Diese Arbeit wird von The Jackson Laboratory Cancer Center Pilot Grant und The Maine Cancer Foundation unterstützt.

Ein. Protokoll <ol><li> Anästhesieren die Maus mit Ketamin und Xylazin in einer Dosis von 0,1 mg Ketamin und 0,01 mg Xylazin pro 1 g Körpergewicht. Carprofen (0,005 mg pro 1 g Körpergewicht) wird zur Analgesie verwendet und wird präoperativ verabreicht. </li><li> Alle der chirurgischen Instrumente einschließlich des dentalen Bohrers, sind Dampf in einem Autoklaven sterilisiert. Wenn Batch Operationen durchgeführt werden sollen, müssen die Spitzen der chirurgischen Instrumente mit einer Glasperle Sterilisator (Fine Science Tools FST 250) werden vor jeder erneuten Operation erneut sterilisiert. </li><li> Sobald die Maus eine chirurgische Ebene der Anästhesie, durch Fehlen einer Antwort auf eine Zehe Pinch beurteilt erreicht hat, wird es auf einem Wattebausch, die dann auf einem Heizkissen gelegt, um eine Körpertemperatur von ~ 37 ° C zu halten platziert Die Tiefe der Anästhesie wird häufig während der Operation überwacht. </li><li> Fell ist aus dem dorsalen Kopf in einer etwa dreieckigen Bereich ~ 3 mm kaudal der Nase entfernt und erstreckt kaudal des cervical Wirbel. Augensalbe wird die Augen aufgetragen, um sie vor dem Austrocknen und Irritationen zu schützen. </li><li> Die Maus wird in ventralen recumbancy gelegt und die Haut wird mit chirurgischen Jod, 70% Ethanol, und sterile Tupfer desinfiziert. Ein 0,8 x 1,0 cm Hautlappen für den dorsalen Aspekt der frontalen und parietalen Knochen des Schädels entfernt mit einer feinen Schere. </li><li> Topische analgetische, 0,5% Lidocain, lokal an der Knochenhaut und den freiliegenden Gewebe am Umfang der Wunde aufgebracht wird. Das Periost wird durch leichtes Kratzen der Schädel mit einem Skalpell entfernt, dies wird die Sekundenkleber an den Knochen haften helfen. </li><li> Die kortikalen Bereich von Interesse auf dem Schädel mit einem Marker beschrieben. Das Gebiet von Interesse sollte nicht über Schädel Nahtlinien liegen, um Schäden an zugrunde liegenden großen Gefäße zu vermeiden. </li><li> Eine dünne Schicht aus Cyanacrylat-Klebstoff wird auf die Wundränder aufgebracht, um das Einsickern von serosanguinous Fluids zu verhindern, und der Schädel ausgenommender Bereich von Interesse. </li><li> Lichtaktivierten Dentalzement ist in unserem Protokoll zum Abdichten des Schädels eingesetzt. Vor dem Aufbringen der Dentalzement werden alle freiliegenden Schädels mit Ausnahme des Bereichs zum Verdünnen mit den Primern bestimmt und anschliessend mit dem Bindemittel aus der lichtaktivierten Dentalzement Kits behandelt. Sobald das Bindemittel getrocknet, das lichtaktivierte Dentalzement angelegt, um den Schädel bedecken. Um den Kopf der Maus für die nachfolgende Operation und Bildgebung zu stabilisieren, wird eine sterile # 00-90 Mutter in die Zahnzement in einem Abstand von dem Bereich verdünnt werden eingebettet. Der Einsatz von Licht-aktivierte Zahnzement ermöglicht es uns, den Schädel, ohne zu hetzen, um den gesamten Vorgang zu beenden vorzubereiten. Sobald die zahnärztliche Zement-Zubereitung am Schädel abgeschlossen ist, wird die zahnärztliche Zement mit sichtbarem Licht ausgehärtet werden. </li><li> Nachdem die zahnärztliche Zement ausgehärtet ist, wird ein Halter aus dem Kopfstück stereotaktischen Gerät zum Sechskantmutter an der Maus Kopf unter Verwendung eines # 00-90 Schraube montiert. </li><li> A drop Raumtemperaturlagerung, wird 0,9% steriler Kochsalzlösung zum Schädel Bereich verdünnbar aufgebracht. Mit Hilfe eines Stereomikroskops, wird eine Hochgeschwindigkeits-Mikro-Bohrer verwendet werden, um eine kreisförmige Fläche des Schädels (typischerweise ~ 4-5 mm Durchmesser) über den Bereich von Interesse zu verdünnen. Bohr und die Anwendung von Kochsalzlösung zu dem gebohrten Gebiet intermittierend während der Ausdünnung Verfahren durchgeführt, um thermische Schädigung der darunterliegenden cerebralen Gewebe zu vermeiden. Saline Wärme absorbiert und hilft auch erweichen die Knochen. </li><li> Die Maus Schädel besteht aus zwei dünnen Schichten von kompakten Knochen, zwischen denen eine dicke Schicht von Spongiosa. Die äußere Schicht aus kompaktem Knochen und die meisten der Spongiosa entfernt werden mit dem Bohrer. </li><li> Nachdem der größte Teil der Spongiosa entfernt wird, können die verbleibenden Hohlräume innerhalb des schwammigen Knochen unter einem Präpariermikroskop gesehen werden, was darauf hinweist, dass die Bohrungen nähert sich der interne kompakten Knochen Schicht. In diesem Stadium sollte Schädel Dicke noch mehr als 50 um betragen. Schädel Ausdünnung sollteweiterhin genau, um eine sehr dünne (~ 20 um) und glatte Zubereitung zu erhalten. </li><li> Sobald die gewünschte Dicke des Schädels erreicht wird (~ 20 Mikrometer), wird der Schädel ersten poliert mit eine maßgeschneiderte Silikon-Peitsche mit Diamantpaste (6-15 um) für ca. 10 min. Der Diamant-Paste Polieren dient zwei Zwecken. Erstens ist es weiter verdünnt das Schädel ohne Ausüben von Druck auf den verdünnten Schädels, wodurch zufällige Beschädigung des darunter liegenden Hirngewebe. Zweitens dient sie als Anfangswert Polierschritt für die ausgedünnten Schädels bevor das feinkörnige Zinnoxid zur weiteren Schädel Polieren verwendet wird. </li><li> Nach der Diamant-Paste Polieren wird die ausgedünnten Schädel mit Zinnoxid für etwa 10 min poliert. Nachdem der Schädel ist poliert, die Zinn-Oxid weg mit Kochsalzlösung gespült, bis die ausgedünnten Schädels scheint sauber. </li><li> Bei diesem Schritt, wenn der craniale Fenster ist, um in Längsrichtung in vivo-Bildgebung verwendet werden, wird das gereinigte dünnen Schädelbereich getrocknet. Ein kleiner Tropfen klarerCyanoacrylat Kleber aufgebracht wird, um den kranialen Fenster abzudichten. Die Schicht aus Sekundenkleber zwischen dem Schädel und dem ausgedünnten Deckplättchens sollte so dünn wie möglich. </li><li> Wenn eine Einspritzung nach Erstellung eines Ports kranialen Fensters ausgeführt werden, in diesem Schritt wird eine 26-Gauge-Nadel Spritze verwendet, um eine kleine Öffnung auf einer Seite des polierten dünnen Schädel-Fenster zu erzeugen. Diese Öffnung ist für GBM Zellinjektion verwendet. </li><li> Ein steriler Glaspipette mit einer Bahnöffnung etwa 50 um im Durchmesser gezogen wird mit einer Pipette abziehen. Diese Pipette für GBM Zellinjektion verwendet werden, und wird auf eine Mikromanipulator geladen. Die Pipette wird in einem 30-Grad-Winkel, so dass die GBM Zellinjektion Website wird von der endgültigen Imaging Website geladen. Die Spitze der Pipette unter einem Dissektionsmikroskop entfernt. Der GBM Zellsuspension Front-loaded in die Pipette durch Ansaugen mit Hilfe einer Spritzenpumpe. </li><li> Sobald die Injektionspipette mit GBM Zellen geladen wird, wird die Maus wieder unter th verschobene Mikroskop. Die Injektionspipette in Richtung der kleinen Öffnung in der kranialen Fenster abgesenkt und schließlich in das Gehirn durch die Öffnung mit einem Mikromanipulator eingesetzt. 1 ul einer GBM Zellsuspension wird in das Gehirn 100-200 um aus dem Gehirn Oberfläche (: 0,1 ul / min, Dauer: 10 min Geschwindigkeit) injiziert. </li><li> Der Schädel getrocknet wird, wird ein kleiner Tropfen klare Sekundenkleber auf das getrocknete Schädels angelegt wird, und ein Stück von 3 mm Größe Nr. 1 Deckglas an dem dünnen und poliert Schädelbereich haftet. Der Raum zwischen dem Deckglas und benachbart Dentalzement ist mit Sekundenkleber abgedichtet. </li><li> Nach der Operation wird die Maus subkutan mit 1 ml warmem sterilen Kochsalzlösung injiziert und mit zusätzlicher Hitze, um die Körpertemperatur zu halten, bis sie vollständig aus der Narkose zurückgewonnen. </li><li> Zum Abbilden sind Mäuse mit Ketamin und Xylazin in einer Dosierung von 0,1 mg Ketamin und 0,01 mg Xylazin pro 1 g Körpergewicht. Mäuse immobilisiert sind mit einem benutzerdefinierten stereotaktischen Rahmenunter dem Mikroskop. Wenn wiederholte in-vivo-Bildgebung auf täglicher Basis durchgeführt wird, werden Isofluoran eine bessere Option sein, da Mäuse Anzeichen von Abhängigkeit mit dem serienmäßigen Einsatz von Ketamin zu zeigen. </li></ol> 2. Repräsentative Ergebnisse Eine erfolgreiche Ports kranialen Fensters Chirurgie erlaubt die kraniale Fenster frei bleiben für Wochen bis Monate. Abbildung 1 zeigt das Gefäßsystem unter einer Ports kranialen Fenster visualisiert rückgestreuten Lichts. Diese Gefäße Bilder wurden als Landmarken für die Lokalisierung der gleichen Hirnareale für sich wiederholende Bildgebung verwendet. Um sowohl die Blutgefäße Endothelzellen und GBM-Zellen visualisieren, überquerten wir die B6.Cg-Tg (Tek-cre) 1Ywa / J-Maus, die vaskulären Endothelzellen mit Etiketten versieht, B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato ) HZE / J-Maus und erzeugten Mäuse mit vaskulären Endothelzellen mit dem roten fluoreszierenden Protein tdTomato beschriftet. Wir haben dann durchgeführt den Häfen Kraniotomie Verfahren auf diese mice und GFP-markierten GBM Zellen ins Gehirn injiziert durch eine kleine Öffnung auf der Seite eines Schädel-Fenster. Wir haben dann in vivo durchgeführt Zwei-Photonen-Imaging in Längsrichtung auf den injizierten Mäusen. Der Laser wurde Anregungswellenlänge bei 910 nm, die bei der Erregung von sowohl GFP und tdTomato Folge eingestellt. Zwei-Photonen-Imaging wurde auf einem custom-built Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop mit zwei Detektoren für die gleichzeitige grün / rot Fluoreszenzdetektion Fähigkeit durchgeführt. Abbildung 2 zeigt eine in vivo Beispiel Gliom Einweihung von injiziert GBM-Zellen in der Nähe des Gefäßsystems. Die Ports kranialen Fenster ist auch eine ausgezeichnete Wahl für chronische Zeitraffer in vivo-Bildgebung. Abbildung 3 zeigt GFAP Färbung der kortikalen Bereiche von einer Maus ohne Anschlüsse Chirurgie, eine Maus 7 Tage folgende Ports Chirurgie, und eine Maus 7 Tage folgende Ports Chirurgie und Injektion von Kochsalzlösung. Es ist aus den Bildern, dass die Maus ohne Operation und der Maus mit PoR evidentTS Operation nicht Gliose, wohingegen nach Kochsalzinjektion Gliose im Hirngewebe der Maus beobachtet wird, durch Eindringen und Kochsalzinjektion im Gehirn pipettieren. Dieses Ergebnis zeigt, dass Gliose nicht unter den Häfen kranialen Fensters auftreten, unabhängige Bestätigung dafür, dass die Ports kranialen Fensters hier beschriebenen nicht der Gliose, die typischerweise mit einer &quot;offenen Schädel&quot; chronische kranialen Fensters verbunden führen. Abbildung 4 zeigt hochauflösende Bildgebung von dendritischen Dornen aus der gleichen Maus auf den Tag der Operation (Tag 0) und 32 Tage nach der Ports Fenster Schöpfung (Tag 32), die zeigen, dass die Ports-Fenster ist auch eine ausgezeichnete Wahl für hochauflösende in vivo-Bildgebung. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig1.jpg" /> Abbildung 1. Visualisierung von Gefäßen unter einem polierten und verstärkte ausgedünnt Schädel Schädel Fenster mit rückgestreuten Lichts. Tage stellen t<html> Er Anzahl von Tagen nach der Operation; Aufnahmen wurden beginnend mit dem Tag der Operation unmittelbar nach Abschluss der GBM Zellinjektion. Maßstab:. 0,5 mm <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig2.jpg" /> Abbildung 2. Visualisierung injiziert GBM Zellen und Gefäße in vivo. Mäuse, die sowohl Tek-Cre und ROSA26 CAG-tdTomato wurden für GBM Zellinjektion verwendet. Vaskulären Endothelzellen wurden mit tdTomato (rot) markiert, und GBM-Zellen wurden mit GFP (grün) bezeichnet. Die Bilder wurden beginnend 24 Stunden nach GBM Zellinjektion. Eine Gesamtzahl von 10 bis 12 benachbarten Sichtfelder wurden entnommen und benachbart zusammengebaut, um einander mit den identifizierten injiziert GBM Zellen in der Mitte des gesamten Feldes, um die endgültigen Bilder zu erzeugen. Tage stehen für die Anzahl der Tage nach der Operation. Maßstab: 100 um.href = &quot;http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig3.jpg" /> Abbildung 3. Gliose nicht folgende Ports kranialen Fensters Operation auftreten. Obere Platten: Mouse Gehirn koronalen Abschnitt unter geringer Vergrößerung. Linkes Feld: eine Maus ohne kranialen Fensters Operation, keine GFAP Aktivierung im Hirngewebe beobachtet. Mitte: eine Maus mit einem Anschlüsse kranialen Fenster auf der rechten Seite des Gehirns erzeugt werden, keine GFAP Aktivierung im Hirngewebe beobachtet. Rechts: eine Maus mit einem Anschlüsse kranialen Fenster und Injektion von Kochsalzlösung aus der Seite der Anschlüsse Fenster. GFAP-Aktivierung auf der Seite des Ports Fenster beobachtet, aber nicht auf der Seite des intakten Hirngewebe. Maßstab: 1 mm. Unten: höherer Leistung Bilder von Hirngewebe in Bereichen wie in das weiße Feld der oberen Panel-Bilder angezeigt. Maßstab: 100 um. <ahref = &quot;http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig3large.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig4.jpg" /> Abbildung 4. High-resolution imaging von dendritischen Dornen von Thy-1 YFPH Mäusen. Bilder wurden am Tag der Operation Ports erworben, und 32 Tage nach der Operation Ports. Es ist offensichtlich, von den Bildern, dass die meisten Stacheln präsentieren am Tag 0 deutlich sichtbar 32 Tage folgende Ports Operation sind. Maßstab: 2 um.

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Targets. 14, 621-632 (2010).</li><li>Germano, I., Swiss, V., Casaccia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+brain+tumors,+neural+stem+cell,+and+brain+tumor+cancer+cells:+where+is+the+link.">Primary brain tumors, neural stem cell, and brain tumor cancer cells: where is the link.</a> Neuropharmacology. 58, 903-910 (2010).</li><li>Park, D. M., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+glioma+cancer+stem+cells.">Biology of glioma cancer stem cells.</a> Mol. 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Clin. Neurosci. 15, 1193-1197 (2008).</li><li>Gilbertson, R. J., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+tumour's+bed:+glioblastoma+stem+cells+and+the+vascular+niche.">Making a tumour's bed: glioblastoma stem cells and the vascular niche.</a> Nat. Rev. Cancer. 7, 733-736 (2007).</li><li>Cho, R. W., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+cancer+stem+cells.">Recent advances in cancer stem cells.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 48-53 (2008).</li><li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat. Methods. 7, 981-984 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Ports kranialen Fensters ist die Ausdünnung und Polieren. Während der anfänglichen Verdünnung schnell durchgeführt werden kann, sollte darauf geachtet werden, homogene Ausdünnung des Schädels großflächig werden. Wir typischerweise eine dünne Schicht von Kochsalzlösung am Schädel und dann dünn der Schädel einem Durchlauf zu einem Zeitpunkt, so daß die Salzlösung verdampft kurz nachdem der Mikrobohrers hat über dem Schädel einmal durchlaufen. Dies ermöglicht uns, la...

<table border="1"><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> DMEM/F12 (1:1) mit Natriumpyruvat </td><td> Thermo Sci Hyclone </td><td> SH3026101 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 Serum Kostenlose Zusatz (50x) </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-1 Supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 35050061 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin-Lösung </td><td> Thermo Sci Hyclone </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Accutase-Enzyme Zellablösung Medium </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4555-56 </td><td></td></tr><tr><td> T25-Kolben-Entlüftungskappe grün </td><td> SARSTEDT </td><td> 83.1810.502 </td><td></td></tr><tr><td> 70% Alkohol </td><td> JAX LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10% Povidon-Iod topische Lösung </td><td> JAX LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ketamin HCl </td><td> Butler Animal Health Versorgung </td><td> NDC # 11695-0550-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Akorn, Inc. </td><td> NADA # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Carprofen </td><td> JAX LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Augensalbe </td><td> Dechra Veterinary Products </td><td> 17033-211-38 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5% Lidocain HCl </td><td> REGENT, Inc. </td><td> NDC 0517-0625-25 </td><td></td></tr><tr><td> Sekundenkleber </td><td> Henkel Corp </td><td> 46551 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile Tupfer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-400-114 </td><td></td></tr><tr><td> Diamantpaste </td><td> Widget Versorgung </td><td> BBE60 </td><td></td></tr><tr><td> Zinn-Oxid </td><td> LORTONE, Inc. </td><td> 591-038 </td><td></td></tr><tr><td> Liner Bond 2V </td><td> Kuraray Medical Inc. </td><td> 1921-KA </td><td></td></tr><tr><td> Clearfil AP-X </td><td> Kuraray Medical Inc. </td><td> 1721-KA </td><td></td></tr><tr><td> Salzhaltig </td><td> JAX LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deckglas </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0720 </td><td></td></tr><tr><td> Sechskantmutter </td><td> Small Parts, Inc. </td><td> HNX-0090-C </td><td></td></tr><tr><td> Spritzenpumpe </td><td> Syringepump.com </td><td> NE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Zwei-Photonen-Imaging-System </td><td> Custom built (Jegliche kommerzielle System würdearbeiten) </td><td></td><td></td></tr></table>

imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window

Gliom ist das eine der tödlichsten Formen von Krebs beim Menschen. Die effektivste Gliom Therapie date-Operation durch Strahlung gefolgt Behandlungs-Patienten bietet nur bescheidene Vorteile, da die meisten Patienten nicht überleben länger als fünf Jahre nach der Diagnose aufgrund Gliom Rückfall 1,2. Die Entdeckung von Krebsstammzellen in menschlichen Hirntumoren hält Versprechen für einen enormen Einfluss auf die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien für Gliome 3. Krebsstammzellen sind durch ihre Fähigkeit sowohl sich selbst zu erneuern und zu differenzieren definiert und sind gedacht, um die einzigen Zellen in einem Tumor, der die Fähigkeit zur Initiierung neuen Tumoren 4 verfügen. Gliom Rezidiv nach Strahlentherapie wird angenommen, dass aus dem Widerstand von Gliomen Stammzellen (GSCs) auf die Therapie ergeben 5-10. In vivo werden GSCs gezeigt, dass in einer perivaskulären Nische, die wichtig ist für den Erhalt ihrer Stammzell-ähnliche Eigenschaften 11-14 befinden . Zentral für die Organisationsierung der GSC Nische vaskulären Endothelzellen 12. Hinweise darauf, dass bestehende GSCs und deren Wechselwirkung mit den vaskulären endothelialen Zellen wichtig sind für die Tumorentwicklung und identifizieren GSCs und ihre Wechselwirkung mit Endothelzellen als wichtige therapeutische Ziele für Gliom. Die Anwesenheit von GSCs wird experimentell durch ihre Fähigkeit, neue Tumoren nach orthotopen Transplantation 15 einzuleiten bestimmt. Dies wird typischerweise durch Einspritzen einer bestimmten Anzahl von GBM Zellen aus menschlichen Tumoren in die Gehirne von stark immuno-defizienten Mäusen oder von Maus-GBM-Zellen in die Gehirne von Mäusen isoliert kongenen Host erreicht. Assays für das Tumorwachstum werden dann nach einer ausreichenden Zeit, damit GSCs unter den injiziert GBM Zellen zu neuen Tumoren-Regel mehrere Wochen oder Monate zu ergeben. Daher müssen bestehende Assays nicht zulassen Prüfung der wichtigsten pathologischen Prozess der Tumorinitiation von einzelnen GSCs in vivo. Folglich wesentliche insights in die spezifischen Aufgaben der GSCs und deren Interaktion mit den vaskulären Endothelzellen in den frühen Stadien der Tumorinitiation fehlen. Solche Einblicke sind entscheidend für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für Gliome und wird große Auswirkungen zu verhindern Gliom Rückfall in Patienten haben. Hier haben wir angepasst den Häfen kranialen Fenster-Prozedur 16 und in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Visualisierung des Tumors Einweihung von injizierten GBM Zellen in das Gehirn eines lebenden Maus ermöglichen. Unsere Technik wird den Weg ebnen für zukünftige Bemühungen um die wichtigsten Signal-Mechanismen zwischen GSCs und vaskuläre Endothelzellen während Gliom Einleitung aufzuklären.

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Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Durch die Kombination aus poliertem und verstärkte Dünnschicht-Schädel (Ports) cranial Fenster und Glioblastom (GBM) Zellinjektion können wir beobachten, Gliom Initiierung und Wachstum aus injiziert GBM Zellen in das Gehirn eines lebenden Maus Längsrichtung.

Imaging Gliom Initiation<em&gt; In Vivo</em&gt; Durch eine Poliert und Reinforced Thin-skull Cranial Fenster

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

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Medicine

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

13.0K Aufrufe.  The Jackson Laboratory. Durch die Kombination aus poliertem und verstärkte Dünnschicht-Schädel (Ports) cranial Fenster und Glioblastom (GBM) Zellinjektion können wir beobachten, Gliom Initiierung und Wachstum aus injiziert GBM Zellen in das Gehirn eines lebenden Maus Längsrichtung.

Serie: Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading to an accumulation of lipid-laden intra-luminal plaque, smooth muscle cell proliferation and progressive narrowing of the vessel lumen. The formation of such vulnerable plaques prone to rupture underlies the majority of cases of acute myocardial infarction. The complex molecular and cellular inflammatory cascade is orchestrated by the recruitment of T lymphocytes and macrophages and their paracrine effects on endothelial and smooth muscle cells.1
Molecular imaging in atherosclerosis has evolved into an important clinical and research tool that allows in vivo visualization of inflammation and other biological processes. Several recent examples demonstrate the ability to detect high-risk plaques in patients, and assess the effects of pharmacotherapeutics in atherosclerosis.4 While a number of molecular imaging approaches (in particular MRI and PET) can image biological aspects of large vessels such as the carotid arteries, scant options exist for imaging of coronary arteries.2 The advent of high-resolution optical imaging strategies, in particular near-infrared fluorescence (NIRF), coupled with activatable fluorescent probes, have enhanced sensitivity and led to the development of new intravascular strategies to improve biological imaging of human coronary atherosclerosis.
Near infrared fluorescence (NIRF) molecular imaging utilizes excitation light with a defined band width (650-900 nm) as a source of photons that, when delivered to an optical contrast agent or fluorescent probe, emits fluorescence in the NIR window that can be detected using an appropriate emission filter and a high sensitivity charge-coupled camera. As opposed to visible light, NIR light penetrates deeply into tissue, is markedly less attenuated by endogenous photon absorbers such as hemoglobin, lipid and water, and enables high target-to-background ratios due to reduced autofluorescence in the NIR window. Imaging within the NIR 'window' can substantially improve the potential for in vivo imaging.2,5
Inflammatory cysteine proteases have been well studied using activatable NIRF probes10, and play important roles in atherogenesis. Via degradation of the extracellular matrix, cysteine proteases contribute importantly to the progression and complications of atherosclerosis8. In particular, the cysteine protease, cathepsin B, is highly expressed and colocalizes with macrophages in experimental murine, rabbit, and human atheromata.3,6,7 In addition, cathepsin B activity in plaques can be sensed in vivo utilizing a previously described 1-D intravascular near-infrared fluorescence technology6, in conjunction with an injectable nanosensor agent that consists of a poly-lysine polymer backbone derivatized with multiple NIR fluorochromes (VM110/Prosense750, ex/em 750/780nm, VisEn Medical, Woburn, MA) that results in strong intramolecular quenching at baseline.10 Following targeted enzymatic cleavage by cysteine proteases such as cathepsin B (known to colocalize with plaque macrophages), the fluorochromes separate, resulting in substantial amplification of the NIRF signal. Intravascular detection of NIR fluorescence signal by the utilized novel 2D intravascular NIRF catheter now enables high-resolution, geometrically accurate in vivo detection of cathepsin B activity in inflamed plaque.
In vivo molecular imaging of atherosclerosis using catheter-based 2D NIRF imaging, as opposed to a prior 1-D spectroscopic approach,6 is a novel and promising tool that utilizes augmented protease activity in macrophage-rich plaque to detect vascular inflammation.11,12 The following research protocol describes the use of an intravascular 2-dimensional NIRF catheter to image and characterize plaque structure utilizing key aspects of plaque biology. It is a translatable platform that when integrated with existing clinical imaging technologies including angiography and intravascular ultrasound (IVUS), offers a unique and novel integrated multimodal molecular imaging technique that distinguishes inflammatory atheromata, and allows detection of intravascular NIRF signals in human-sized coronary arteries.

In vivo Near Infrared Fluorescence NIRF Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

We detail a new near-infrared fluorescence (NIRF) catheter for 2-dimensional intravascular molecular imaging of plaque biology in vivo. The NIRF catheter can visualize key biological processes such as inflammation by reporting on the presence of plaque-avid activatable and targeted NIR fluorochromes. The catheter utilizes clinical engineering and power requirements and is targeted for application in human coronary arteries. The following research study describes a multimodal imaging strategy that utilizes a novel in vivo intravascular NIRF catheter to image and quantify inflammatory plaque in proteolytically active inflamed rabbit atheromata.

In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) intravaskuläre Molecular Imaging von entzündlichen Plaque, einen multimodalen Ansatz, um Imaging der Atherosklerose

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading ...

Forschung

Medizin

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate since the advent of in vivo bioluminescent imaging technologies 1-3. Indeed, the ability to locate and quantify tumor growth longitudinally in a single cohort of animals to completion of the study as opposed to sacrificing individual groups of animals at specific assay times has revolutionized how researchers investigate breast cancer metastasis. Unfortunately, current methodologies preclude the real-time assessment of critical changes that transpire in cell signaling systems as breast cancer cells (i) evolve within primary tumors, (ii) disseminate throughout the body, and (iii) reinitiate proliferative programs at sites of a metastatic lesion. However, recent advancements in bioluminescent imaging now make it possible to simultaneously quantify specific spatiotemporal changes in gene expression as a function of tumor development and metastatic progression via the use of dual substrate luminescence reactions. To do so, researchers take advantage for two light-producing luciferase enzymes isolated from the firefly (Photinus pyralis) and sea pansy (Renilla reniformis), both of which react to mutually exclusive substrates that previously facilitated their wide-spread use in in vitro cell-based reporter gene assays 4. Here we demonstrate the in vivo utility of these two enzymes such that one luminescence reaction specifically marks the size and location of a developing tumor, while the second luminescent reaction serves as a means to visualize the activation status of specific signaling systems during distinct stages of tumor and metastasis development. Thus, the objectives of this study are two-fold. First, we will describe the steps necessary to construct dual bioluminescent reporter cell lines, as well as those needed to facilitate their use in visualizing the spatiotemporal regulation of gene expression during specific steps of the metastatic cascade. Using the 4T1 model of breast cancer metastasis, we show that the in vivo activity of a synthetic Smad Binding Element (SBE) promoter was decreased dramatically in pulmonary metastasis as compared to that measured in the primary tumor 4-6. Recently, breast cancer metastasis was shown to be regulated by changes within the primary tumor microenvironment and reactive stroma, including those occurring in fibroblasts and infiltrating immune cells 7-9. Thus, our second objective will be to demonstrate the utility of dual bioluminescent techniques in monitoring the growth and localization of two unique cell populations harbored within a single animal during breast cancer growth and metastasis.

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Herein we describe the methods to construct, visualize, and quantify the bioluminescent reactions of both firefly and renilla luciferase enzymes expressed in metastatic breast cancer cells during their growth and metastasis in vivo.

In vivo Dual-Substrat Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be performed in many locations overlying the rat cerebrum, but is most easily carried out by creating a craniectomy over the readily accessible frontal or parietal bones. Most frequently, we have used this technique in combination with the endothelin-1 middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke to quantify the changes in middle cerebral artery vessel diameter that occur with injection of endothelin-1 into the brain parenchyma adjacent to the proximal MCA4, 5. In order to visualize the proximal portion of the MCA during endothelin -1 induced MCAO, we use a technique to create a cranial window through the temporal bone on the lateral aspect of the rat skull (Figure 1). Cerebral arteries can be visualized either with the dura intact or with the dura incised and retracted. Most commonly, we leave the dura intact during visualization since endothelin-1 induced MCAO involves delivery of the vasoconstricting peptide into the brain parenchyma. This bypasses the need to incise the dura directly over the visualized vessels for drug delivery. This protocol will describe how to create a cranial window to visualize cerebral arteries in a step-wise fashion, as well as how to avoid many of the potential pitfalls pertaining to this method.

This article describes a method for visualizing rat cerebral arteries through a cranial window using temporal craniectomy in order to view proximal portions of the middle cerebral artery (Figure 1). This versatile method can be combined with various techniques of drug delivery to measure cerebral artery reactivity in vivo.

Mit Hilfe eines Cranial Fenster, um den Nahen Cerebral Artery Während Endothelin-1 induzierte Middle Cerebral Artery Occlusion Visualisieren

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

3D-Neuronavigation In Vivo Through a Patient's Brain During a Spontaneous Migraine Headache

A growing body of research, generated primarily from MRI-based studies, shows that migraine appears to occur, and possibly endure, due to the alteration of specific neural processes in the central nervous system. However, information is lacking on the molecular impact of these changes, especially on the endogenous opioid system during migraine headaches, and neuronavigation through these changes has never been done. This study aimed to investigate, using a novel 3D immersive and interactive neuronavigation (3D-IIN) approach, the endogenous &#181;-opioid transmission in the brain during a migraine headache attack in vivo. This is arguably one of the most central neuromechanisms associated with pain regulation, affecting multiple elements of the pain experience and analgesia. A 36 year-old female, who has been suffering with migraine for 10 years, was scanned in the typical headache (ictal) and nonheadache (interictal) migraine phases using Positron Emission Tomography (PET) with the selective radiotracer [11C]carfentanil, which allowed us to measure &#181;-opioid receptor availability in the brain (non-displaceable binding potential - &#181;OR BPND). The short-life radiotracer was produced by a cyclotron and chemical synthesis apparatus on campus located in close proximity to the imaging facility. Both PET scans, interictal and ictal, were scheduled during separate mid-late follicular phases of the patient's menstrual cycle. During the ictal PET session her spontaneous headache attack reached severe intensity levels; progressing to nausea and vomiting at the end of the scan session. There were reductions in &#181;OR BPND in the pain-modulatory regions of the endogenous &#181;-opioid system during the ictal phase, including the cingulate cortex, nucleus accumbens (NAcc), thalamus (Thal), and periaqueductal gray matter (PAG); indicating that &#181;ORs were already occupied by endogenous opioids released in response to the ongoing pain. To our knowledge, this is the first time that changes in &#181;OR BPND during a migraine headache attack have been neuronavigated using a novel 3D approach. This method allows for interactive research and educational exploration of a migraine attack in an actual patient's neuroimaging dataset.

3D-Neuronavigation In Vivo Through a Patient&#039;s Brain During a Spontaneous Migraine Headache

In this study, the authors report for the first time a novel 3D-Immersive &#38; Interactive Neuronavigation (3D-IIN) through the impact of a spontaneous migraine headache attack in the &#956;-opioid system of a patient's brain in vivo.

3D-Neuronavigation<em&gt; In Vivo</em&gt; Durch Gehirn eines Patienten während einer Spontan Migräne

A growing body of research, generated primarily from MRI-based studies, shows that migraine appears to occur, and possibly endure, due to the alteration ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequentiell<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &amp;#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

Kombiniert<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optische und μCT Imaging-Infektion, Entzündung und Knochenanatomie in einem Orthopädie Implantat-Infektion in Mäuse Monitor

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

State of the Art Cranial Ultrasound Imaging in Neonates

Cranial ultrasound (CUS) is a reputable tool for brain imaging in critically ill neonates. It is safe, relatively cheap and easy to use, even when a patient is unstable. In addition it is radiation-free and allows serial imaging. CUS possibilities have steadily expanded. However, in many neonatal intensive care units, these possibilities are not optimally used. We present a comprehensive approach for neonatal CUS, focusing on optimal settings, different probes, multiple acoustic windows and Doppler techniques. This approach is suited for both routine clinical practice and research purposes. In a live demonstration, we show how this technique is performed in the neonatal intensive care unit. Using optimal settings and probes allows for better imaging quality and improves the diagnostic value of CUS in experienced hands. Traditionally, images are obtained through the anterior fontanel. Use of supplemental acoustic windows (lambdoid, mastoid, and lateral fontanels) improves detection of brain injury. Adding Doppler studies allows screening of patency of large intracranial arteries and veins. Flow velocities and indices can be obtained. Doppler CUS offers the possibility of detecting cerebral sinovenous thrombosis at an early stage, creating a window for therapeutic intervention prior to thrombosis-induced tissue damage. Equipment, data storage and safety aspects are also addressed.

Cranial ultrasound (CUS) is a valuable tool for brain imaging in critically ill neonates. This video shows a comprehensive approach for neonatal (Doppler) CUS for both clinical and research purposes, including a bedside demonstration of the technique.

State of the Art Hirn Ultraschall-Bildgebung bei Neugeborenen

Cranial ultrasound (CUS) is a reputable tool for brain imaging in critically ill neonates. It is safe, relatively cheap and easy to use, even when a ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Intrauterine Telemetrie zur Maus Kontraktionsdruck messen<em&gt; In-vivo-</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

In-vivo-Imaging und Verfolgung von Technetium-99m markierten Knochenmark mesenchymale Stammzellen in Equine Tendinopathie

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...