Die Ihnen beschriebene MEA 4-AP Spinal Slice Preparation bietet eine Plattform, um die Konnektivität von dorsalen Hornschaltkreisen zu untersuchen und wie diese Netzwerke während der sensorischen Verarbeitung der Wirbelsäule interagieren. Die vorgestellte Methodik ermöglicht es, die Aktivität des dorsalen Hornkreislaufs auf einer makroskopischen regionalen Auflösungsebene zu untersuchen. Dieses Präparat kann als schnelles Screening-Tool verwendet werden, um die Fähigkeit von Verbindungen zu beurteilen, die Signalübertragung in spinalen sensorischen Schaltkreisen zu stören.
Diese Methode hilft, die Lücke in unserem Verständnis zu schließen, wie die Aktivität bestimmter Zelltypen und kleiner Mikroschaltkreise große Populationen von Neuronen beeinflusst, um anschließend die Ausgabe der dorsalen Hornverhaltensreaktionen und letztendlich die Schmerzerfahrung zu beeinflussen. Um zu beginnen, füllen Sie das MEA gut mit Pferdeserum für 30 Minuten. Nachdem Sie das Serum entfernt haben, spülen Sie das MEA fünfmal gründlich mit destilliertem Wasser ab, bis das destillierte Wasser nicht schaumig wird.
Dann füllen Sie den Brunnen mit künstlichem CSF. Nachdem Sie die betäubte Maus enthauptet haben, entfernen Sie die Haut über der Bauchregion, indem Sie einen kleinen Schnitt in der Haut auf Höhe der Hüften machen. Ziehen Sie dann die Haut auf beiden Seiten des Schnitts rostral, bis die gesamte Haut von der Oberseite des Brustkorbs bis zur Oberseite des Beckens entfernt ist, sowohl ventral als auch dorsal.
Nachdem Sie den Körper auf Eis gelegt haben, verwenden Sie einen ventralen Ansatz, um die Wirbelsäule freizulegen, indem Sie die Eingeweide entfernen und die Rippen seitlich zum Brustbein durchschneiden. Entfernen Sie den ventralen Brustkorb, beide Schulterblätter sowie die unteren Gliedmaßen und das Becken. Übertragen Sie die Wirbelsäulen- und Rippenvorbereitung in ein Sezierbad, das eiskaltes Saccharose-Kunstleim enthält.
Stecken Sie alle vier Ecken des Präparats, indem Sie Stifte durch die unteren Rückenmuskeln und die befestigten oberen Rippen legen. Entfernen Sie das gesamte Muskel- und Bindegewebe, das die ventrale Oberfläche der Wirbel mit den Rongeurs überlagert, und identifizieren Sie die Wirbelregion über der lumbo-sakralen Vergrößerung, die ungefähr unter den T12-L2-Wirbelkörpern liegt. Entfernen Sie einen Wirbelkörperkaudal zur lumbo-sakralen Vergrößerungsregion, um auf das Rückenmark zuzugreifen, das auf dem Wirbelkanal sitzt.
Schneiden Sie mit einer gekrümmten Federschere die Wirbelstiele bilateral durch, während Sie den Wirbelkörper rostral anheben und ziehen, um die ventralen und dorsalen Aspekte der Wirbel zu trennen und das Rückenmark freizulegen. Sobald die Wirbelkörper entfernt wurden, um die lumbo-sakrale Vergrößerung zu enthüllen, reinigen Sie vorsichtig die verbleibenden Wurzeln, die das Rückenmark verankern, mit einer Federschere, bis das Nabel frei schwebt. Isolieren Sie das Rückenmark mit rostralen und kaudalen Schnitten oberhalb und unterhalb der lumbo-sakralen Vergrößerung, um die Zielregion des Nabels frei schweben zu lassen.
Für Querschnitte heben und platzieren Sie das lumbo-sakrale Segment auf einer befestigten Route auf einem vorgeschnittenen Polystyrolblock mit einem flachen Kanalschnitt in der Mitte. Verwenden Sie dann Cyanacrylat-Klebstoff, um den Block und die Schnur an der Trennplattform zu befestigen und in das Schneidbad zu legen, das eiskalte Saccharose-Kunst-CSF-Aufschlämmung enthält. Sobald die 300 Mikrometer dicken Scheiben erhalten sind, geben Sie die Scheiben in eine Inkubationskammer mit Luftschnittstelle, die sauerstoffreiches künstliches CSF enthält, und lassen Sie die Scheiben bei Raumtemperatur eine Stunde lang ausgleichen.
Um mit der Aufzeichnung der dorsalen Hornaktivität zu beginnen, übertragen Sie die Scheibe aus dem Inkubator in den MEA-Brunnen mit einer großen Pasteurpipette, die mit künstlichem CSF gefüllt ist, und fügen Sie zusätzliches künstliches CSF hinzu. Verwenden Sie einen feinen Kurzhaarpinsel, um die Scheibe über dem 60-Elektroden-Aufnahme-Array zu positionieren. Legen Sie dann einen gewichteten Hals über das Gewebe, um es an Ort und Stelle zu halten und einen guten Kontakt mit MEA-Elektroden zu fördern.
Platzieren Sie die MEA in der Aufnahmekopfbühne. Überprüfen Sie die Position des Gewebes über den Elektroden mit einem inversen Mikroskop, um zu bestätigen, dass sich so viele Elektroden wie möglich unter dem oberflächlichen DH befinden. Stellen Sie sicher, dass mindestens zwei bis sechs Elektroden die Scheibe nicht berühren. Nachdem Sie die Kamera an das Gerät angeschlossen haben, nehmen Sie ein Referenzbild des Schnitts relativ zum MEA auf, das während der Analyse verwendet werden kann.
Drücken Sie dann in der Aufzeichnungssoftware auf Datenerfassung starten und vergewissern Sie sich, dass alle Elektroden ein klares Signal empfangen. Als nächstes befestigen Sie die Perfusionseinlass- und Auslassleitungen an der MEA, die mit künstlichem CSF gefüllt ist, und schalten Sie das Perfusionssystem ein. Überprüfen Sie die Durchflussrate und stellen Sie sicher, dass der Abfluss ausreicht, um einen Überlauf des Superfusats zu verhindern.
Nachdem Sie das Gewebe fünf Minuten lang ausgeglichen haben, zeichnen Sie die Rohbasisdaten fünf Minuten lang auf. Bewegen Sie die Perfusionseinlassleitung von künstlichem CSF zu einer 4-Aminopyridin-Lösung und warten Sie 12 Minuten, bis die 4-Aminopyridin-induzierte rhythmische Aktivität einen stabilen Zustand erreicht hat. Zeichnen Sie dann fünf Minuten 4-Aminopyridin-induzierter Aktivität auf und bereiten Sie sich auf die nachfolgenden Aufzeichnungen vor, um die Medikamente zu testen oder die Stabilität von 4-Aminopyridin zu überprüfen.
Nach jeder Aufnahmesitzung spülen Sie die Leitungen mit künstlichem CSF. Nachdem Sie das MEA aus dem Kopfstadium entfernt und das Netz und das Gewebe aus dem MEA-Brunnen entfernt haben, spülen Sie das MEA und das Netz mit künstlichem Liquor aus und wiederholen Sie den gesamten Vorgang mit einer neuen Scheibe. Öffnen Sie die Analysesoftware und laden Sie das vorgefertigte Analyselayout.
Öffnen Sie die Datei von Interesse und deaktivieren Sie die Referenzelektrode und alle Elektroden, die als übermäßig laut erachtet werden. Legen Sie das Zeitfenster für die Analyse fest. Wechseln Sie dann zur Registerkarte Cross-Channel-Filter.
Wählen Sie die komplexen Referenz- und Referenzelektroden basierend auf dem aufgenommenen Bild und den während des Experiments gemachten Notizen aus und drücken Sie Erkunden, bevor Sie fortfahren. Wechseln Sie zur Registerkarte EAP-Filter und wenden Sie einen Butterworth-Hochpassfilter zweiter Ordnung an, um LFP-Aktivitäten zu entfernen. Wechseln Sie zur Registerkarte LFP-Filter, und wenden Sie einen Butterworth-Filter zweiter Ordnung an, um EAP-Aktivitäten zu entfernen.
Stellen Sie auf der Registerkarte EAP-Detektor sicher, dass Sie den automatischen Schwellenwert auswählen, die Kontrollkästchen für steigende und fallende Kanten aktivieren und die Totzeit auf drei Millisekunden festlegen. Um positive und negative Schwellenwerte festzulegen, überprüfen Sie die Daten, indem Sie zum Bildschirm des Rohdatenanalysators zurückkehren, die Zeitmarkierung verschieben, zur Registerkarte EAP-Detektor zurückkehren und auf Durchsuchen klicken. Wiederholen Sie den Vorgang, bis der festgelegte Erkennungsschwellenwert EAPs erfasst, ohne Rauschen oder nicht-physiologische Aktivitäten zu erfassen.
Stellen Sie auf der Registerkarte LFP-Detektor sicher, dass Sie den manuellen Schwellenwert auswählen, die Kontrollkästchen für steigende und fallende Kanten aktivieren und die Totzeit auf drei Millisekunden einstellen. Legen Sie den Schwellenwert für eine Elektrode fest und wählen Sie nach Zufriedenheit auf alle anwenden aus, und drücken Sie dann Analyse starten. Die Badanwendung des spannungsgesteuerten Natriumkanalantagonisten Tetrodotoxin beseitigte sowohl die EAP- als auch die LFP-Aktivität und bestätigte die Spike-Abhängigkeit dieser Signale.
Die Stabilität von 4-Aminopyridin-induzierten Aktivitätsparametern wurde für EAP oder LFP charakterisiert. Alle Aktivitätsmerkmale plus die Koinzidenz der Aktivität für LFPs waren stabil, basierend auf der Ähnlichkeit der 4-Aminopyridin-induzierten Aktivität 12 Minuten nach der 4-Aminopyridin-Anwendung und 15 Minuten später. Die EAPs oder LFPs des Features waren durch eine Zunahme der Anzahl der gleichzeitig auftretenden Ereignisse gekennzeichnet, die über mehrere Elektroden hinweg erkannt wurden.
Die Anzahl der verknüpften benachbarten Elektroden und die Stärke der Verbindungen zwischen benachbarten Elektroden und LFPs nach 4-Aminopyridin-Stimulation und dann relative Stabilität. Die Slice-Orientierung ist ein wichtiger Aspekt für In-vitro-Präparate. Die 4-Aminopyridin-Stimulation induzierte eine ähnliche rhythmische Aktivität im SDH, unabhängig von der Schichtorientierung.
Um die Relevanz der 4-Aminopyridin-Aktivierung der DH-Netzwerke weiter zu beleuchten, wurde schließlich eine künstliche CSF-Lösung mit erhöhtem Kalium aufgetragen und gezeigt, dass sie eine ähnliche DH-Reaktion auf die 4-Aminopyridin-Stimulation hervorruft. Schlüsselschritte im Protokoll sind die Gewebevorbereitung und Platzierung von Abschnitten, die sicherstellen, dass das Gewebe durch sorgfältige, aber rechtzeitige Dissektion gesund ist, sowie eine empfindliche optimale Positionierung des Gewebes auf der MEA helfen, qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erzielen.
