Dieses Protokoll zeigt, wie die In Vivo Two-Photon-Mikroskopie verwendet werden kann, um sich wiederholende Visualisierungen der zellulären Dynamik an der gleichen Gehirnposition über längere Zeiträume zu machen. Der Vorteil dieser Technik ist, dass es möglich ist, die langfristigen Veränderungen in zellulären Elementen des Gehirns abzubilden, einschließlich der Anordnung, Morphologie und physikalischen Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen des ZNS. Diese Technik kann besonders nützlich sein, um Zell-Zell-Interaktionen, Zelldynamik und morphologische Veränderungen während der Plastizität des Gehirns und Neurodegeneration hervorzurufen.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer jugendlichen oder jungen Erwachsenen, vier bis zehn Wochen alt, eine CX3CR1 GFP Heterozygote Maus, die 17 bis 25 Gramm wiegt, für eine Schädelfensterimplantation. Nach der Anästhesisierung der Maus, verwenden Sie einen Haarschneider, um das Haar auf dem Kopf zu rasieren, zwischen den Ohren, etwa, von der Augenhöhe, bis zur Oberseite des Halsbereichs. Bewegen Sie die Maus zur stereotaktischen Operationsstation, Nasenkegel, und stabilisieren Sie ihren Kopf mit Ohrbügeln.
Halten Sie die Maus auf dem Heizkissen, während des gesamten Verfahrens. Schmieren Sie beide Augen mit Ölsalbe, dann injizieren 100 Mikroliter 0,25%bupivacaine, und 100 Mikroliter von vier Milligramm pro Milliliter Dexamethason, subkutan an der Einschnittstelle. Warten Sie mindestens fünf Minuten, bevor Sie fortfahren.
Bluten Sie den rasierten Kopf, mit drei abwechselnden Tupfern von Betadine, und 70%Alkohol. Dann machen Sie einen Mittellinien-Kopfhautschnitt mit einer chirurgischen Klinge oder Schere. Er erstreckt sich von der Rückseite des Schädelbereichs, zwischen den Ohren, bis zum vorderen Bereich zwischen den Augen.
Schneiden Sie die verbleibende Haut, um den Schädel zu belichten. Entbluten Sie das Bindegewebe zwischen der Kopfhaut und dem darunter liegenden Schädel mit 3% Wasserstoffperoxid und lokalisieren Sie den Hirnbereich, der mit stereotaktischen Koordinaten abgebildet werden soll. Bohren Sie eine kreisförmige Öffnung, etwa vier Millimeter in den Schädel, mit einem Zahnbohrer.
Während des Bohrens befeuchtete er regelmäßig den Schädel mit steriler Strandwäsche und Wattestäbchen, um das Gehirn zu kühlen. Entfernen Sie Knochenablagerungen und erweichen Sie den Schädelknochen. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie diesen Teil des Schädels vorsichtig mit spitzen Zangen.
Nachdem der Schädel entfernt wurde, legen Sie vorsichtig ein kleines Deckglas, mit Saline befeuchtet in die Craniotomie. Überschüssige Saline mit einem sterilen Wisch abtrocknen. Mit einem spitzen Applikator, Cyanoacrylat Kleber um das Fenster auftragen, und lassen Sie es an gehirn und Schädel zu befestigen.
Tragen Sie den Primerkleber auf den Rest des Schädels auf und härten Sie ihn 20 bis 40 Sekunden lang mit einem aushärtenden Licht aus. Erstellen Sie einen Brunnen um das Fenster mit dem endgültigen Kleber, und härten Sie es mit einem aushärtenden Licht für 20 bis 40 Sekunden. Kleben Sie eine kleine Kopfplatte auf den Schädel, auf die kontralaterale Hemisphäre, die Kraniotomie, mit dem Primerkleber, und dann mit dem letzten Kleber, beide für 20 bis 40 Sekunden aushärten.
Nachdem die Maus aufwacht, injizieren Sie eine subkutane Dosis Buprenorphin SR als postoperative Analgesie, die für 72 Stunden ausreichend sein wird. Beleben Sie die Maus mit zusätzlichem Salzfutter, um eine gesunde Genesung zu erleichtern. Die Bildgebung kann bereits zwei Wochen nach der Implantationsoperation durchgeführt werden.
Verwenden Sie Schrauben, um die Kopfplatte auf der Zwei-Photon-Mikroskop-Bühne zu montieren, die bei 35 Grad Celsius mit einer Heizplatte gehalten werden sollte. Injizieren Sie die Maus subkutan mit 100 Mikroliter Blutgefäßfarbstoff, wie Rhodamine B.Gently reinigen Sie die Oberfläche des Schädelfensters mit einem Wattestäbchen, in 70% Ethanol getupft. Legen Sie ein paar Tropfen Wasser oder Salzine auf das Fenster, und senken Sie die Objektivlinse in die Lösung.
Stellen Sie sicher, dass der Laser ausgeschaltet ist, während das Ziel absinkt, und zeichnen Sie eine Kurskarte, um die wichtigsten Sehenswürdigkeiten des Blutgefäßes zu bezeichnen, während Sie durch das Okular schauen. Verwenden Sie diese Zeichnung, um die spezifischen Bereiche während der Zwei-Photon-Bildgebung zu identifizieren. Sammeln Sie Bilder von fluoreszierenden Zellen und Gefäßen mithilfe der Zwei-Photonen-Bildgebung.
Siehe Textmanuskript für Bildgebungsparameter, nehmen Sie sorgfältige Notizen mit entsprechenden Koordinaten, um sicherzustellen, dass die genauen Bereiche für eine nachfolgende Abbildung überprüft werden können. Zeichnen Sie wie mehrere Sichtfelder in dieser ersten Bildgebungssitzung, Am Ende der Bildgebung, nehmen Sie die Maus von der Bühne, lassen Sie es aus der Anästhesie aufwachen, und kehren Sie es in seinen Heimatkäfig zurück. Verwenden Sie die erhaltenen Notizen und Bilder, um die Bereiche in den nachfolgenden Sitzungen neu zu bebildern.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um Microglial Dynamics In Vivo, in Taiwan YFP-H Linie Mäuse zu visualisieren. Spezifische Dendriten, dienten als stabile Landmarken für die feine Kartierung von Hirnregionen. Während Dendriten stabil sind, bewegen sich einige Mikroglia täglich.
Einzelne transgene CX3CR1/GFP-Mäuse wurden verwendet, um Mikroglia für bis zu acht Wochen zu folgen. Injektionen von Rhodamin B, wurden verwendet, um die Vaskulatur zu beschriften, während jeder Bildgebung Sitzung. Während die Vaskulatur stabil fixiert bleibt, sind die Mikroglia dynamisch.
Die CX3CR1/GFP-Mäuse wurden verwendet, um Mikroglia vor und nach schweren Anfällen zu folgen. Die Vaskulärbettstruktur wurde beibehalten, aber das mikrogliaale Zellnetz und die Positionslandschaft war vorübergehend. Größere Veränderungen wurden innerhalb von 24 bis 48 Stunden nach Anfällen beobachtet.
Doppeltransgene CX3CR1/GFP- und NG2DS-Rote Mäuse wurden verwendet, um Mikroglia und NG2 zu positiven Zellen In Vivo zu verfolgen. Ohne die Gefäße zu kennzeichnen, wurden Mikroglia sowie gefäßassoziierte Parasiten und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) identifiziert. Parasiten haben längsartige Prozesse, die entlang der Gefäßwand folgen, und OPCs zeigen in der Regel größere Zellkörper, die im Gehirn parenchyma, weg von der Vaskulatur befinden.
Bei der Verwendung von Rhodamin B konnte die hellere Fluoreszenz von Parasiten von der schwächeren Fluoreszenz von luminalem Rhodalin unterschieden werden, trotz ähnlicher Anregung während der Bildgebung. Die tägliche Bildgebung zeigte, dass Parasiten stabil positioniert waren, während OPCs und Mikroglia dynamisch waren. Es ist wichtig, die zu visualisierte Fläche sorgfältig zu beobachten, eine repräsentative Karte zu zeichnen, die so genau wie möglich ist, und die Schritte zu bezeichnen, die unternommen wurden, um die anderen Positionen in Bezug auf den Ausgangspunkt zu erreichen.
In nachfolgenden Imaging-Sitzungen sind diese Schritte, die handgezeichneten Karten und die zuvor aufgenommenen Bilder entscheidend, um dieselben Positionen wiederholt zu identifizieren. Diese Technik hat es Forschern ermöglicht, neuron-gliaale Wechselwirkungen, neuroimmune Interaktionen und Neuro-Zell-Dynamik von längeren Zeiträumen in Gesundheit und Pathologie zu klären.
