. Faser Imaging durch Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Durchführen der Bildaufnahme durch ein 63X Ziel auf einem inverses Mikroskop mit einem daran befestigten vollständig motorisierten Filterrad mit FITC, Cy5 und Q-Punkt 655 Erkennung. Der Anregungsfilter 425 nm, und das Emissionsfilter 655 nm mit 20 nm an der Emissionsspitze 20 zentriert. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Laser-Lokalisierungstechnologie erfordert die Verwendung von adhärenten Zellen mit Kernen, die in Hellfeld-Mikroskopie sichtbar sind. Wir haben versucht, nicht-adhärente Zellen, wie primäre Lymphozyten zu befestigen, oder lose anhaftenden Kulturzellen wie AD293, auf die Glasoberfläche mit zelladhäsiven Zubereitungen wie Polylysin oder Collagen, oder komplexere Mischungen. Obwohl diese Behandlungen die Zellen an die Oberfläche binden kann, finden wir, dass sie in der Regel gerundet bleiben, was es sehr schwieri...

DNA wird unter konstantem Angriff von exogenen Mitteln wie Strahlung, ultraviolettem Licht, Umweltgifte, Verbrennungsprodukte, etc. Darüber hinaus ist es auch durch endogene Radikalspezies hergestellt durch oxidative Stoffwechsel angegriffen wird. All diese Faktoren haben das Potenzial , chemisch oder physikalisch die Integrität der DNA - 1 zu stören. Störungen in dem Genom können die DNA-Schadensantwort (DDR) aktivieren, eine Rekrutierung und posttranslationale Modifikation Kaskade mit Hunderten, wenn nicht Tausende von Proteinen und in Läsion Reparatur beteiligt microRNAs, Regulation des Zellzyklus, Apoptose, Seneszenz und Entzündungsweg 2. Die meisten unserer Informationen über die DDR stammt aus Studien mit DSBs. Dies ist zum großen Teil durch die Verfügbarkeit von Technologien für Brüche sind , darunter ein sequenzspezifische Pausen, in genomischer DNA in lebenden Zellen 3. Darüber hinaus ist die propensity von Pausen Brennpunkte der DDR-Proteine ​​zu induzieren, die durch Immunofluoreszenz angezeigt werden können, ist sehr hilfreich für die Bestimmung der Kinetik und Anforderungen des Antworten Proteine. Eine der Schlüsseltechnologien für die DDR studiert wurde von Bonner und Kollegen vorgestellt, die einen Laserstrahl verwendet , 4 einen Streifen von DSBs in einer „Region of Interest“ (ROI) in den Kernen von lebenden Zellen zu lenken. In der Tat haben sie einen langen Fokus, in denen Proteine ​​der DDR können durch Immun identifiziert werden. Dies wurde durch die Demonstration der starken Streifen von phosphoryliertem Histon H2AX (γ-H2AX) in den Laser-exponierten Zellen veranschaulicht. Seitdem hat sich der Laser Ansatz in zahlreichen Studien der DDR eingesetzt wurden durch DSBs induziert. Obwohl mächtig und beliebt, und die Quelle der dramatischen Immun Bilder, sei darauf hingewiesen, dass in den meisten Experimenten die Laserintensität eingestellt wird, um beobachtbare Ergebnisse zu produzieren, ohne Sorge um die Läsion Identität,Dichte oder Abstand. Tatsächlich kann es schwierig sein, diese Schätzungen. So sind sie weitgehend ignoriert, trotz der Vielzahl der in die DNA eingeführt Läsionen durch Laser 5. Dies trägt zu den vielen Widersprüche in der Literatur 6. Im Gegensatz zu DSBs meisten chemischen Modifikationen der DNA nicht stimulieren die Bildung von diskreten Foci von DDR-Proteinen. Dies ist wichtig im Hinblick auf unserem gegenwärtigen Verständnis der Läsion Frequenzen. Es wird geschätzt, dass menschliche Zellen in Kultur nicht weniger als 50 DSBs pro Zellzyklus entstehen, 7 weitgehend während der S - Phase gebildet, 8, 9. Weniger in nicht-proliferierenden Zellen gebildet. Dies kontrastiert mit der Anzahl von Nukleobasen Verluste oder Änderungsereignisse, die 1 in die Zehntausende pro Zelle / Tag, 10. So wissen wir am meistendie DDR durch Ereignisse induziert, die relativ selten sind, und viel weniger über die von Helix zu verzerren Läsionen induziert, die weitaus häufiger in Aggregat sind. Um Fragen über die zelluläre Antwort zu adressieren Modifikationen der genomischen DNA kovalent, wollten wir mit einer Helix verzerrenden DNA-Addukt arbeiten, die inhärente DDR Induktionsaktivität hatte. Darüber hinaus erleichtern experimentelles Design und Interpretation, die wir waren in einer Struktur, deren Einführung interessiert Bezug auf die Zeit kontrolliert werden konnte und war offen für die Visualisierung. Dementsprechend entwickeln wir eine Strategie, die auf Psoralen. AT sites: Psoralene sind gut photoaktive DNA-Interkalatoren begünstigende 5&#39; TA gekennzeichnet. Im Gegensatz zu anderen Vernetzungsmitteln wie beispielsweise Stickstoffsenfgase und Mitomycin C (MMC) sie sind nicht reaktiv, es sei denn DNA ausgesetzt langwelligem UV (UV-A) Licht. Die interkalierten Moleküle reagieren mit Thymin-Basen auf gegenüberliegenden Strängen helix verzerrenden Interstrang-Vernetzungen (ICLs herzustellen) 11. Mit dem Psoralen trimethyl in unseren Experimenten verwendeten die meisten Produkte sind ICLs, relativ wenige Monoaddukte erzeugt werden (weniger als 10%) 12 und Intrastrang - Quervernetzungen zwischen benachbarten Basen auf einem Strang nicht ausgebildet sind . Weil sie leistungsfähiger Blöcke Replikation und Transkription, Psoralen und andere Vernetzungsmittel sind, wie cis-Platin und MMC, werden in der Chemotherapie eingesetzt. Somit Psoralen Studien ermöglichte, dass die Aktivierung der DDR durch eine Helixstruktur zu verzerren, gefolgt, und auch einen Einblick in die zelluläre Antwort auf eine Verbindung mit der klinischen Bedeutung zur Verfügung gestellt. Wir ein Reagenz synthetisiert, in dem trimethylpsoralen verknüpft wurde an Digoxigenin (Dig), ein pflanzliches Sterin nicht in Säugerzellen gefunden und häufig als immunotag verwendet. Die Anforderung für die Photoaktivierung erlaubt die Lokalisierung von Laserlicht (365 nm) von Psoralen ICLs in definierten ROI in Kernen in lebenden Zellen. Diese können durch imm angezeigt werdenunofluorescence gegen das Markierungs-Dig. DNA - Reparatur und DDR - Proteine erschienen in den Streifen des Laser lokalisierten ICLs 13, 14. Die DDR durch die hohen Laserintensitäten aktiviert verwendet DSBs produzieren könnte 15 aufgrund isoliert oder gruppierten Schaden sein, 16. Folglich ist die Relevanz der Ergebnisse aus diesen Experimenten natürlich Läsionen vorhanden bei viel niedrigeren Konzentration auftritt, ist ungewiss. Um ähnliche Fragen zu Psoralen Addukts Frequenz und Abstand in der DNA - Adresse, nutzten wir DNA - Fasertechnologie 17 und immunoquantum Punkte. Quantenpunkte sind deutlich heller als Fluoreszenzfarbstoffe und sind nicht durch Belichtung gebleicht. So werden sie häufig für Einzelmolekül - Bildgebung verwendet 18, eine Anwendung , für die Fluoreszenzfarbstoffe nicht ausreichend hell sein . Einzelne DNA-Fasern können auf g gestrecktlass Dias und können während der Inkubationen vor der Zellernte eingebracht durch Immunofluoreszenz gegen Nukleosidanaloga angezeigt werden. Wir behandelten Zellen mit Dig-Psoralen und den ROI zu Lasermikrobestrahlung ausgesetzt. Die Fasern wurden aus den Zellen und einzelne Dig-Psoralen-Addukte hergestellt mit den immunoquantum Punkte sichtbar gemacht werden konnten. die Zellen ausgesetzt Analoga für relativ kurze Zeiten Nukleosid (20-60 min) ermöglicht die Anzeige der Replikationsweg in der Nähe des Laser lokalisierte ICLs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digoxigenin NHS ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11333054001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloro-psoralen</td>
			<td>Berry and Associates</td>
			<td>PS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diaminoglycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>369519</td>
			<td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423550040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates</td>
			<td>Analtech, Inc.</td>
			<td>P02511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flass glass column 24/40, 100ml</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CG-1196-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>With Volocity Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropoint Galvo&#160;</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>with a Nitrogen pulsed laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dye cell</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>MP-2250-2-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 dye</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>MP-27-365-DYE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IdU&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>New Comer Supply</td>
			<td>Part # 5070</td>
			<td>New Silane Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti BrdU antibody (IdU)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td>1 in 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti BrdU Antibody (CldU)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6326</td>
			<td>1 in 200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti Dig antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>710019</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q-11421MP</td>
			<td>1 in 5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647- goat anti Rat IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>112-605-167</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF488-goat anti mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-545-166</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss epifluorescent microscope A200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>&#160;with Axiovision software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>39107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule analysis of laser localized psoralen adducts

Die DNA-Schadensantwort (DDR) wurde in Studien von Doppelstrangbrüchen (DSB), induziert durch Lasermikrostrahlbestrahlung in lebenden Zellen extensiv charakterisiert. Die DDR helix DNA kovalente Modifikationen verzerrenden, einschließlich Interstrang- DNA-Vernetzungen (ICL), ist nicht so gut definiert. Wir haben die von ICLs stimuliert DDR studiert, lokalisiert durch Laser-Photoaktivierung von immunotagged Psoralene, in den Kernen von lebenden Zellen. Um grundlegende Fragen über Adduktverteilung und Replikationsgabel Begegnungen zu adressieren, kombinierten wir Laser-Lokalisierung mit zwei anderen Technologien. DNA-Fasern werden häufig während kurzer Impulse integriert anzuzeigen, den Fortschritt der Replikationsgabeln durch Immunofluoreszenz von Nukleosidanaloga verwendet. Immunoquantum Punkte wurden für Einzelmolekül-Bildgebung weit verbreitet. In dem neuen Ansatz, DNA Fasern aus Zellen, den Laser-lokalisierte ICLs werden auf Objektträger verteilt. Die markierten ICLs sind mit immunoquantum Punkten und th angezeigte inter-Läsion Entfernungen bestimmt. Replikationsgabel Kollisionen mit ICLs visualisiert und andere Begegnung Muster identifiziert und quantifiziert werden.

Laser lokalisierte Dig-TMP (1A) ICLs kann den Psoralen verknüpfte durch Immunofluoreszenz gegenüber der Dig-Markierung angezeigt werden. Obwohl der Laser gerichtet werden kann, auf einer Fläche von jeder Kontur zu schlagen, sind Streifen nicht „natürlich“ Formen in Zellen und berechtigtes Signale leicht von Artefakten aufgrund von nicht-spezifischen Bindung von primären oder sekundären Antikörpern unterschieden werden können. Diese Funktion ist hilfreich, wen...

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Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Laser werden häufig in Untersuchungen der zellulären Antwort auf DNA-Schädigung verwendet. Jedoch erzeugen sie Läsionen, deren Abstand, Frequenz und Kollisionen mit Replikationsgabeln werden selten charakterisiert. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der die Bestimmung dieser Parameter mit Laser lokalisiert Interstrang- Vernetzungen ermöglicht.

Einzelmolekülanalyse von Laser Lokalisierte Psoralen Addukten

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

single-molecule-analysis-of-laser-localized-psoralen-adducts

Research

JoVE Journal

Genetics

6.6K Aufrufe.  National Institute on Aging, National Institutes of Health.  Laser werden häufig in Untersuchungen der zellulären Antwort auf DNA-Schädigung verwendet. Jedoch erzeugen sie Läsionen, deren Abstand, Frequenz und Kollisionen mit Replikationsgabeln werden selten charakterisiert. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der die Bestimmung dieser Parameter mit Laser lokalisiert Interstrang- Vernetzungen ermöglicht. 

Serie: Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Lasergestützte Zytoplasmatischen Mikroinjektions in Vieh Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Forschung

Genetik

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Metagenomanalyse von Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

Mit In-vitro- und In der Zelle Form zu untersuchen, kleines Molekül induzierte Pre-mRNA Strukturveränderungen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.