Wir bedanken uns bei RB Tesh für die Bereitstellung der Maus polyklonalen anti-RVFV Antiserum und M. Griffin des UTMB Durchflusszytometrie Core Facility für die Hilfe bei der Durchflusszytometrie. Diese Arbeit wurde von 5 U54 AI057156 durch die Western Regional Center of Excellence, NIH R01 AI08764301 und Mittel aus dem Center for Vaccine Sealy Development bei UTMB.BK unterstützt wurde durch den James W. McLaughlin Fellowship Fund bei UTMB.OL wurde abgestützt durch eine Maurice R. Hilleman Frühe-Phase Karriere Investigator Award.

Analyse der Transkription durch Fluoreszenzmikroskopie 1. Zellen infizieren mit MP-12 und Label-Nascent RNA mit EU <ol><li> Platz 12-mm runde Deckgläschen in 12-Well-Gewebekulturplatte, ein Deckglas pro Well. </li></ol> Hinweis: Wenn Zellen haben Probleme Einhaltung Deckgläser, Mantel mit Poly-L-Lysin (MW ≥ 70.000), bevor sie in Brunnen. Zu diesem Zweck tauchen Deckgläser in einer sterilen 0,1 mg / ml in H 2 O aus Poly-L-Lysin für 5 min. Spülen Deckgläser mit sterilem H 2 O und der Luft trocknen für mindestens 2 Stunden. <ol start="2"><li> Um Saatgut 293 Zellen auf Deckgläser werden 5 x 10 4 Zellen in 1 ml Wachstumsmedium (DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, 100 U / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin) pro Vertiefung. Inkubieren in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 O / N. </li><li> Infect Zellen mit MP-12 mit einer Multiplizität der Infektion (moi) von 3. Mindestens zwei<html> infizierten Wells: eine der beiden Bohrungen werden als nicht infizierte Kontrolle zu dienen, wird die andere mit Actinomycin D (ActD) im Schritt 1.5 als Kontrolle für die transkriptionelle Unterdrückung behandelt werden. Entfernen Wachstumsmedium und verdünnen das Virus Lager, so dass das Gesamtvolumen in jede Vertiefung gegeben ist 200 ml. Inkubation für 1 Stunde in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> Hinweis: Anstelle Infizieren von Zellen, Zellen können auch mit Plasmid-DNA transfiziert werden oder in vitro synthetisierte RNA kodierend eine spezifische virale Protein. Zu diesem Zweck Transfektion von Zellen mit einem geeigneten chemischen Transfektionsreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers, und fahren bis 1,5 bei 16 Stunden nach der Transfektion Schritt. Es ist ratsam, die Transfektionsbedingungen und Inkubationszeit vor RNA-Markierung und Fixierung optimieren. <ol start="4"><li> Entfernen Inokulum und 1 ml frisches Wachstumsmedium pro Vertiefung. Bei 37 ° C für 15 Stunden. </li></ol>ove_content &quot;&gt;. Hinweis: Wenn die Anpassung dieses Protokoll für die Verwendung mit einem anderen Virus, ist es ratsam, einen Zeitverlauf Experiment durchführen, um den optimalen Zeitpunkt für die RNA-Markierung und Fixierung bestimmen Richten Sie diese Zeit natürlich so, dass die Infektion Zeiten gestaffelt sind und alle Proben markiert, fixiert und gefärbt gleichzeitig. <ol start="5"><li> Bei 15 Stunden nach der Infektion (hpi), ersetzen Wachstumsmedium mit Medium mit 1 mM EU. Um eines der mock infizierten Brunnen, auch die 5 ug / ml ActD. Dies wird als Quelle für die transkriptionelle Unterdrückung dienen, wie ActD hemmt die DNA-abhängige RNA-Synthese. Zurück Zellen in den Inkubator. </li><li> Mit 16 hpi, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Deckgläschen einmal mit 1 ml PBS (KCl 0,20 g / L, KH 2 PO 4 0,20 g / L, NaCl 8,00 g / L, Na 2 HPO 4 1,15 g / L, pH 7,4) pro Vertiefung. Fix Zellen durch Zugabe von 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) pro Vertiefung und Inkubieren für 30 min bei RT. </li></ol>Hinweis: Um 4% PFA Fixierung Lösung vorzubereiten, löst 10 g Paraformaldehyd in 150 ml H 2 O auf 60 ° C auf einem beheizten Magnetrührer. In 500 ul 1 M NaOH und weiter rühren, bis die Lösung klar wird. Filter PFA-Lösung durch einen Papierfilter, um Partikel zu entfernen und hinzufügen 62,5 ml Phosphat-Puffer (77 mM NaH 2 PO 4, 287 mM Na 2 HPO 4, pH 7,4). In H 2 O bis zu einem Gesamtvolumen von 250 ml. Einfrieren bei -20 ° C in Einzel-Portionen. <ol start="7"><li> Waschen einmal mit 1 ml PBS pro Vertiefung. Keine Inkubationszeit für diese und alle nachfolgenden Waschschritte erforderlich. Fahren Sie direkt mit Schritt 2 fort. </li></ol> Anmerkung: Es ist wichtig, um sofort mit dem Click-Reaktion fortfahren, da die RNA degeneriert, wenn zu diesem Zeitpunkt für einen längeren Zeitraum gehalten werden, ein Verlust der RNA Fluoreszenzsignal bereits beobachtet, wenn die Zellen für 1 Stunde bei 4 ° C werden . Und falls probilden einen Zeitverlauf Experiment ist, lesen Sie Label, zu beheben, und färben alle Proben gleichzeitig. 2. Klicken Reaktion auf markierten RNA-Erkennung <ol><li> Durchdringbar Zellen durch Zugabe von 1 ml 0,2% Triton X-100 in PBS. Inkubieren für 10 min bei RT. </li></ol> Hinweis: Alle Lösungen in den Schritten 2.1 bis 2.3 müssen nucleasefreiem sein. <ol start="2"><li> Dreimal mit 1 ml PBS pro Vertiefung. </li><li> Entfernen Deckgläser von 12-Well-Platte und Transfer in der feuchten Kammer. Cover jede Deckglas mit 50 - 100 ul Klick Färbelösung (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO 4, 20 uM fluoreszierenden Azid [Anregung / Emission maximal: 590/617 nm], 100 mM Ascorbinsäure) jeder. Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln. </li></ol> Hinweis: Zur Montage der feuchten Kammer, die untere Linie einer Zellkultur oder in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm mit Kunststoff-Folie Paraffin. Die die Innenseite des Randes des dish mit feuchten Papiertüchern. Legen Sie die Deckgläser auf die Kunststoff-Folie Paraffin. Hinweis: Achten Sie darauf, lassen Sie die Deckgläser austrocknen während diesem oder einem anderen Schritt in das Protokoll. Es ist am besten, um die Färbelösung jedem Deckglas direkt nachdem es in der feuchten Kammer platziert wurde hinzuzufügen. Hinweis: Bereiten Sie das Click Färbelösung frisch unmittelbar vor diesem Schritt. Stammlösungen von 1,5 M Tris, pH 8,5, 100 mM CuSO 4 und 500 mM Ascorbinsäure bei 4 ° C gelagert werden Allerdings verwerfen jede Ascorbinsäure stock Lösung, die gelb geworden ist. Hinweis: Achten Sie darauf, ein Fluorophor, die die Filter auf Ihrem Fluoreszenz-Mikroskop passt zu wählen. <ol start="4"><li> Entfernen Deckgläser aus der feuchten Kammer und in einen frischen 12-Well-Platte und dreimal mit 1 ml PBS pro Vertiefung. </li></ol> Hinweis: Wenn kein deSchutz von viralen Proteinen gewünscht wird, Deckgläser montiert werden kann und abgebildet nach diesem Schritt (gehen Sie zu Schritt 3.3). 3. Immunfluoreszenz zu Expression viraler Proteine ​​erkennen <ol><li> 1 ml Blockierungspuffer (3% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS) in jede Vertiefung und Inkubieren für 30 min bei RT im Dunkeln. </li><li> Entfernen Deckgläser von 12-Well-Platte, Transfer in die feuchte Kammer und decken mit 50 - 100 ul primären Antikörper (anti-RVFV, eine Art Geschenk von Dr. RB Tesh, UTMB) in Blocking-Puffer (1:500) verdünnt. Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln. </li></ol> Hinweis: Bei der Anpassung dieses Protokoll für die Verwendung mit einem anderen Virus, bestimmen die optimale Verdünnung für Ihre primäre Antikörper zuerst. Hinweis: Alternativ kann dieser Schritt O / N bei 4 ° C durchgeführt werden, in der Dunkelheit. <ol start="3"><li> Entfernen Deckgläser aus der feuchten Kammer und Ort wieder in 12-Well-Platte und waschendreimal mit 1 ml PBS pro Vertiefung. </li><li> Entfernen Deckgläser von 12-Well-Platz, Platz in der feuchten Kammer und Deckel mit 50 - 100 ul sekundären Antikörper (anti-Maus-IgG konjugiert mit Fluoreszenzfarbstoff [Anregung / Emission maximal: 495/519 nm]) in Blocking-Puffer (1 verdünnt: 500). Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln. </li></ol> Hinweis: Achten Sie darauf, einen sekundären Antikörper, der Ihre primäre Antikörper erkennen und passt die Filter auf Ihrem Fluoreszenz-Mikroskop zu wählen. Hinweis: Falls gewünscht, 200 ng / ml DAPI können an den sekundären Antikörper Verdünnung zugesetzt werden, um Kerne zu visualisieren. <ol start="5"><li> Entfernen Deckgläser aus der feuchten Kammer und Ort wieder in 12-Well-Platte und dreimal mit 1 ml PBS pro Vertiefung. </li><li> Montieren Deckgläser, indem ein Tropfen (ca. 15 ul) Fluoromount-G auf einen Objektträger. Tauchen Sie das Deckglas in H 2 O, entfernen überschüssiges H 2 O durch Berühren the Seite gegen ein Papiertuch und Ort Zell-Seite nach unten in den Tropfen Fluoromount-G. Air trocken für 5 min. </li></ol> Hinweis: Wenn Bildgebung auf einem inversen Mikroskop, ermöglichen Fluoromount-G bei 4 ° erstarren CO / N oder bringt die Deckgläser auf die Objektträger durch Abdichten der Kante mit transparenter Nagellack. Hinweis: Folien kann sofort abgebildet werden oder bei 4 ° C im Dunkeln bis zu einer Woche. 4. Erfassung von Daten <ol><li> Bild mit einem Fluoreszenz-Mikroskop. </li></ol> Hinweis: Achten Sie darauf, geeignete Fluorophore, die visualisiert werden können mit Ihrem Mikroskop zu wählen. Zum Vergleich sind die folgenden die Fluorophore und Filter-Sets verwendet werden, um die Bilder in dieser Veröffentlichung gezeigt erwerben. DAPI: Anregung Filter: BP 330-385 Dichromatic Spiegel: DM 400 Emission Filter: LP 420 Anregung Filter: BP 460-490 Dichromatic Spiegel: DM 505 Emission Filter: LP 510 Fluorophor mit einer Anregung / Emission maximal 590/617: Anregung Filter: BP 545-580 Dichromatic Spiegel: DM 600 Emission Filter: LP 610 Analyse der Transkription mittels Durchflusszytometrie 5. Zellen infizieren mit MP-12 und Label-Nascent RNA mit EU <ol><li> Seed 293-Zellen in 6-Well-Gewebekulturplatten in Wachstumsmedium (DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin). Inkubieren in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 bis 80 Zellen erreicht haben - 100% Konfluenz. </li><li> Infect Zellen mit MP-12 mit einer MOI von 3. Mindestens zwei nicht-infizierten Vertiefungen: eine der beiden Bohrungen als nicht infizierte Kontrolle dienen soll, wird die andere mit ActD in Schritt behandelt werden5.4. Entfernen Wachstumsmedium und verdünnen das Virus Lager, so dass das Gesamtvolumen in jede Vertiefung gegeben ist 400 ul. Inkubation für 1 Stunde in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Entfernen Inokulum und 2 ml frisches Wachstumsmedium pro Vertiefung. Bei 37 ° C für 12 Stunden. </li></ol> Hinweis: Falls die Anpassung dieses Protokoll für die Verwendung mit einem anderen Virus, ist es ratsam, einen Zeitverlauf Experiment, um den optimalen Zeitpunkt für die Kennzeichnung und Ernte bestimmen durchzuführen. Richten Sie diese Zeit natürlich so, dass die Infektion Zeiten gestaffelt sind und alle Proben können markiert, geerntet werden, und gefärbt in der gleichen Zeit. <ol start="4"><li> Bei 12 hpi, ersetzen Wachstumsmedium mit Medium mit 0,5 mM EU. Um eines der mock infizierten Brunnen, auch die 5 ug / ml ActD. Dies wird als Quelle für die transkriptionelle Unterdrückung dienen, wie ActD hemmt die DNA-abhängige RNA-Synthese. Zurück Zellen in den Inkubator. </li><li> Mit 13 hpi, waschen Sie die Zellen einmal with PBS und Ernte durch Trypsinisierung von Zellen. Waschen geernteten Zellen dreimal mit PBS, enthaltend 1 mM EDTA (PBS-EDTA). </li></ol> Hinweis: Bei dieser und den folgenden Schritten, nicht schleudern Zellen schneller als 500 - 1.000 xg zu Zelle Bruch zu verhindern. Zentrifuge Zellen für 1 - 2 min zur Sedimentation. Hinweis: Wenn eine Oberfläche Immunfärbung wird nach dem Klick-Reaktion, Ernte mit einem Gummi-oder Einmalhandschuhe Polizist Zellenabstreifer statt geplant. <ol start="6"><li> Fix Zellen durch Resuspendieren in 1 ml 4% PFA und Inkubation für 30 min bei RT. Siehe 1.6 für Anleitungen zum 4% PFA vorzubereiten Schritt. </li><li> Waschen einmal mit 1 ml PBS-EDTA pro Vertiefung. Fahren Sie direkt mit Schritt 6 fort. </li></ol> Hinweis: Es ist wichtig, um sofort mit dem Klick-Reaktion gehen, da die RNA degeneriert, wenn in dieser Phase für längere Zeit gehalten. Und falls der Durchführung einer Zeit course Experiment, achten Sie darauf, zu beschriften, zu fixieren und färben alle Proben gleichzeitig. 6. Klicken Reaktion auf markierten RNA-Erkennung <ol><li> Durchdringbar Zellen durch Resuspension in 0,5 ml 0,2% Triton X-100 in PBS. Inkubieren für 10 min bei RT. </li></ol> Hinweis: Alle Lösungen in den Schritten 6.1 bis 6.3 müssen nucleasefreiem sein. Hinweis: Wenn Zellen nicht richtig Sediment während diesem Schritt erhöhen die Zentrifugationszeit bis 5 min. Sedimentationsverhalten einmal Zellen zu verbessern sind in FACS-Puffer (Schritt 6.4) suspendiert. <ol start="2"><li> Waschen Sie einmal mit 1 ml PBS. </li></ol> Hinweis: Verwenden Sie keine EDTA in diesem Schritt, da dies die Cu 2 +-Ionen, die für die Klick-Reaktion chelatisieren wird. <ol start="3"><li> Die Zellen in 200 ul Klick Färbelösung (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO 4, 200 nM Azid mit Fluoreszenzfarbstoff [exkl. beschriftetitation / Emissionsmaximum: 650/665 nm], 100 mM Ascorbinsäure). Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln. </li></ol> Hinweis: Bereiten Sie das Click Färbelösung frisch unmittelbar vor diesem Schritt. Stammlösungen von 1,5 M Tris, pH 8,5, 100 mM CuSO 4 und 500 mM Ascorbinsäure bei 4 ° C gelagert werden Allerdings verwerfen jede Ascorbinsäure stock Lösung, die gelb geworden ist. Hinweis: Wenn Zellen verklumpen bei diesem Schritt, durch Auf-und Abpipettieren mehrmals resuspendieren. Hinweis: Achten Sie darauf, ein Fluorophor, die von Ihrem Durchflusszytometer detektiert werden kann wählen. Hinweis: Daneben werden eine Probe der infizierten Zellen, die nicht mit dem Klick Färbeverfahren unterworfen werden, diese werden für die Kalibrierung des Durchflusszytometers erforderlich. Verwenden Sie entweder die Hälfte der infizierten Zellen oder eine zusätzliche gut bei Schritt 5.2 infiziert. Diese control-Zellen wird in Schritt 7.1 immungefärbt werden. <ol start="4"><li> Waschen zweimal mit FACS-Puffer (PBS, enthaltend 1 mM EDTA und 0,5% (w / v) BSA). </li></ol> Hinweis: Wenn keine Immunfärbung von viralen Proteinen gewünscht wird, Zellen analysiert werden sofort (Schritt 8 fortfahren). 7. Immunfluoreszenz zu Expression viraler Proteine ​​erkennen <ol><li> Die Zellen in 200 ul primären Antikörper (anti-RVFV) in FACS-Puffer (1:10.000) verdünnt und Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln. </li></ol> Hinweis: Alternativ kann dieser Schritt O / N bei 4 ° C durchgeführt werden, in der Dunkelheit. Hinweis: Auch Vorbereitung einer Probe von nicht infizierten Zellen, die an der Klick-Färbung unterzogen wurden aber nicht immungefärbt werden, werden diese für die Kalibrierung des Durchflusszytometers benötigt werden. Verwenden Sie entweder die Hälfte der Mock-infizierten Zellen oder eine zusätzliche nicht-infizierten und anSchritt 5.2. Hinweis: Bei der Anpassung dieses Protokoll für die Verwendung mit einem anderen Virus, bestimmen die optimale Verdünnung für Ihre primäre Antikörper zuerst. <ol start="2"><li> Waschen Sie die Zellen zweimal in FACS-Puffer. </li><li> Die Zellen in 200 ul sekundären Antikörper (anti-Maus-IgG konjugiert mit Fluoreszenzfarbstoff [Anregung / Emission maximal: 495/519 nm]), verdünnt in FACS-Puffer (1:1000) und Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Zellen einmal in FACS-Puffer. </li></ol> Hinweis: An dieser Stelle können Zellen O / N bei 4 ° C gelagert werden in der Dunkelheit. 8. Erfassung von Daten <ol><li> Die Zellen in 500 ul FACS-Puffer, Transfer in 5 ml Polystyrol-Röhrchen und Analyse mit einem Durchflusszytometer. Verwenden MP-12 infizierten Zellen (kein Klick-Reaktion, Anti-RVFV Färbung nur) und Mock-infizierten Zellen (klicken Reaktion nur), um das Gerät zu kalibrieren. </li></ol> Nichte: Achten Sie darauf, geeignete Fluorophore, die von Ihrem Gerät erkannt werden kann wählen. Zum Vergleich sind die folgenden die Laserlinien und Filter-Sets verwendet, um die Daten in dieser Veröffentlichung gezeigt erwerben. Fluorophor mit einer Anregung / Emissionsspektrum 495/519: Laser: 488 nm Filter: 530/30 Fluorophor mit einer Anregung / Emissionsspektrum 650/665: Laser: 640 nm Filter: 670/20

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die bereitgestellte Protokoll beschreibt ein Verfahren, um die Wirkung der viralen Infektion Wirtszelle die Transkription durch den Einbau des Uridin analoge EU in naszierenden RNA zu messen. Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber früheren Verfahren: schnell, empfindlich, und es muss nicht auf die Verwendung von radioaktiven Isotopen verlassen. Darüber hinaus kann das Verfahren angepasst ist, um qualitative Daten durch Fluoreszenzmikroskopie oder quantitative Daten über Durchflusszytometrie unter Verwendung...

<html> Traditionell wurde Transkriptionsaktivität durch Einbau von entweder radioaktiv (3 H-Uridin) 1 gemessen worden oder halogenierte (BRU) 2 Nukleoside in entstehenden RNA. Diese Uridin Analoga werden von Zellen aufgenommen, umgewandelt in Uridin-Triphosphat (UTP) durch das Nukleosid Salvage Pathway, und anschließend in neu synthetisierte RNA eingebaut. 3 H-Uridin durch Autoradiographie, die sehr zeitaufwändig sein kann, oder Szintillations erkannt werden Zählen, das erfordert spezielle Ausrüstung. Darüber hinaus kann die Verwendung radioaktiver Isotope nicht in einer Reihe von Laboreinrichtungen praktisch, einschließlich High-Containment biologische Sicherheit Laboratorien. BrU durch Immunfärbung mit Anti-Bru Antikörper, die die harten Permeabilisierung erfordern können, um den Zugriff des Antikörpers an den Kern oder teilweise Denaturierung von RNA, wie RNA Sekundärstruktur kann eine sterische Hinderung für die Antikörperbindung zu gewährleisten detektiert werden. _content &quot;&gt; Das hier beschriebene Protokoll nutzt die kürzlich entwickelte klicken Chemie 3 bis transkriptionelle Aktivität in Zellen mit dem RVFV Stamm MP-12 infiziert zu messen. Klicken Chemie beruht auf einer sehr selektiven und effizienten Kupfer (I)-katalysierten Cycloaddition zwischen einem Alkin und einer Azid 4,5. In diesem Protokoll wird naszierenden RNA in infizierten Zellen zuerst durch Einarbeitung des Uridin analoge EU bezeichnet. In einem zweiten Schritt die inkorporierte EU durch Umsetzung mit einem Azid Fluoreszenz detektiert wird. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens sind (1), dass sie nicht die Verwendung von radioaktiven Isotopen und (2), dass es nicht erforderlich harten Permeabilisierung oder Denaturierung von RNA. mit einem Molekulargewicht von weniger als 50 Da der Zugang des fluoreszierenden Azid nicht ausreichend behindert Permeabilisierung oder RNA Sekundärstruktur. Darüber hinaus sind die Forscher nicht in der Wahl ihrer primären Antikörper begrenzt, wenn die Kombination der Detektion von RNA mit einer KlasseiCal Immunfärbung für virale Proteine. Zwei verschiedene Verfahren werden in diesem Protokoll beschrieben: eine für die Visualisierung Transkription über Fluoreszenzmikroskopie (Schritte 1-4) und eine zur Quantifizierung der Transkription durch Durchflusszytometrie (Schritte 5-8). Beide Methoden kombinieren entstehender RNA Markierung mit einem intrazellulären Immunfärbung für virale Proteine, die für eine Korrelation zwischen Transkriptionsaktivität und Virusinfektion einer Zelle-für-Zelle-Basis ermöglicht. Die Autoren haben sich erfolgreich verwendet das Protokoll hier beschriebenen transkriptionellen Aktivität in Zellen mit dem RVFV Stamm MP-12 6 Zellen mit verschiedenen MP-12-Mutanten 7,8, 9, und Zellen mit Toscana-Virus (TOSV) 10 infiziert infiziert zu bestimmen. Die hier beschriebene Protokoll kann leicht für die Verwendung mit verschiedenen Viren angepasst und hat das Potential, modifiziert Immunfluoreszenzfärbung spezifische virale oder zelluläre Proteine ​​umfassen werden.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-uridine</td>
			<td>Berry &amp; Associates</td>
			<td>PY 7563</td>
			<td>dissolve in DMSO for 100 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-mm round coverslips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinomycin D (ActD)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9415</td>
			<td>dissolve in DMSO for 10 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2323</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8027</td>
			<td>dissolve in H2O for 100 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-9542</td>
			<td>dissolve in H2O for 5 mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965092</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10270</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10277</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5960</td>
			<td>dissolve in H2O for 500 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper filter</td>
			<td>VWRbrand</td>
			<td>28333-087</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine (MW &ge; 70000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1274</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8787</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-1503</td>
			<td>dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>e.g. Olympus IX71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using click chemistry to measure the effect of viral infection on host-cell rna synthesis

Viele RNA-Viren haben die Fähigkeit, Transkriptions-Wirtszelle als ein Mittel, um zelluläre Abwehrmechanismen zu umgehen hemmen entwickelt. Zur Untersuchung dieser Viren ist es daher wichtig, eine schnelle und zuverlässige Methode zur Messung der Transkriptionsaktivität in infizierten Zellen. Traditionell wurde die Transkription entweder durch Einbau von radioaktivem Nukleoside wie 3 H-Uridin gemessen gefolgt von einem Nachweis über Autoradiographie oder Szintillationszählung oder Integrieren halogenierten Uridin-Analoga, wie 5-Bromuridin (BRU) durch Detektion mittels Immunfärbung gefolgt. Der Einsatz von radioaktiven Isotopen, erfordert jedoch spezielle Geräte und ist nicht in einer Reihe von Labor-Einstellungen durchführbar, während die Erkennung von BrU kann mühsam sein und können von niedriger Empfindlichkeit leiden. Die neu entwickelte Klick-Chemie, die eine Kupfer-katalysierten Triazol-Bildung aus einem Azid und einem Alkin beinhaltet, bietet jetzt eine schnelle und highly sensitive Alternative zu diesen beiden Methoden. Klick-Chemie ist ein zweistufiger Prozess, in dem im Entstehen begriffenen RNA zunächst durch den Einbau des Uridin analogen 5-Ethinyluridin (EU), durch Detektion der Markierung mit einem fluoreszierenden Azid gefolgt markiert ist. Diese Azide sind als verschiedene Fluorophore, so dass für eine breite Palette von Optionen für die Visualisierung. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Transkription Unterdrückung in Zellen mit dem Rift Valley-Fieber-Virus (RVFV) Stamm MP-12 mit Klick-Chemie infiziert zu messen. Gleichzeitig wird die Expression der viralen Proteine ​​in diesen Zellen durch klassische intrazellulären Immunfärbung bestimmt. Schritte 1 bis 4 ausführlich eine Methode zur Unterdrückung Transkriptions über Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen, während die Schritte 5 bis 8 ausführlich eine Methode zur Unterdrückung Transkriptions via Durchflusszytometrie quantifizieren. Dieses Protokoll ist leicht an die Verwendung mit anderen Viren.

Die NSs Protein RVFV (Familie Bunyaviridae, Gattung Phlebovirus) 11 hemmt Wirtszelle allgemeine Transkription durch zwei verschiedene Mechanismen: (i) durch die Sequestrierung p44 Untereinheit des basalen Transkriptionsfaktor TFIIH 11 und (ii) durch die Förderung der proteasomalen Abbau des p62 Untereinheit TFIIH 6. Der MP-12 RVFV Impfstammes 13 hat für die Experimente in diesem Protokoll beschrieben verwendet, da MP-12-Stamm in einer Sicherheitsstufe 2 Lab...

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Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Dieses Verfahren beschreibt die Verwendung von Klick-Chemie, um Änderungen in Wirtszelle Transkription nach der Infektion zu messen mit dem Rift Valley-Fieber-Virus (RVFV) Stamm MP-12. Die Ergebnisse können qualitativ visualisiert werden über Fluoreszenzmikroskopie oder erhalten quantitativ durch Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ist zur Verwendung mit anderen Viren.

Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K Aufrufe.  University of Texas Medical Branch. Dieses Verfahren beschreibt die Verwendung von Klick-Chemie, um Änderungen in Wirtszelle Transkription nach der Infektion zu messen mit dem Rift Valley-Fieber-Virus (RVFV) Stamm MP-12. Die Ergebnisse können qualitativ visualisiert werden über Fluoreszenzmikroskopie oder erhalten quantitativ durch Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ist zur Verwendung mit anderen Viren.

Serie: Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Isolierung von Fidelity Varianten von RNA-Viren und Charakterisierung von Virus-Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2. Viruses modulate host cell abundance and diversity, contribute to the cycling of nutrients, alter host cell phenotype, and influence the evolution of both host cell and viral communities through the lateral transfer of genes 3. Numerous studies have highlighted the staggering genetic diversity of viruses and their functional potential in a variety of natural environments. 
Metagenomic techniques have been used to study the taxonomic diversity and functional potential of complex viral assemblages whose members contain single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and RNA genotypes 4-9. Current library construction protocols used to study environmental DNA-containing or RNA-containing viruses require an initial nuclease treatment in order to remove nontargeted templates 10. However, a comprehensive understanding of the collective gene complement of the virus community and virus diversity requires knowledge of all members regardless of genome composition. Fractionation of purified nucleic acid subtypes provides an effective mechanism by which to study viral assemblages without sacrificing a subset of the community&#x2019;s genetic signature. 
Hydroxyapatite, a crystalline form of calcium phosphate, has been employed in the separation of nucleic acids, as well as proteins and microbes, since the 1960s11. By exploiting the charge interaction between the positively-charged Ca2+ ions of the hydroxyapatite and the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acid subtypes, it is possible to preferentially elute each nucleic acid subtype independent of the others. We recently employed this strategy to independently fractionate the genomes of ssDNA, dsDNA and RNA-containing viruses in preparation of DNA sequencing 12. Here, we present a method for the fractionation and recovery of ssDNA, dsDNA and RNA viral nucleic acids from mixed viral assemblages using hydroxyapatite chromotography.

We describe an efficient method to separate single-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA molecules from environmental viral communities. Nucleic acids are fractionated using hydroxyapatite chromatography with increasing concentrations of phosphate-containing buffers. This method permits the isolation of all viral nucleic acid types from environmental samples.

Trennung von Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA und RNA aus ökologischer Viral Gemeinschaft mit Hydroxyapatit-Chromatographie

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic applications and vaccine development.1,2,3 Current approaches to modifying viral surfaces, which are mostly genetics-based, often suffer from attenuation of virus production, infectivity and cellular transduction.4,5 Using chemoselective click chemistry, we have developed a straightforward alternative approach which sidesteps these issues while remaining both highly flexible and accessible.1,2
The goal of this protocol is to demonstrate the effectiveness of using bioorthogonal click chemistry to modify the surface of adenovirus type 5 particles. This two-step process can be used both therapeutically1 or analytically,2,6 as it allows for chemoselective ligation of targeting molecules, dyes or other molecules of interest onto proteins pre-labeled with azide tags. The three major advantages of this method are that (1) metabolic labeling demonstrates little to no impact on viral fitness,1,7 (2) a wide array of effector ligands can be utilized, and (3) it is remarkably fast, reliable and easy to access.1,2,7
In the first step of this procedure, adenovirus particles are produced bearing either azidohomoalanine (Aha, a methionine surrogate) or the unnatural sugar O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), both of which contain the azide (-N3) functional group. After purification of the azide-modified virus particles, an alkyne probe containing the fluorescent TAMRA moiety is ligated in a chemoselective manner to the pre-labeled proteins or glycoproteins. Finally, an SDS-PAGE analysis is performed to demonstrate the successful ligation of the probe onto the viral capsid proteins. Aha incorporation is shown to label all viral capsid proteins (Hexon, Penton and Fiber), while O-GlcNAz incorporation results in labeling of Fiber only.
In this evolving field, multiple methods for azide-alkyne ligation have been successfully developed; however only the two we have found to be most convenient are demonstrated herein &#x2013; strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) and copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosphere.

Adenovirus particles are engineered to contain either the unnatural amino acid analogue azidohomoalanine or the azido sugar O-GlcNAz. The azide group of each is chemoselectively ligated via "click" chemistry reactions as a means of viral surface modification.

Chemoselektive Modifizierung von Oberflächen durch Viral Bioorthogonale Click-Chemie

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Recently there were several publications on the bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of the spectrum (400 nm-500 nm) is responsible for killing various pathogens1-5. The phototoxic effect of blue light was suggested to be a result of light-induced reactive oxygen species (ROS) formation by endogenous bacterial photosensitizers which mostly absorb light in the blue region4,6,7. There are also reports of biocidal effect of red and near infra red8 as well as green light9.
In the present study, we developed a method that allowed us to characterize the effect of high power green (wavelength of 532 nm) continuous (CW) and pulsed Q-switched (Q-S) light on Pseudomonas aeruginosa. Using this method we also studied the effect of green light combined with antibiotic treatment (gentamycin) on the bacteria viability. P. aeruginosa is a common noscomial opportunistic pathogen causing various diseases. The strain is fairly resistant to various antibiotics and contains many predicted AcrB/Mex-type RND multidrug efflux systems10.
The method utilized free-living stationary phase Gram-negative bacteria (P. aeruginosa strain PAO1), grown in Luria Broth (LB) medium exposed to Q-switched and/or CW lasers with and without the addition of the antibiotic gentamycin. Cell viability was determined at different time points. The obtained results showed that laser treatment alone did not reduce cell viability compared to untreated control and that gentamycin treatment alone only resulted in a 0.5 log reduction in the viable count for P. aeruginosa. The combined laser and gentamycin treatment, however, resulted in a synergistic effect and the viability of P. aeruginosa was reduced by 8 log's.
The proposed method can further be implemented via the development of catheter like device capable of injecting an antibiotic solution into the infected organ while simultaneously illuminating the area with light.

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

We show that a developed biomedical device involving continuous or pulsed visible laser based treatment that is combined with antibiotic treatment (gentamycin), results in a statistically significant synergistic effect leading to a reduction in the viability of P. aeruginosa PAO1, by 8 log's compared to antibiotic treatment alone.

Die synergistische Wirkung von sichtbarem Licht und Gentamycin auf<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Mikroorganismen

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Verwendung des Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterielle Produktion und die Sensibilität für Pneumokokken Bacteriocine

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapsid Glühen-vermittelte Elektrophorese (NAME) Assay ermöglicht die schnelle Identifizierung von HIV-1-Inhibitoren Nucleocapsid

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab Sampling Verfahren zum Nachweis von humanem Norovirus auf Oberflächen

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...