Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über die Bedeutung der Genexpressionsdynamik bei der Zellproliferation und -differenzierung zu beantworten, insbesondere die Dynamik von Notch-Signalmolekülen in neuronalen Stammzellen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Genexpression sowohl in vitro als auch in vivo mit einer sehr hohen Präzision durch Live-Bildgebung überwachen können. Demonstriert wird das Verfahren von Hiromi Shimojo, dem Assistenzprofessor meines Labors, der diese neue Technologie entwickelt hat.
Für Dll1 F luziferase Reporter Einführung in NPC, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Pedalreflex in einem embryonalen Tag 12,5 bis 14,5 schwangere Maus vor einem Zwei- bis Drei-Zentimeter-Einschnitt durch den Bauch, entlang der Mittellinie. Legen Sie PBS-getränkte Gaze um den Schnitt, und verwenden Sie ringförmige Zangen, um vorsichtig das rechte Gebärmutterhorn zu extrahieren. Nach dem Zählen der Embryonen, verwenden Sie eine Mikrokapillare, um ein bis zwei Mikroliter gemischte Dll1 F Luziferase Reporter DNA in die Herzkammer des Telencephalons jedes Embryos zu injizieren.
Eine erfolgreiche Injektion führt zur Einhaltung von blauem Farbstoff über der Oberfläche der Gebärmutter. Für die Elektroporation die Gebärmutter und die Elektrode mit PBS befeuchten und den Kopf des ersten Embryos vorsichtig erfassen. Stellen Sie die positiv geladene Elektrode auf die Seite der Hemisphäre, in die die DNA injiziert wurde, und stellen Sie fünf 30-bis 50-Volt-Pulse mit 50 Millisekunden mit einer Pause von einer Sekunde zwischen den Impulsen bereit, um zu überprüfen, ob Blasen aus der negativ geladenen Elektrode erzeugt werden.
Wenn alle Embryonen injiziert wurden, geben Sie das linke Gebärmutterhorn in den Bauch zurück und verwenden Sie eine 17-Millimeter-Nadel, um den Schnitt mit einer 4-0 Seidennaht zu schließen, indem Sie warme PBS in die Bauchhöhle legen, bevor Sie den Verschluss abschließen. Um eine dissoziierte NPC-Kultur aufzubauen, platzieren Sie zuerst die Gebärmutter von einem embryonalen Tag 12,5 bis 14,5 schwangere Dll1 ubiquitinierte luziferase transgene Maus in eine 10-Zentimeter-Petrischale mit 25 Milliliter eiskaltem PBS, und verwenden Sie Mikroschere und feine Zangen, um die Embryonen aus der Gebärmutter zu entfernen. Nach der Enthauptung der Embryonen die Köpfe in eine neue 10-Zentimeter-Petrischale mit eiskaltem DMEM/F12 legen und die Epidermis und den Knorpel entfernen, die jedes Gehirn umgeben.
Übertragen Sie die Gehirne in eine 35-Millimeter-Schale unter einem Sezierendes Mikroskop mit drei Millilitereis-Kaltem N2B27-Medium. Entfernen Sie das rechte und linke Telencephalon aus Diencephalon. Verwenden Sie feine Zange, um die Meningen auf der Oberfläche von Telencephalon zu entfernen und den dorsolateralen Teil des Kortex aus dem Telencephalon zu sezieren.
Wenn alle neuronalen Gewebe von Interesse isoliert wurden, verwenden Sie eine P1000 Pipette, um die Proben in einzelne 1,5-Milliliter-Rohre zu übertragen, und verwenden Sie eine P200 Pipetten, um jedes zusätzliche Medium aus jedem Rohr zu aspirieren. Fügen Sie 100 Mikroliter Papainlösung pro Kortex-Paar hinzu und legen Sie die Proben 15 Minuten lang bei 24 Grad Celsius ab. Am Ende der Inkubation die Proben mit einer neuen P1000 Pipette zehnmal sanft pipetten und die Rohre für weitere 15 Minuten auf 24 Grad Celsius zurückbringen.
Am Ende der Inkubation die Proben vorsichtig wieder pipetten, bevor sie das verdaute Gewebe durch Zentrifugation sammeln. Die Überräube ansaugen und jedes Pellet vorsichtig mit einem Milliliter DMEM/F12-Medium wieder aufsetzen. Zentrifugieren Sie die Proben noch dreimal, wie gerade gezeigt, und setzen Sie jedes Pellet nach jeder Zentrifugation vorsichtig mit einem frischen Milliliter Medium wieder auf.
Nach der letzten Zentrifugation die Pellets in 500 Mikroliter N2B27-Medium, ergänzt mit ein Millimolar-Luzifferin, wieder aufsetzen und einmal 10 bis zu den sechs Zellen aus jeder Probe auf einzelne Poly-L-Lysin-beschichtete Glasbodenschalen aussatoben. Legen Sie dann die Platten für eine Stunde in den Zellkultur-Inkubator. Sobald die Zellen an der Schale haften haben, fügen Sie zwei Milliliter frisches N2B27 Medium plus ein Millimolar Luziferin zu jeder Platte.
Um den Ausdruck von Luziferase-Reportern in NPC-Dissoziationskulturen zu visualisieren, wählen Sie das Öl-Immersionsziel aus und legen Sie die Probenschale auf die Mikroskopstufe. Zeigen Sie das Feld manuell an, um die beste Position zum Anzeigen der Zellen zu bestimmen, und konzentrieren Sie sich auf die zellen von Interesse. Klicken Sie auf Live, um das Testbild zu erfassen, und verwenden Sie das Multi-Dimensional Acquisition-Programm, um die Zeitraffererfassung durch zweidimensionale Lumineszenz und Hellfelderfassungen 24 Stunden lang auszuführen.
Um die Entwicklung von Kortexscheibenkulturen vorzubereiten, ernten Sie einen Tag nach der Reporterinjektion den embryonalen Tag 13,5 bis 14,5 Embryo-Gehirne, wie gezeigt, und legen Sie die Schale mit den Gehirnen auf das Stadium eines fluoreszenz-stereoskopischen Mikroskops. Bestätigen Sie, dass jeder Kortex den injizierten Fluoreszenzreporter unter dem entsprechenden Anregungslicht ausdrückt, und übertragen Sie das Gehirn auf ein Silikonkautschuk-Schneidbrett, das mit 30 Milliliter DMEM/F12-Medium gefüllt ist und mit 100% Sauerstoffgas geblasen wird. Verwenden Sie ein mikrochirurgisches Messer und feine Zange, um die Grenze zwischen dem medialen und seitlichen Teil des dorsalen Telencephalons zu schneiden und das Gewebe in zwei Hemisphären zu trennen.
Dann verwenden Sie das Messer, um den Kortex wie Streifen zu schneiden, um kortikale Scheiben zu erhalten, übertragen Sie die Scheiben in Medium vom Schneidebrett in eine neue 35-Millimeter-Petrischale, wie sie erworben werden. Wenn alle Scheiben gesammelt wurden, legen Sie die schnittige Oberfläche jeder Scheibe auf einen Kultureinsatz, der in eine Glasbodenschale mit angereichertem Medium gelegt wird, wobei die Ausrichtung jeder Scheibe bei Bedarf mit feinen Zangen angepasst wird. Entfernen Sie dann überschüssiges Medium mit einer Pipette und legen Sie die Schale 30 Minuten lang in einen Multi-Gas-Inkubator, der auf 40% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid und 37 Grad Celsius eingestellt ist.
Am Ende der Inkubation, fügen Sie 300 Mikroliter angereichertes Medium mit einem Millimolar Luziferin ergänzt, um die Kulturgericht. Um den Luciferase-Reporterausdruck innerhalb der Scheibenkulturen zu visualisieren, wählen Sie das 40-fache Objektiv aus, und legen Sie die Probenschale auf die Mikroskopstufe. Erfassen Sie ein Testbild der Fluoreszenz und legen Sie die Positions- und Fokusebene unter der Beleuchtung des entsprechenden Anregungslichts auf den Interessenbereich fest.
Führen Sie dann die Zeitraffererfassung durch dreidimensionale Lumineszenz, Fluoreszenz und Hellfelderfassungen 24 Stunden lang aus. Zur Überwachung der Promotoraktivität des oszillierenden Gens Dll1 kann eine ubiquitinierte Luziferase, ein destabilisierter Luziferase-Reporter mit einer Halbwertszeit von etwa 10 Minuten, verwendet werden. Wie ein fluoreszierender Reporter kann der luziferase-Reporter verwendet werden, um die Expressionsdynamik eines Proteins zu überwachen, indem er mit der Genkodierungssequenz von Interesse verschmolzen wird.
Um die Reporterexpression auf einzelzeller Ebene in Gewebekulturen zu visualisieren, kann das Reportergen über die gebärmutterelektroporation transfiziert in NPCs transfiziert werden, wie gezeigt. Darüber hinaus ermöglicht die mikroskopische Bildgebung die Erfassung von Hellfeld-, Fluoreszenz- und Chemilumineszenzbildern. Der Reporter der Dll1-Promoter-Aktivität zeigt einen oszillierenden Ausdruck in NPCs, der aus dem Telencephalon von Dll1 ubiquitinierten F-Luziferase-Reportermäusen abgeleitet ist, wobei der destabilisierte Luziferase-Reporter eine scharfe Auf- und Ab-Regulierung des Ausdrucks der Promotoraktivität anzeigt.
In benachbarten verbesserten grünen fluoreszierenden proteinpositiven Zellen, die Hes1-Reporter und mCherry-positive Zellen tragen, die Dll1-Proteinreporter exdrücken, die während der Beobachtung miteinander in Kontakt kamen, scheint die Expression des Hes1-Reporters etwa 60 Minuten nach dem Kontakt zu beginnen, was darauf hindeutet, dass die Zeitverzögerung für die Übertragung der Notch-Signalisierung zwischen den benachbarten Zellen etwa eine Stunde beträgt. Darüber hinaus weist die Dll1-Proteinexpression während der Signalübertragung eine dynamische Translokation auf. Bei der Erfassung der Biolumineszenz-Bildgebung den Mikroskopraum komplett dunkel halten, da Fremdlicht eine optimale Erfassung verhindern kann.
Jüngste Entwicklungen in der Optogenetik ermöglichen es uns, die Genexpression mit Licht zu kontrollieren. Mit dieser Technik können wir gleichzeitig verschiedene Muster der Genexpression einführen und die Antworten von Luziferase-Reportern überwachen.
