Wir möchten die NSF für die Finanzierung (CBET-0846259) anerkennen.

Siehe Tabelle 1 für die Herstellung von allen Medien, Puffer und Lösungen in diesem Protokoll verwiesen wird. 1. Die Produktion von Aha-markierten Adenovirus <ol><li> Planen elf 100-mm-Gewebekulturschalen von humanen embryonalen Nierenzellen (HEK 293) in HEK 293-Zelle Wachstumsmedium gehalten (siehe Tabelle 1) bei 37 ° C, bis sie 80 erreicht haben, - 90% Konfluenz gezüchtet. (Hinweis:. Kulturen mit mehr als 90% Konfluenz kann es schwierig sein zu infizieren und kann nicht zu Viren wie gewünscht) </li><li> Lösen der Zellen in einer der Schalen, indem zunächst das Wachstumsmedium, einmaligem Spülen mit 5 ml TD-Puffer, dann Inkubieren der Zellen für eine Minute in 1 ml Trypsin-EDTA (1 ×). </li><li> 9 ml von HEK 293-Zelle aus dem Nährmedium, und mit einem Hämocytometer um die Anzahl der geernteten HEK 293-Zellen von dieser Schale zählen. Verwenden Sie diese Nummer, um die Menge von Adenovirus Typ 5 (Ad5) für eine Infektion erforderlich berechnen mit Hilfe eines multiplicity der Infektion (MOI) von 10 PFU / Zelle. Die Tatsache berücksichtigen, dass für den normalen Ad5, die Infektiosität (Verhältnis von infektiösen Partikeln auf die Gesamtzahl der Teilchen) ist typischerweise 1:20. </li><li> Planen 10 ml Puffer-Infektion. </li><li> Entfernen Sie langsam den HEK 293 Zellwachstumsmedium aus den zehn verbleibenden Kulturschalen, dann waschen mit 5 ml TD-Puffer. 1 ml der Infektion Puffer zu jeder Schale und bei 37 ° C für 1 Stunde. Während dieser Periode Infektion, schaukeln sich Kulturschale einer Seite zur anderen im 15-Minuten-Intervallen. </li><li> Nach der Infektion, 9 ml frischer HEK 293-Zelle Wachstumsmedium und Inkubieren bei 37 ° C für 18 Stunden. </li><li> Es werden 100 ml Aha Kennzeichnung Medium (oder Met Steuermedium für die Kontrolle). Achten Sie darauf, um die konzentrierte Stammlösungen mit einem 0,2-um sterile Spritze Filter filtern, bevor die Vorbereitung der Kennzeichnung von Medien. </li><li> Vorsichtig (damit sie nicht weg zu waschen die infizierten Zellen) entfernen Sie die HEK 293 Zellwachstumsmedium nach 18 Stunden einND waschen jede Kulturschale mit 5 ml TD-Puffer. </li><li> Entfernen Sie das TD-Puffer Waschlösung und 10 ml Aha Kennzeichnung Medium zu jeder Kulturschale. Als Kontrolle sollte Methionin Steuermedium anstelle des Aha Kennzeichnung Medium bei diesem Schritt verwendet werden. </li><li> Inkubieren der infizierten Zellen in Markierungen Medium bei 37 ° C für 6 Stunden. Beschriften kann jederzeit durchgeführt werden, zwischen 12 - 24 h nach der Infektion, sollte aber nicht länger als 6 Stunden Dauer. Dieses Intervall wurde bestimmt, um Überschneidungen mit viralen Strukturprotein-Übersetzung zu maximieren und gleichzeitig die Infektiosität nicht wesentlich vermindert. 7 </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Kennzeichnung Medium, um nicht zu stören, die Zellen. 10 ml frisch HEK 293 Zellwachstumsmedium zu jedem Gericht und Inkubation der Zellen bei 37 ° C für weitere 18 Stunden. Um den Verlust von infizierten Zellen während dieses Schritts zu minimieren, ist es nicht erforderlich, die Kennzeichnung, die vollständig zu entfernen. Die HEK 293-Zelle Wachstumsmedium enthält einen Überschuss an Met was wird outcompete restliches Aha. </li><li> Schritt 3 für die Reinigung fort. </li></ol> 2. Herstellung von Azido-Zucker-markierten Adenovirus <ol><li> Folgen Sie den Anweisungen unter dem Titel Die Produktion von Aha-markierten Adenovirus bis einschließlich Schritt 1.5. </li><li> Bereiten Sie 100 ml Azido-Zucker Kennzeichnung Medium. </li><li> Decken Sie die Zellen mit 10 ml frischem Azido-Zucker Kennzeichnung Medium und Inkubation bei 37 ° C für 44 Stunden. </li></ol> 3. Die Reinigung von Azid-markierten Adenovirus-Partikeln <ol><li> Entfernen Sie die Medien zusammen mit den infizierten Zellen aus jeder Kulturschale und Transfer zum konischen Röhrchen. Zentrifugieren bei 2.000 g für 10 min bei 4 ° C Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in TD-Puffer (mit 8 ml TD-Puffer pro 10 Gerichte). </li><li> Lyse der infizierten Zellen durch wiederholte (3 oder mehr) Frost-Tau-Zyklen mit Hilfe eines Dewar-Gefäß mit flüssigem Stickstoff und einem 37 ° C warmes Wasserbad. Zentrifugieren bei 2.000 g für 10 minbei 4 ° C, um die Zelltrümmer aus dem Überstand abzutrennen. </li><li> Vorbereiten einer CsCl-Dichtegradienten-Zentrifugenröhrchen pipettiert, indem zuerst 2,5 ml 1,25 g / ml CsCl-Lösung in eine Ultra Clear Zentrifugenröhrchen. Als nächstes wird mit einer Pipette mit seiner Spitze an der Unterseite des Rohrs positioniert ist, um langsam 2,0 ml von 1,4 g / ml CsCl-Lösung, dabei nicht um den Gradienten-Schnittstelle zu stören. </li><li> Pipettieren des Überstands von Schritt 3.2 auf dem CsCl-Dichtegradienten-Rohr, und ggfs. TD Puffer, um die Röhre zu füllen. Zentrifugieren Sie die Proben in einem Ausschwingrotor bei 125.000 g für 1 Stunde bei 15 ° C in einer Ultrazentrifuge. </li><li> Nach Beendigung der Ultrazentrifugation, sollte die Viruspartikel sichtbar als eine dicke weiße Band an der Grenzfläche der beiden CsCl-Lösungen. Einen kleine Perforation an der Unterseite des Rohres mit einer sterilen Nadel, daß die Lösung tropfenweise zu entwässern. </li><li> Sammeln Sie die dicken weißen Band, sollte das enthalten die markierten Partikel Ad5, taking Sorgfalt auszuschließen überschüssige CsCl-Lösung. Vermeiden Sammeln zelluläre Proteine, die über der Schicht-Virus Band. Zusätzlich auszuschließen leer Virion Kapside, die eine leichtere Schicht leicht über dem dicken weißen Virus Band zu gründen. </li><li> Optional kann eine endgültige Reinigung auf den markierten Ad5 Partikel. In der gesammelten Fraktion aus Schritt 3.6 mit einem 4-ml Ultrazentrifuge Röhrchen und füllen das Rohr mit 1,35 g / ml CsCl-Lösung. Zentrifugieren bei 125.000 g für 18 h bei 15 ° C und sammelt das dicke weiße Bande, die in der Mitte des Rohres wie in den Schritten 3.5 und 3.6 beschrieben bildet. (Beachten Sie, dass, wenn der virale Titer niedrig ist, ein weißes Band möglicherweise nicht sichtbar nach der zweiten Zentrifugation, und es wird nicht möglich sein, um den markierten Virus wiederherzustellen). </li><li> Für die Lagerung der Viruspartikel über lange Zeiträume, sollte Dialyse des abgefangenen Virus Extrakt gegen Viren Speicherpuffer durchgeführt werden. Lagern Sie die dialysierte Virus-Proben bei -80 ° C </li></ol> 4. LiEINZUGEHEN von modifizierten Adenovirus-Partikeln mit Alkin-Probes mit dem Stamm-Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC) <ol><li> Zu einer Lösung von 50 ul azidmodifizierten Ad5 Virus in Speicher-Puffer, fügen 0,25 ul SPAAC Kennzeichnung Lösung. (Siehe Tabelle von Reagenzien für eine Liste von Verkäufern im Handel erhältliche gespannten Alkinen). </li><li> Lassen Sie die spannungskatalysierten Cycloaddition über Nacht bei Raumtemperatur. Wenn ein Licht-empfindliche Sonde (zB TAMRA) verwendet wird, deckt das Reaktionsgefäß mit Aluminiumfolie. </li><li> Reinigen Sie die markierten Virus nach 6 fort. </li></ol> 5. Ligation modifizierte adenovirale Partikel mit Alkin-Sonden unter Verwendung von Kupfer (I)-Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) in entgastem Atmosphere <ol><li> Platz 7,2 mg Kupfer (I) bromid (CuBr) Pulver in ein Eppendorf-Röhrchen, mit Aluminiumfolie abgedeckt. </li><li> Pipettieren von 1 ml DMSO in einem zweiten Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Vorbereiten50 ul CuAAC Kennzeichnung Lösung in einem dritten Eppendorf-Röhrchen. Mit Alufolie abdecken, wenn das Alkin Sonde ist lichtempfindlich (zB TAMRA-Alkin). </li><li> Legen Sie die drei Eppendorf-Röhrchen, nicht begrenzten, in einem desoxygeniertem Handschuhsacks für 6 Stunden. Alle Proben sollten im Inneren des Handschuhs Beutel bis zum Abschluss der CuAAC bleiben. </li><li> Herstellen einer 50 × Stammlösung von CuBr durch Zugabe von 1 ml DMSO und 7,2 mg CuBr Pulver, die beide gemäß 5.4 Schritt wurde von Sauerstoff befreit. </li><li> Initiieren Sie die CuAAC durch Pipettieren 1 ul dieser CuBr Stammlösung zu 50 ul der CuAAC Kennzeichnung Lösung, die nach 5.4 Schritt wurde von Sauerstoff befreit. Lassen Sie die Reaktion für 12 Stunden in der Glovebag gehen. </li><li> Reinigen Sie die markierten Virus nach 6 fort. </li></ol> 6. Reinigung und Lagerung von Labeled Viruspartikeln <ol><li> Aufreinigung der markierten Virus Proben mittels Centri-Sep Gelfiltration Spin columns äquilibriert mit Virus Lagerpuffer, nach den Richtlinien des Herstellers. </li><li> Alternativ kann die Reinigung durch Dialyse gegen Virus Lagerpuffer durchgeführt werden. </li><li> Die markierten Viruspartikeln sollten bei -80 ° C gelagert werden </li></ol> 7. SDS-PAGE von Labeled Adenovirus &amp; Fluoreszenzgel Scanning <ol><li> Je 20 ul Laemmli-Probenpuffer (2 ×) bis 20 ul des gereinigten Virus beschriftet und die Mischung 10 min. Zentrifugieren Sie die Proben für 30 Sekunden, jede unlösliche Niederschläge zu entfernen. Wenn Restkupfer ist nach der Reinigung gibt, können Kochen der Probe in dicken Streifen von Protein auf der SDS-PAGE-Gel führen, was Schwierigkeiten bei der Visualisierung. In diesem Fall verzichtet Sieden der Probe in diesem Schritt. </li><li> Bringen Sie die Gelkassette dem Elektrophorese-Zelle und fügen Laufpuffer. Laden Sie die benötigte Anzahl von Vertiefungen mit den viralen Protein-Proben. Verwenden Sie eine gut vor, stai ladenNed Molekulargewichtsmarker. Führen Sie das Gel für 1 Stunde bei 200 V. Halten Sie die Elektrophorese-Zelle mit Alu-Folie während des gesamten Zeitraums gedeckt zu reduzieren Ausbleichen des Fluorophors Etikett. </li><li> Für eine optimale Auflösung und damit alle freien Fluorophor zu entfernen, damit das Tracking-Farbstoff zu laufen aus dem Gel während der Elektrophorese. Stoppen Sie die Elektrophorese und schnelle Übertragung des Gels mit einem fluoreszierenden Gel-Scanner und scannen Sie das Gel für die Fluoreszenz-Emission bei der entsprechenden Wellenlänge (574 nm für TAMRA). </li><li> Die Anzahl der Farbstoffmoleküle, konjugiert an jedem viralen Partikel können durch Messen der Fluoreszenz von mehreren Standard-TAMRA-Konzentrationen und Vergleichen mit der Probe aus Schritt 7.3 quantifiziert werden. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Die beobachteten Ergebnisse der SDS-PAGE-Gel &amp; fluoreszierende Scannen von TAMRA-konjugierten Ad5 sind in Abbildung 3 dargestellt. Obwohl diese fluoreszierende Gel-Scans wurden an Proben durchgeführt ModiFied über CuAAC, sollten die Ergebnisse vergleichbar sein, wenn Sonden über SPAAC werden ligiert. Diese Gel-Scans zeigen, dass Aha Kennzeichnung Ergebnisse in der Modifikation der drei Ad5-Capsidproteine ​​(Hexon, Penton und Fiber) und Zucker Kennzeichnung ändert nur das Fiber-Kapsidprotein. Darüber hinaus eine Erhöhung der Konzentration Aha (4 mM gegenüber 32 mM) führt zu einem größeren Grad von Aha Einbau, aber es ist auch gezeigt worden, um die Infektionsgefahr zu verringern. Vor 7 Ergebnisse zeigen, dass für Ad5 in 4 mM produziert Aha, rund 5% des exponierten Standorten TAMRA-Methionin modifiziert, mit diese Zahl stieg auf 10% bei 32 mM Aha verwendet wird, sind. Dies entspricht etwa 280 und 510, bzw. Farbstoff-markierten Stellen pro Ad5 Teilchens. Die Analyse der Zucker-Kennzeichnung 1 hat gezeigt, dass rund 22 der 36 Glykosylierungsstellen auf Ad5 durch eine Azido Zucker belegt und anschließend mit TAMRA beschriftet. Wenn zehn Zellkulturplatten werden verwendet, um azidmodifizierten Ad5 produzieren wie beschrieben<html> in diesem Protokoll, 200 - 300 ul sollte azidmodifizierten Virus aus dem weißen Band in Schritt 3.6 gesammelt werden, werden mit einem Titer von etwa 1,5 × 10 12 Partikel / ml. Eine häufige Schwierigkeit dieses Verfahrens ist das Fehlen eines viralen Bande bei diesem Reinigungsschritt, was zu einer geringen Virustiter zurückzuführen ist. Dies ist im Allgemeinen ein Ergebnis der Infektion von Zellen, die entweder über-oder unter-konfluent, oder durch Waschen entfernt Zellen sind -, die sich aus der Platte nach der Infektion gelockert - beim Spülen während Schritt 1. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. Protokoll Überblick. Azidhaltigen Aha oder GalNAz wird zunächst in Adenovirus-Partikeln eingearbeitet. Ligation mit einem Fluoreszenz-Alkin-Sonde wird dann über &quot;Klick&quot;-Chemie durchgeführt. Schließlich wird SDS-PAGE verwendet, um die Ligation der fluoreszierenden Sonde nachzuweisen. bbildung 2 &quot;/&gt; Abbildung 2. Ligation von Alkin-Sonde auf Azid-modifizierten Virus über (a) SPAAC, (b) CuAAC unter de-Sauerstoff angereichert und (c) mit Sauerstoff angereicherten Atmosphäre. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Fluoreszenz-Scans von SDS-PAGE von Azid-markierten Adenovirus Typ 5 (Ad5) nach CuAAC Konjugation mit TAMRA-Alkin. (A) Aha-markierten Ad5, mit zwei Konzentrationen von Aha. Markierung erscheint auf dem Adenovirus Hexon, Fiber Penton und Capsidproteine ​​auftreten, wobei das Ausmaß der Erhöhung Kennzeichnung mit erhöhter Konzentration Aha. (B) AC 4 GalNAz-markierten Adenovirus scheint nur auf der Faser Kapsid-Protein markiert werden. <table border="1"><tbody><tr><td> Lösung </td><td> Vorbereitung </td><td> Hinweise </td></tr><tr><td> Ad5-Speicherpuffer </td><td> 5 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), 0,5 mM MgCl 2, 50 mM NaCl, 25% (v / v) Glycerin und 0,05% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA) </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Ad5 Infektion Puffer </td><td> 2% (v / v) Kälberserum, 1 × Tc-Lösung, Ad5 in Vorratspuffer (Volumen unter Verwendung einer MOI von 10 PFU / Zelle und einer Infektiosität Index von 1:20). Man bringt die Lösung auf das Endvolumen mit TD-Puffer </td><td> Ad5-Konzentration kann durch UV-Absorption bestimmt werden. </td></tr><tr><td> TC-Lösung (200 ×) </td><td> 136 mM CaCl 2, 100 mM MgCl 2 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> TD-Puffer </td><td> 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,07 mM Na 2 HPO 4 und 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> HEK 293-Zelle Wachstumsmedium </td><td> Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% (v / v) Kälberserum (BCS) und 1% (v / v) Pen Strep ergänzt </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Cys-Stammlösung (100 ×) </td><td> DMEM (-Met / Cys-) mit 200 mM L-Cystein ergänzt </td><td> Bereiten Sie frische und Filter mit einem 0,2-um sterile Spritze-Filter vor dem Gebrauch. </td></tr><tr><td> Aha-Stammlösung (25 ×) </td><td> DMEM (-Met / Cys-) mit 100 mM L-Azidohomoalanine ergänzt </td><td> Bereiten Sie frische und Filter mit einem 0,2-um sterile Spritze-Filter vor dem Gebrauch. </td></tr><tr><td> Aha Kennzeichnung Medium </td><td> DMEM (-Met / Cys-) mit 10% BCS, Aha-Stammlösung (1 ×), 2 mM L-Cystein ergänzt </td><td> Bereiten Sie vor Gebrauch frisch. Dies entspricht einer 4 mM conzentration von Aha, obwohl unterschiedlichen Konzentrationen verwendet werden (siehe repräsentative Ergebnisse) werden. </td></tr><tr><td> Met-Stammlösung (25 ×) </td><td> DMEM (-Met / Cys-) mit 100 mM L-Methionin ergänzt </td><td> Bereiten Sie frische und Filter mit einem 0,2-um sterile Spritze-Filter vor dem Gebrauch. </td></tr><tr><td> Met Steuermedium </td><td> DMEM (-Met / Cys-) mit 10% BCS ergänzt, Met-Stammlösung (1 ×), 2 mM L-Cystein </td><td> Bereiten Sie vor Gebrauch frisch. </td></tr><tr><td> AC 4 GalNAz Stammlösung (1000 ×) </td><td> 50 mM N-peracetylierten azidoacetylgalactosamine (AC 4 GalNAz) in Methanol </td><td> Lagerung bei 4 ° C. AC 4 GalNAz ist ein metabolischer Vorläufer zu GlcNAz. </td></tr><tr><td> Azido-Zucker Kennzeichnung Medium </td><td> 100 ul AC 4 GalNAz Stammlösung, 100 ml HEK 293 Zellwachstumsmedium </td><td> Willkommen Methanol zu verdampfen, um vor Zugabe HEK 293-Zelle Wachstumsmedium. </td></tr><tr><td> Cäsiumchlorid Lösungen </td><td> CsCl in TD-Puffer gelöst: 1,25 g / ml (18,08 g / 50 ml H 2 O) 1,35 g / ml (25,60 g / 50 ml H 2 O) 1,40 g / ml (31,00 g / 50 ml H 2 O) </td><td> Dichtegradienten-Ultrazentrifugation für </td></tr><tr><td> Virus-Speicherpuffer </td><td> Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2, enthaltend 0,5 mM CaCl 2, 0,9 mM MgCl 2 und 10% (v / v) Glycerin </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> TAMRA-BCN (SPAAC) Etikettierlösung </td><td> TAMRA-BCN in DMSO: <ol><li> Verwenden Sie UV-ABAbsorbanz (OD 260-Assay), um den Titer des Virus-Lösung in Schritt 4.1 zu bestimmen </li><li> Die Gesamtzahl der viralen Partikel in der 50 ul Aliquot (N Ad5) </li><li> Die TAMRA-BCN Molarität (in M) bestimmt wird durch: c BCN = 4 × 10 8 × (N Ad5 / N Avo) N = Avo 6,022 × 10 23 (So ​​dass das Reaktionsgemisch in Schritt 4 hergestellt 100 Alkin Sonden pro Virion enthält) </li></ol></td><td> Spannungskatalysierten Alkin-Sonde Für SDS-PAGE, ein viraler Titer von ca. 10 12 Partikel / ml wird vorgeschlagen </td></tr><tr><td> TAMRA-Alkin (CuAAC) Etikettierlösung </td><td> 50 ul azidmodifizierten Ad5 Virus in Speicher-Puffer (N Ad5 wie oben bestimmt), 1,5 mM Batho<html> Phenanthrolin disulfonat (dh 1,5 × CuBr endgültige Konzentration), TAMRA-Alkin. TAMRA-Alkin-Molarität (in Mio.) wird unter Verwendung von: c Alk = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N Avo) (So ​​dass das Reaktionsgemisch in Schritt 5 hergestellt 100 Alkin Sonden pro Virion enthält) </td><td> Tris-Puffer ist dafür bekannt, eine wettbewerbsfähige und inhibitorische Liganden von Kupfer sein. 8 </td></tr><tr><td> Laemmli-Probenpuffer (2 ×) </td><td> 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (w / v) SDS, 20% (v / v) Glycerin, 10% (v / v) 2-Mercaptoethanol und 0,004% (w / v) Bromphenolblau </td><td></td></tr><tr><td> Laufpuffer </td><td> 187 mM Glycin, 19 mM Tris-HCl, 3,5 mM SDS in H 2 O </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr></tbody></table>t &quot;&gt; Tabelle 1. Vorbereitung der Puffer und Lösungen durch dieses Protokoll benötigt.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Entwicklung der chemoselektiven und bioorthogonale Click-Reaktionen, einschließlich derer von Aziden, ist eine sich schnell entwickelnde Gebiet der Forschung, und anschließend gibt es eine wachsende Zahl dieser Reaktionen aus für Biokonjugation Anwendungen wählen. Wir haben den Rahmen dieses Protokoll darauf beschränkt, nur zwei Methoden, die wegen ihrer Nützlichkeit in unserem eigenen Labor und kommerzielle Verfügbarkeit aller Reagenzien wurden so gewählt sind. In der ersten sol...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Adenovirus Typ 5 (Ad5), die ein GFP-Transgen </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td> Menschliche embryonale Nieren (HEK 293-Zellen) </td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td> Dulbecco modifiziertes Eagle Medium (DMEM), hohe Glucose </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td> Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, kein Methionin, Cystein nicht (DMEM-Met / Cys-), High Glucose </td><td> Invitrogen </td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td> Rinderkalbserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td> Penicillin - Streptomycin 100 × Solution (Pen Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> 0,5% Trypsin-EDTA (10 ×) </td><td&gt; Invitrogen </td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> 100 mm Zellkulturschale, Gewebekultur-behandelte Polystyrol </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> Zellkultur CO 2-Inkubator </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hämozytometer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biosicherheitswerkbank </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sterile Spritze Filter (0,2 mu m, Celluloseacetat) </td><td> VWR </td><td> 28145-477 (NA), 514-0061 (Europa) </td></tr><tr><td> Avanti JE Zentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369001 </td></tr><tr><td> Konischen Röhrchen (50 ml, steril) </td><td> BD Falcon </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13,2 ml, 14 x 89 mm </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td></tr><tr><td> Ultrazentrifugation ausgestattet mit einem SW 41 und SW 60 Rotor </td><td> Beckman </td><td></td></tr><tr><td> Biopur Safe-Lock Reaktionsgefäße, 1,5 ml </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td> Centrifuge 5418 </td><td> Eppendorf </td><td> 5418 </td></tr><tr><td> Centri-Sep Gelfiltration Spin Columns </td><td> Princeton Separations </td><td> CS-901 </td></tr><tr><td> Sterile Nadel 18 Gauge </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stickstoff Glovebag (wenn desoxygenierten CuAAC durchgeführt werden soll) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dewar-Gefäß </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Flüssiger Stickstoff </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elektrophorese-Zelle </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenzgel Scanner </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ready Gel Tris-HCl-Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> AnaSpec </td><td> 63669 </td></tr><tr><td> Jena Biosciences </td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td> Peracetylierten N-azidoacetylgalactosamine (AC 4 GalNAz) </td><td> Invitrogen </td><td> C33365 </td></tr><tr><td> Thermo Scientific </td><td> 88905 </td><td></td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td> Bathophenanthrolindisulfonsäure (BDA) Dinatriumsalz </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tris-Base (Tris (hydroxymethyl) aminomethan) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dinatriumphosphat (Na2 HPO 4) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 M HCl </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycerin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-Cystein </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-Methionin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS (Natriumdodecylsulfat) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bromphenolblau </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cäsiumchlorid (CsCl) </td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Kupfer (I) bromid (CuBr) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Calciumchlorid (CaCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kaliumchlorid (KCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid (MgCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Natriumchlorid (NaCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Alkin-Sonde für CuAAC * </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA Alkin </td><td> Invitrogen </td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Gespanntes Alkin-Sonde für SPAAC * </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA DIBO Alkin </td><td> Invitrogen </td><td> C10410 </td></tr></tbody></table> * Bekannte Anbieter von Klick-Chemie Reagenzien und Kits beinhalten Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click-Chemie-Tools, und baseclick. Eine Vielzahl von Alkin Farbstoffe und Targeting-Liganden können in diesen Anbietern &#39;Katalogen.

chemoselective modification of viral surfaces via bioorthogonal click chemistry

Die Modifikation von Viruspartikeln ist eine signifikante Menge an Aufmerksamkeit für die ein enormes Potenzial für ein Aufschlagen Gentherapie, onkolytischen Anwendungen und die Entwicklung von Impfstoffen erhalten. 1,2,3 Aktuelle Ansätze zur Modifizierung viralen Oberflächen, die meist Genetik-basiert sind, oft von der Dämpfung leiden Virus-Produktion, Infektiosität und zellulären Transduktion. Mit 4,5 chemoselektive Klick-Chemie, haben wir eine einfache alternative Methode, die diese Probleme umgeht, während verbleibenden hoch flexibel und zugänglich entwickelt. 1,2 Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirksamkeit der Verwendung bioorthogonalen Click-Chemie, die Oberfläche des Adenovirus Typ 5-Teilchen zu modifizieren demonstrieren. Dieses zweistufige Verfahren kann sowohl therapeutisch 1 oder analytisch 2,6 verwendet werden, wie es für die chemoselektive Ligation von Targeting-Moleküle, Farbstoffe oder andere Moleküle von Interesse erlaubt an Proteinemit Azid-Tags voretikettiert. Die drei wichtigsten Vorteile dieser Methode sind, dass (1) metabolische Markierung wenig bis gar keine Auswirkungen auf die virale Fitness, 1,7 demonstriert (2) eine breite Palette von Effektor-Liganden können verwendet werden, und (3) Es ist bemerkenswert schnelle, zuverlässige und einfach zu erreichen. 1,2,7 Im ersten Schritt dieses Verfahrens werden Adenoviruspartikel hergestellt trägt entweder azidohomoalanine (Aha, ein Methionin Surrogat-) oder die unnatürliche Zucker O-verknüpfte N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), die beide das Azid (N-3) funktionelle Gruppe. Nach der Reinigung der azidmodifizierten Viruspartikel, wird ein Alkin Sonde, die die fluoreszierende TAMRA-Einheit in einem chemoselektive Weise wie die Vor-markierte Proteine ​​oder Glykoproteine ​​ligiert. Schließlich wird eine SDS-PAGE-Analyse durchgeführt, um die erfolgreiche Ligation von der Sonde auf der viralen Capsidproteine ​​zu demonstrieren. Aha Inkorporation wird gezeigt, dass alle Viruskapsids beschriftenProteine ​​(Hexon, Penton und Fiber), während die O-Aufnahme resultiert in GlcNAz Kennzeichnung von Fiber nur. In diesem sich entwickelnden Gebiet, haben mehrere Methoden für die Azid-Alkin-Ligation erfolgreich entwickelt, jedoch nur die beiden haben wir festgestellt, dass die bequemste haben werden hier gezeigt - Dehnungs-Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC) und Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) unter Sauerstoff befreiten Atmosphäre.

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Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

Adenovirus-Partikeln wurden entwickelt, um entweder die unnatürliche Aminosäure analogen azidohomoalanine oder die Azido Zucker enthalten<em&gt; O</em&gt;-GlcNAz. Die Azidgruppe eines jeden wird chemoselektiv über &quot;Klick&quot;-Chemie Reaktionen als mittels viraler Oberflächenmodifizierung ligiert.

Chemoselektive Modifizierung von Oberflächen durch Viral Bioorthogonale Click-Chemie

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

chemoselective-modification-viral-surfaces-via-bioorthogonal-click

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.8K Aufrufe.  Stony Brook University. Adenovirus-Partikeln wurden entwickelt, um entweder die unnatürliche Aminosäure analogen azidohomoalanine oder die Azido Zucker enthalten O-GlcNAz. Die Azidgruppe eines jeden wird chemoselektiv über "Klick"-Chemie Reaktionen als mittels viraler Oberflächenmodifizierung ligiert.

Serie: Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Isolierung von Fidelity Varianten von RNA-Viren und Charakterisierung von Virus-Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab Sampling Verfahren zum Nachweis von humanem Norovirus auf Oberflächen

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum-Bindungsassay, der die Drug Penetration in Tuberkulose-Läsionen vorhersagt

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...