Diese Arbeit wurde von der Intramural Research Program des National Institutes of Health, NINDS unterstützt. Die Autoren möchten sich bei allen Mitgliedern des Labors für Molekulare Medizin und Neurowissenschaften, Rick Dreyfuss für die Hilfe bei Mikroskopie und Pamela C. Sieben für die Hilfe bei der Bearbeitung danken.

Anmerkung: Für routinemäßige Kultivieren der neuralen Vorläuferzellen und oligodendrocytic Abstammungslinie Zellen, Inkubation bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2-Atmosphäre durchgeführt. Alle 2 Tage, wird das Medium ausgetauscht Verwendung von 50 bis 100% des frischen Mediums ist, wenn die Kultur 40 bis 70% konfluent. Zum Zeitpunkt der Nähe der Konfluenz werden die Kulturen bei 2-2.5e6/T75 Kolben normalerweise auf einem Wochenprogramm passagiert. Ein. Herstellung des beschichteten Flask <ol><li> Zur Vorbereitung beschichteten Kolben zu verdünnen 5 mg Poly-D-Lysin (PDL) in 100 ml deionisiertem Wasser (DI-Wasser), dann Mantel T75-Flaschen mit 50 ug / ml PDL bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln. Nach 1 ½ Std. absaugen PDL und spülen Sie die Flaschen einmal mit DI-Wasser. Lassen Sie die Flaschen trocken vor der Aussaat der Zellen (Tabelle 1). </li></ol> 2. Ab Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen in Progenitor-derived Oligodendrozyten (PDO) Das Protokoll istOlate menschlichen ZNS Vorläuferzellen in einer früheren Publikation beschrieben, und es ist nicht Bestandteil dieses Protokolls 1. Menschlichen ZNS Vorläuferzellen wurden aus dem Telencephalon eines 8-Schwangerschaftswoche fötalem Gehirn, in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien erhalten wurde, isoliert. <ol><li> Wachsen multipotenten Population von neuralen Vorläuferzellen auf PDL beschichteten Flaschen in Neurobasalmedium mit 25 ng / ml bFGF und 20 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) (Abbildung 1A) ergänzt. Verwenden Sie sie nicht, wenn höher als Durchgang 11 (p11). </li><li> Start, um die neuronalen Vorläuferzellen zu unterscheiden, wenn die Kultur von etwa 70% konfluent. </li><li> Make vollständige Differenzierung Oligodendrozyten Medium mit serumfreien DMEM / Hams F12-Medium mit 1.01 Rinderserumalbumin, L-Glutamin, Gentamicin, N2 Komponenten, T3, Shh, NT-3, bFGF und PDGF-AA (Tabelle 1) ergänzt . Dieses Medium wird als Oligo-Medium mit Wachstumsfaktoren (Oligo mittel + GF) definiert werden. </li><li> Entfernen progenitor Medien aus den Flaschen spülen Zellen einmal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), dann fügen Oligo mittel + GF (Details unter 2.3 beschrieben) zu Oligodendrozyten Differenzierung beginnen. Nur Zellen, die sich für die oligodendrocytic Linie wachsen wird (Abbildung 1B). Kultur der Zellen in diesem Medium für 3 Wochen. </li><li> Jede Woche, wenn die Zellen bei 90-95% Konfluenz mit Trypsin ihnen Durchgang (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml für eine T75-Flasche). Übertragen das Medium von den Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen passagiert werden, dies konditionierte Medium wird verwendet, um das Trypsin zu quenchen werden. Achten Sie darauf, nicht zu trocknen die Zellen. Dann fügen Trypsin. </li><li> Inkubieren Zellen in Trypsin für 5 min bei RT, leichtes Antippen der Kolben mehrmals Zellablösung helfen. </li><li> Quench das Trypsin durch Zugabe von 4-5 ml des konditionierten Mediums in den Kolben mit den abgelösten Zellen. </li><li> Übertragen des Mediums und die Zellen auf den gleichen 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge das Medium und die Zellen bei 1.200 rpm (~300 xg) für 5 min bei RT. </li><li> Überstand, Zellpellet vorsichtig Kippen der Röhre, und fügen Sie dann frische Oligo mittel + GF. Gently Pipette und Zellen nach oben und unten, um eine einheitliche Zellsuspension. </li><li> Zählen Sie die Zellen, und die Übertragung 2.5e6 in jede neue PDL-beschichteten T75-Flasche. </li></ol> 3. Letzter Schritt in der Differenzierung von Oligodendrozyten <ol><li> Nach 3 Wochen der Kultur in Oligo-Medium + GF, wenn die Zellen bei 70-80% Konfluenz sind, starten Sie den abschließenden Prozess der Differenzierung (Abbildung 1C). </li><li> Planen Medium in der gleichen Weise wie die Oligo-Medium + GF, aber ohne Zugabe der vier GF: Shh, NT-3, bFGF und PDGF-AA. GF - Dieses Medium ohne die vier GF wird als Oligo Medium definiert werden. </li><li> Saugen Sie die Oligo-Medium + GF aus der Flasche, einmal mit PBS spülen und fügen Sie dann ein Gesamtvolumen von 16 ml des Mediums, von denen ¾ (12 ml) Oligo Medium - GF und ¼ (4 ml) ist PDN konditioniertes Medium für 6-10 Tage). Die Verwendung von konditioniertem Medium aus PDN ist nicht kritisch für die Differenzierung oder das Überleben der Zellen. Wir tatsächlich beobachtet, dass nur direkten Kontakt mit PDO PDN Zellen in Co-Kultur-Experimente eine Wirkung auf die Länge der PDO Überleben hatte. Die Überlebenszeit in Oligo Medium - GF könnten auf zwei oder drei Wochen verlängert werden, wenn die Zellen mit PDO PDN Zellen co-kultiviert. Das Protokoll für die menschliche neurale Vorläuferzellen in PDN zu differenzieren ist in einer früheren Publikation beschrieben, und es ist nicht Bestandteil dieses Protokolls 1. Wachstumsfaktorentzug aus dem Kulturmedium führt fortschreitend differenziert Kultur von Zellen mit mehreren Prozessen (1D). </li></ol> 4. Durchflusszytometrie Assay Die Durchflusszytometrie-Assay vergleicht den Erwerb von Oligodendrozyten Marker während der Differenzierung in der Beziehung mit denen ihrer Eltern Bevölkerung. <ol><li> Verwenden neuronalen progenitors als Kontrolle. Saatgut PDO Zellen bei 2.5x10 6 Zellen in zwei T75-Flaschen, beschichtet mit Poly-D-Lysin in Oligo-Medium + GF. </li><li> Eine Woche später, ersetzen Medium mit frischem Oligo mittel + GF in Flaschen als Kontrolle Kultur für die Lebensfähigkeit der Zellen, während andere Flaschen hatten Oligo mittel - GF. </li><li> Um PDO-Zellen in beiden Medien distanzieren verwenden 20 U / ml Papain und nicht Trypsin. Dies liegt daran, Papain eine sanftere Wirkung auf die Zellen während der Dissoziation die Erhaltung der zellulären Morphologie. </li><li> 5 ml Balanced Salt Earle-Lösung (EBSS) zu einem Papain Fläschchen. Die Küvette bei 37 ° C für 10 min oder bis das Papain vollständig gelöst und die Lösung klar erscheint. Dies ist der Papain-Lösung verwendet, um die Zellen zu dissoziieren. </li><li> 0,5 ml EBSS einem Deoxyribonuclease I (DNase) Fläschchen (Tabelle 1). Vorsichtig mischen. 0,25 ml dieser Lösung in der Durchstechflasche gelöst Papain. Diese Zubereitung enthält eine Endkonzentration von etwa 20 E / ml und 0 Papain0,005% DNase. </li><li> Ort Papain-Lösung (wie oben beschrieben) auf die Zellen und Inkubation bei 37 ° C für 15-30 min; überwachen die Ablösung der Zellen mit einem Mikroskop. Stoppen der Reaktion mit 5 ml Medium mit oder ohne GF und Zentrifuge bei 1.200 rpm für 7 min. </li><li> Übertragen Zellpellets aus beiden Kolben in zwei unterschiedlichen 5 ml Polypropylen-Röhrchen und waschen Sie sie mit normalen physiologischen Medium (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 10 mM Hepes und 10 mM Glucose) mit 1 mg / ml ergänzt Rinderserumalbumin (NPM + BSA). </li><li> Führen Oberfläche Immunfärbung bei 4 ° C für 20 min unter Verwendung von spezifischen und entsprechend titriert Primärantikörper für A2B5, O4, GalC (Tabelle 2). </li><li> Waschen der Zellen mit NPM + BSA bei 4 ° C für 5 min und Inkubation mit spezifischen Sekundärantikörper bei 4 ° C für 20 min (Tabelle 2). </li><li> Um intrazelluläre Antigene einschließlich Nestin, saure Gliafaserprotein (GFAP), Klasse III &amp; sein färbenta;-Tubulin und basischem Myelinprotein (MBP) (Tabelle 2), zu fixieren die Zellen in 2% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei RT und permeabilisieren mit kaltem 70% igem Ethanol 15 min bei -20 ° C. </li><li> Waschen der Zellen mit 1x PBS und Inkubation mit spezifischen Sekundärantikörper (Tabelle 2). </li><li> Um zwischen intakten Zellen und subzellulären Schmutz während der Durchflusszytometrie diskriminieren, Fleck Zellen mit 4,6-Diamino-2-phenyllindole, Dihydrochlorid (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY). </li><li> Bei der Optimierung des obigen Protokoll, führten wir alle geeigneten Kontrollversuchen um die Spezifität jedes Immunreagenz bestätigen. Kurz gesagt, für direkt markierten Antikörpern, die geeignete Negativkontrolle ein direkt konjugierten Antikörper des gleichen Isotyps Immunglobulin-Klasse (oder Unterklasse) und Fluorochrom-Konjugat als primärer Antikörper (dh die Isotyp-Kontrolle). Für indirekte Immunfärbung primärer Antikörper, die entsprechende negative Kontrolle wals sekundärer Antikörper, konjugiert an dem Fluorochrom von Interesse, dass speziell die Immunglobulin-Klasse (oder Unterklasse) von dem Wirt, in dem der primäre Antikörper erzeugt wurde angestrebt. Wenn primäre Antikörper von mehreren Hosts (Maus, Kaninchen, Huhn) zusammen verwendet wurden, nutzten wir die sekundären Antikörper gegen den primären Antikörper jeden Host und jeden sekundären Antikörper verwendet wurde typischerweise gegen die Immunglobuline aus den anderen Hosts-adsorbiert überqueren, um cross-Minimierung Gastgeber Immunreaktivität. Die positiven Kontrollen einbezogen direkten oder indirekten Immunfärbung von Zellpräparaten bekannt, die Antigene von Interesse exprimieren entweder mit direkten oder indirekten Immunreaktionen mit den primären Antikörpern, die spezifisch für diese Antigene. Die obigen Optimierungsmethoden wurden einmal für jeden Typ von Immunfärbung Experimente durchgeführt. Steuerung Immunreaktionen zeigten keine signifikante Cross-Epitop Immunreaktivität unter primären und sekundären Antikörpern. Durchflusszytometrie wurde auf einheitlich durchgeführtsuspendiert fluoreszenzmarkierte Zellen unter Verwendung eines FACVantage SE Zellsortierer (BD Biosciences, San Jose, CA) mit drei Laser, welche Anregungslicht Wellenlängen abgestimmt zu 488 nm, 647 nm bereitzustellen ausgestattet, und eine breite UV (351-364 nm) (Abbildung 2) . </li></ol> 5. Immunofluoreszenzassay Hinweis: Für Immunfluoreszenz Experimenten PDO sind in Oligo-Medium + GF oder Oligo ausplattiert - GF bei 2.5e5 in 6-Well-Platten mit PDL beschichtet. Die Zellen werden in 2% PFA zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Entzug von Wachstumsfaktoren fixiert. Der Antikörper Fleck ist auf Kunststoff-6-Well-Platten anstelle von Deckgläsern durchgeführt. <ol><li> Entfernen Sie das Medium und fügen Sie die 2% PFA. Inkubieren für 10 min bei RT. Entsorgen PFA. Waschen der Zellen 3 mal mit PBS, jeweils 5 min. Seien Sie vorsichtig, nicht zu trocknen die Zellen. </li><li> Permeabilisieren Zellen für intrazelluläre Marker mit 0,25% Triton-Lösung in PBS für 10 min bei RT. </li><li> Um unspezifische Bindung, Block Zellen verhindern foder 10 min mit HHG (1 mM HEPES-Puffer, 2% Pferdeserum und 10% Ziegenserum in balanced salt Hanks-Lösung). Verdünnte spezifischen primären Antikörper (Tabelle 2) zu einer vorbestimmten Konzentration in HHG. Zeigen verdünnte Antikörper auf Zellen. Inkubieren 1 h bei RT auf dem Schüttler oder bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Waschen der Zellen 3 mal mit PBS, für jeweils 5 min. Verdünnte geeigneten sekundären Antikörpern (Tabelle 2) mit einem Fluorochrom zu einer vorbestimmten Konzentration in HHG gekoppelt. Legen Sie die Mischung von verdünntem Sekundärantikörper auf Zellen. Inkubieren 1 h bei RT auf einem Schüttler im Dunkeln. </li><li> Waschen der Zellen 3 mal mit PBS, für jeweils 5 min. </li><li> Um zu vermeiden, Ausbleichen hinzufügen 10 ul verlängern Gold mit DAPI zu den Zellen und setzen Sie ein Deckglas auf sie. Visualisieren Sie markierten Zellen mit einem Axiovert 200M Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Thornwood, NY) (Abbildung 3). </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Ableitung fetaler Oligodendrozyten aus primären humanen neuralen Vorläuferzellen und zu charakterisieren ihren Phänotyp sowohl mit Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz. Der Ausbau und das Wachstum von neuralen Vorläuferzellen aus fetalem ZNS wurde sehr gut 1-4 beschrieben. Allerdings erhalten ausreichende personelle Oligodendrozyten in vitro Experimente bleibt schwierig, obwohl es möglich ist, zu identifizieren und zu isolieren, glialen Vorläuferzellen ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> DME / Hams F12 01.01 </td><td> Omega Scientist </td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Rinderalbumin </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Qualität Biologicals </td><td> 120-098-031 </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Qualität Biologicals </td><td> 118-084-061 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> T3 </td><td> Sigma </td><td> T2877 </td><td> 3 nM </td></tr><tr><td> N2-Komponenten </td><td> Gibco BRL </td><td> 17502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> PeproTech Inc </td><td> 450-03 </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> Shh </td><td> R &amp; D System </td><td> 1314-SH/CF </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-18B </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-13A </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> PDL </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td><td> 50 ug / m </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15712 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Qualität Biologicals </td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td> Papain </td><td> Worthington </td><td> LK003178 </td><td> 20 U / ml </td></tr><tr><td> DNase Vials </td><td> Worthington </td><td> LK003172 </td><td> 0,005% </td></tr><tr><td> EBSS </td><td> Worthington </td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold- mitDAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Reagenzien. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Primäre Abs (alle auf 1 pg / ml) </td><td></td><td> Species Isotyp </td><td> Quelle </td><td> Sekundäre Abs </td></tr><tr><td colspan="5"> Durchflusszytometrie </td></tr><tr><td> A2B5-Biotin </td><td> Maus </td><td> IgM </td><td> Gift J. Nielson </td><td> Streptavidin PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4FITC </td><td> Maus </td><td> IgM </td><td> Geschenk von J. Nielson </td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Maus </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4 </td><td> Maus </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GalC </td><td> Maus </td><td> IgG 3 </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgG 3-PE, Southern Biotech, AL </td></tr><tr><td> MBP </td><td> Huhn </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> Maus </td><td> IgG 1 </td><td> Messam et al. 2000 28 </td><td> gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Kaninchen </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA </td></tr><tr><td> βIII Tubulin </td><td> Maus </td><td> IgG 2 </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2 a-PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td colspan="6"> Immunzytochemie </td></tr><tr><td> βIII Tubulin (1:1,500) </td><td> Maus </td><td> IgG 2a </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2a-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) </td></tr><tr><td> GFAP (1:1,000) </td><td> Kaninchen </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA (1:500) </td></tr><tr><td> MBP (1:50) </td><td> Huhn </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA (1:100) </td></tr><tr><td> O4 (1:100) </td><td> Maus </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1: 100) </td></tr><tr><td> GalC (1:10) </td><td> Kaninchen </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) </td></tr></tbody></table> . Tabelle 2 Antikörper (Abs) für Durchflusszytometrie und Immunzytochemie Assays verwendet Antikörper-Konjugate: PE, Phycoerythrin; PETR, Phycoerythrin Texas Red; AMCA, Amino-methyl-cumarin-acetat; Cy, Cyanin; FITC Fluoresceinisothiocyanat Ig:. Immunglobulin. . AF: Alexa Fluor; gαm: Ziege-Anti-Maus; gαrb: Ziege-Anti-Kaninchen; dαck: Esel-Anti-Huhn. </td></tr></tbody></table>

progenitor-derived oligodendrocyte culture system from human fetal brain

Differenzierung von humanen neuronalen Vorläuferzellen in neuronale und gliale Zelltypen ein Modell zu studieren und Vergleichen molekulare Regulation von neuronalen Zellstammbaums Entwicklung. In vitro Expansion von neuralen Vorläuferzellen aus fötalem ZNS-Gewebe ist gut charakterisiert worden. Trotz der Identifizierung und Isolierung von glialen Vorläuferzellen aus adulten menschlichen subkortikalen weißen Substanz und Entwicklung verschiedener Kulturbedingungen direktem Differenzierung von fötalen neuralen Vorläuferzellen in Myelin Herstellung Oligodendrozyten, Erhaltens ausreichender menschlichen Oligodendrocyten für in vitro Experimente ist weiterhin schwierig. Differenzierung Galactocerebrosid + (GalC) und O4 + Oligodendrozyten-Vorläuferzellen oder Vorläuferzellen (OPC) aus neuralen Vorläuferzellen wurde berichtet, mit zweiten Trimester fetalen Gehirns. Allerdings sind diese Zellen nicht proliferieren in Abwesenheit von Stützzellen einschließlich Astrozyten und Neuronen und schnell über die Zeit in Kultur verloren. Der Bedarf bleibt für eine Kultur-System an Zellen des Oligodendrozyten Linie geeignet für in vitro Experimente erzeugen. Kultur von primären humanen Oligodendrozyten könnte beispielsweise ein nützliches Modell für die Pathogenese von neurotropen Infektionserreger wie das menschliche Polyomavirus, JCV, die in vivo infiziert jene Zellen zu studieren. Diese kultivierten Zellen konnten auch Modelle von anderen demyelinisierenden Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS). Primary, humanen fötalen brain-derived vermehren multipotente neurale Vorläuferzellen in vitro unter Beibehaltung der Fähigkeit, sich in Neuronen (Vorläuferzellen abgeleiteten Neuronen, PDN) und Astrozyten (Vorläuferzellen abgeleitete Astrozyten, PDA) Diese Studie zeigt, dass neuronale Vorläuferzellen induziert werden kann differenzieren durch viele der Stufen oligodendrocytic Linie Entwicklung (Vorläuferzellen abgeleitete Oligodendrozyten, PDO) zu unterscheiden. Wir Kultur neuralen Vorläuferzellen in DMEM-F12 serum-freien Medien unterstütztumgesetzt mit basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA), Sonic Hedgehog (Shh), neurotrophen Faktor 3 (NT-3), N-2 und Trijodthyronin (T3). Die kultivierten Zellen werden bei 2.5e6 Zellen pro 75cm Flaschen etwa alle 7 Tage passagiert. Mit diesen Bedingungen behält die Mehrzahl der Zellen in Kultur eine Morphologie von wenigen Prozessen und Express Marker des Pre-Oligodendrozyten-Zellen, wie A2B5 und O-4 ist. Wenn wir die vier Wachstumsfaktoren (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) entfernen und konditionierten Medien von PDN, beginnen die Zellen zu mehreren Prozesse und Express Marker spezifische Differenzierung der Oligodendrozyten, wie GalC und Myelin erwerben basisches Protein (MBP). Wir führten phänotypischen Charakterisierung mit multicolor Durchflusszytometrie einzigartige Marker der Oligodendrozyten zu identifizieren.

Es ist sehr wichtig, um die Differenzierung von einer 70% -80% konfluente Zellkultur neuralen Vorläuferzellen (1A) zu starten. Viele Zellen sterben nach dem Wechseln des Kulturmediums aus Vorläuferzellen zu Oligo Medium, da es bestimmte Wachstumsfaktoren enthält. Dies zeigt, daß das Wachstum von neuralen Vorläuferzellen nicht zu einem Phänotyp oligodendrocytic begangen wird nicht von dem neuen Medium (1B) gestützt werden. Inkubation in Oligo-Medium + GF für eine Woche in Folge e...

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Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Primary, vermehren humanen fötalen brain-derived, multipotente Vorläuferzellen<em&gt; In vitro</em&gt; Gleichzeitig die Fähigkeit, sich in Neuronen und Astrozyten differenzieren. Diese Arbeit zeigt, dass neuronale Vorläuferzellen induziert werden durch Phasen des oligodendrocytic Linie durch Konditionierung mit ausgewählten Wachstumsfaktoren zu unterscheiden.

Progenitor-abgeleiteten Oligodendrozyten Culture System von Human Fetal Gehirn

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

progenitor-derived-oligodendrocyte-culture-system-from-human-fetal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.8K Aufrufe.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health. Primary, vermehren humanen fötalen brain-derived, multipotente Vorläuferzellen In vitro Gleichzeitig die Fähigkeit, sich in Neuronen und Astrozyten differenzieren. Diese Arbeit zeigt, dass neuronale Vorläuferzellen induziert werden durch Phasen des oligodendrocytic Linie durch Konditionierung mit ausgewählten Wachstumsfaktoren zu unterscheiden.

Serie: Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Generierung von neuralen Stammzellen aus menschlichen Föten Ausrangierte Rindengewebe

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Forschung

Neurowissenschaften

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

Ableitung von Enriched Oligodendrozyten Kulturen und Oligodendrozyten / Neuron myelinisierenden Co-Kulturen von Post-Natal Mausgeweben

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

Ein cGMP-Verfahren zur Erweiterung anwendbar Aggregate von humanen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen oder fetalen Hirngewebe

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Bildgebung des primären Hirnrinde Zellen unter Verwendung einer 2D Kultursystem zu leben

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily accessible. Through this route, mature neurons can be obtained in a matter of a few weeks. Here, we describe a straightforward and rapid one-step protocol to obtain iNs from dermal fibroblasts obtained through biopsy samples from adult human donors. We explain each step of the process, including the maintenance of the dermal fibroblasts, the freezing procedure to build a stock of the cell line, seeding of the cells for reprogramming, as well as the culture conditions during the conversion process. In addition, we describe the preparation of glass coverslips for electrophysiological recordings, long-term coating conditions, and fluorescence activated cell sorting (FACS). We also illustrate examples of the results to be expected. The protocol described here is easy to perform and can be applied to human fibroblasts derived from human skin biopsies from patients with various different diagnoses and ages. This protocol generates a sufficient amount of iNs which can be used for a wide array of biomedical applications, including disease modeling, drug screening, and target validation.

Direct neuronal reprogramming generates neurons that maintain the age of the starting somatic cell. Here, we describe a single vector-based method to generate induced neurons from dermal fibroblasts obtained from adult human donors.

Einfache Erstellung einer High-Yield-Kultur der induzierten Neuronen aus Menschenhaut Erwachsenen Fibroblasten

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials through saltatory conduction. Moreover, an increasing number of reports suggest that oligodendrocytes interact with neurons beyond myelination, notably through the secretion of soluble factors. Here, we present a detailed protocol allowing purification of oligodendroglial lineage cells from glial cell cultures also containing astrocytes and microglial cells. The method relies on overnight shaking at 37 &#176;C, which allows selective detachment of the overlying oligodendroglial cells and microglial cells, and the elimination of microglia by differential adhesion. We then describe the culture of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). We also provide the kinetics of OCM treatment or oligodendrocytes addition to purified hippocampal neurons in co-culture experiments, studying oligodendrocyte-neuron interactions.

Herein, we display an efficient method for the purification of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium that can be used for co-culture experiments.

Generation von Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Konditionierten Mediums für Co-Kultur-Experimente

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Dissektion und Isolierung von murinen Glia aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

Gewinnung menschlicher Mikroglia aus erwachsenem menschlichem Hirngewebe

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

Generierung humaner Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...